高波 陳杰 余宗濤 李文翠 張吉才△

(1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院檢驗科,湖北 十堰 442000；2.泰州市姜堰區(qū)第三人民醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇 姜堰 225500)

?

腦梗死患者M(jìn)THFR基因多態(tài)性檢測的意義

高波1陳杰2余宗濤1李文翠1張吉才1△

(1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院檢驗科,湖北 十堰 442000；2.泰州市姜堰區(qū)第三人民醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇 姜堰 225500)

目的 分析腦梗死患者M(jìn)THFR C677T基因多態(tài)性與勁動脈內(nèi)中膜厚度及外周血中同型半胱氨酸(HCY)水平的關(guān)系。方法 收集腦梗死患者100例，芯片法檢測MTHFR C677T基因多態(tài)性，根據(jù)多態(tài)型結(jié)果分為CC型、CT型、TT型；檢測不同多態(tài)型患者內(nèi)中膜厚度以及外周血中HCY濃度水平。結(jié)果 腦梗死患者中MTHFR C677T 基因CC型、CT型、TT型的檢出頻率分別為19，49，32%； CC型、CT型、TT型患者內(nèi)中膜厚度分別為(0.65±0.13)、(0.91±0.31)、(1.29±0.48)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；CC型、CT型、TT型患者HCY水平分別為(10.03±3.24)、(12.04±2.89)、(14.19±3.03)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 MTHFR C677T基因突變可能是引起高HCY血癥的一個重要遺傳因素，并且可能增加腦梗死患者動脈粥樣斑塊形成的風(fēng)險。

亞甲基四氫葉酸還原酶； 同型半胱氨酸； 腦梗死； 多態(tài)性； 內(nèi)中膜

腦梗死是一種常見的局限性腦組織軟化或壞死疾病，在我國的腦血管疾病中呈逐步增高趨勢。引起腦梗死的危險因素很多，如年齡、肥胖、高血糖以及高血壓等。5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶MTHFR是葉酸代謝過程中的關(guān)鍵酶，在HCY向蛋氨酸轉(zhuǎn)化以及DNA合成過程中發(fā)揮著重要作用。C677T多態(tài)性引起的高同型半胱氨酸血癥可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞激活促凝因子，使機(jī)體處于高凝狀態(tài)，從而促進(jìn)血栓形成。頸動脈內(nèi)中膜(IMT)增厚往往是早期粥樣硬化的一個敏感指標(biāo)[1]。腦梗死的發(fā)病往往帶有不確定性，特別對于沒有明顯癥狀的急性患者。所以對于腦梗死患者來說預(yù)防大于治療。本文通過檢測MTHFR C677T基因的多態(tài)性，從基因多態(tài)性角度分析MTHFR C677T基因突變與高HCY血癥以及內(nèi)中膜厚度之間的關(guān)系，探討基因多態(tài)性在腦梗死發(fā)病過程中的作用，為腦梗死的個體化診治提供一定的理論依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集我院2011年1月至2014年12月門診或住院腦梗死患者100例，其中男性64例，女性36例，平均年齡(61.4±19.1)歲。腦梗死診斷需符合《全國第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會議修訂》的標(biāo)準(zhǔn)，需經(jīng)影像學(xué)CT或MRI診斷確診。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)嚴(yán)重的肝腎功能不全；(2)各種原因?qū)е碌某鲅阅X血管疾??；(3)昏迷病人；(4)后循環(huán)腦梗死患者。所有患者抽取肝素鈉抗凝血3 mL用于HCY 水平的檢查，標(biāo)本采集后離心留取血漿-80 ℃保存?zhèn)溆?，EDTA-K2抗凝血3 mL用于全血基因組DNA提取。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑與儀器 全血DNA提取試劑盒(北京天根)；ND-2000微量核酸定量儀(Thermo公司)；PE7500擴(kuò)增儀(ABI)；AU2700全自動生化儀(貝克曼)；基因芯片儀，芯片識讀儀(上海百傲)；彩色多普勒超聲診斷儀(Vivid7，GE公司，美國)； HCY濃度檢測試劑盒(北京九強(qiáng))。

1.2.2 HCY濃度檢測 HCY在全自動生化分析儀上進(jìn)行檢測，所有試劑均采用配套試劑盒，定標(biāo)后測試，正常參考區(qū)間按照說明書進(jìn)行設(shè)置。

1.2.3 頸動脈IMT厚度測量 所有檢測人員充分暴露頸部，測量部位一般為頸總動脈離分叉處1～2 cm，頸外動脈離分叉處1 cm，頸內(nèi)動脈離分叉處1 cm。正常IMT厚度≤1 mm，頸總動脈膨大≤1.2 mm。判斷標(biāo)準(zhǔn)：將頸總動脈>1 mm，頸總動脈膨大處>1.2 mm并突向管腔內(nèi)，則判斷為粥樣斑塊形成，并詳細(xì)記錄斑塊的基本特征如大小、部位、形態(tài)以及回聲等。

