鄧旭 趙躍萍 林琳 康景佳 賈大林△

(1.中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院心內科，遼寧 沈陽 110031；2.武警遼寧省總隊醫(yī)院心內科，遼寧 沈陽 110034)

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瑞舒伐他汀對經缺血再灌注處理的高脂血癥小鼠外周血清氧化相關物質濃度的影響

鄧旭1趙躍萍2林琳2康景佳2賈大林1△

(1.中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院心內科，遼寧 沈陽 110031；2.武警遼寧省總隊醫(yī)院心內科，遼寧 沈陽 110034)

目的 探討瑞舒伐他汀(rosuvastatin)對經缺血再灌注(MI/R)處理后的高脂血癥小鼠外周血氧化相關物質濃度及其心肌細胞凋亡相關基因表達的影響。方法 選取性成熟ICR小鼠60只，隨機分為三組(每組20只)：A組(假手術組)、B組(心肌缺血再灌注模型組)、C組(瑞舒伐他汀組，造模前連續(xù)給予瑞舒伐他汀3 d)，建立心肌缺血再灌注實驗小