1.2.4 外周血中DNA提取 EDTA抗凝血采集后需按照試劑盒操作說明提取外周血中的全基因組DNA，若不能及時提取應(yīng)4℃保存，一般不宜存放超過1周。提取后的DNA經(jīng)微量核酸定量儀測定其濃度和純度后進(jìn)行PCR擴(kuò)增或者-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 PCR擴(kuò)增 提取后的DNA經(jīng)過PCR擴(kuò)增獲取PCR產(chǎn)物。擴(kuò)增條件為：50 ℃ 5 min；94 ℃ 5 min；94 ℃ 25 s，72 ℃ 25 s，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min。獲取的擴(kuò)增產(chǎn)物需進(jìn)行雜交反應(yīng)或-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 雜交及芯片識讀 對上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交，雜交體系及雜交條件參照說明書進(jìn)行。雜交結(jié)束后將芯片放置于芯片識讀儀中對結(jié)果進(jìn)行掃描判定，根據(jù)所得結(jié)果將所有患者分為CC型、CT型、TT型。

2 結(jié) 果

2.1 所有腦梗死患者M(jìn)THFR C677T基因多態(tài)性分析 100例腦梗死患者中MTHFR C677T 基因CC型、CT型、TT型的檢出頻率分別為19%、49%、32%，等位基因頻率為C43.5%、T56.5%。腦梗死患者不同基因型(CC型、CT型、TT型)的判讀結(jié)果見圖1。

圖1 MTHFR C677T 基因多態(tài)性結(jié)果

2.2 不同基因型患者IMT、HCY濃度的變化 統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，IMT厚度以及HCY濃度均為CC型

表1 不同基因型患者IMT、HCY濃度的變化

注:*P<0.05,△P<0.05。

3 討 論

5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶MTHFR是葉酸代謝過程中的關(guān)鍵酶，在葉酸代謝過程中起到重要作用。MTHFR有多個位點容易發(fā)生突變，其中最常見的基因突變是677位核苷酸突變?yōu)镃C、CT、TT三種。MTHFR 677位點雜合型CT突變和純合型TT突變可以影響到該酶的活性，葉酸濃度降低，蛋氨酸合成減少，進(jìn)而使得HCY淤積過多，產(chǎn)生高HCY血癥。頸動脈的內(nèi)中膜厚度IMT與心腦血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)，通過頸動脈彩超測定IMT厚度是預(yù)防腦梗死的一種簡單有效、無創(chuàng)、方便、經(jīng)濟(jì)的方法。

微陣列技術(shù)就是利用分子雜交原理，使同時被比較的標(biāo)本(用同位素或熒光素標(biāo)記)與微陣列雜交，并包被于芯片上，通過檢測包被芯片雜交信號強(qiáng)度及數(shù)據(jù)處理，用一種直觀圖像反映出基因多態(tài)性

的分型，常常用于遺傳性基因多態(tài)性的分析。本文采用DNA微陣列芯片法檢測腦梗死患者外周血中MTHFR基因多態(tài)性發(fā)現(xiàn)，MTHFR C677T 基因CC型、CT型、TT型的檢出頻率分別為19%，49%，32%，可以很好的檢出MTHFR C677T基因多態(tài)性分型。研究[2]表明CT型、TT型的基因突變可以降低MTHFR的酶活性，導(dǎo)致葉酸代謝途徑障礙。這就使得突變型的腦梗死患者由于MTHFR酶活性的降低導(dǎo)致高HCY血癥，HCY又可以損傷內(nèi)皮細(xì)胞，激活促凝血因子，進(jìn)而促進(jìn)纖溶酶激活物抑制劑的表達(dá)，抑制硫酸肝素的合成，促進(jìn)血小板粘附聚集，使得機(jī)體處于高凝狀態(tài)，導(dǎo)致血栓的形成[3-5]，進(jìn)而增加腦血管疾病發(fā)生的風(fēng)險。而如果通過基因檢測，對于突變型的患者攝入一定劑量的葉酸，早期進(jìn)行葉酸干預(yù)，提高酶活性，同樣可以維持正常的HCY代謝濃度，降低由于高HCY血癥導(dǎo)致的血管損害及并發(fā)癥的發(fā)生。這為腦梗死患者的診治提供了一定的個體化依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)，無論是IMT厚度，還是HCY濃度，均為CC型

[1] 劉芳,楊濟(jì)宜,李建蓉,等.國人頸動脈內(nèi)膜中膜厚度與心血管疾病的相關(guān)性研究[J].中國超聲醫(yī)學(xué)雜志,2003,19(l):30-32.

[2] 李桂華.加強(qiáng)農(nóng)村育齡婦女增補(bǔ)葉酸管理預(yù)防神經(jīng)管缺陷[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報,2013,10(2):119-121.

[3] 李艾帆,張華,范玉佳,等.Hcy與MTHFR C677T基因多態(tài)性與河南漢族腦梗死的關(guān)系[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志,2014,31(6):510-513.

[4] Lyde PD. In anticipation of international stroke trial-3(IST-3)[J].Stroke,2012,43(6):1691-1694.

[5] 陳梅玲,林小慧,李清華,等.動脈粥樣硬化腦梗死患者血清同型半胱氨酸水平及亞甲酸四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性 [J].中國動脈粥樣硬化雜志,2010,18(9):733-736.

[6] 吳慶慶,馬慶輝,梁健球.亞甲基四氫葉酸還原酶C677T基因多態(tài)性對老年高血壓患者頸動脈粥樣斑塊形成的影響[J]．廣東醫(yī)學(xué),2014,,35(3):374-376.

R743.32

B

1000-744X(2016)05-0476-02

2015-06-18)

△通信作者，E-mail：fromzero1121@sina.com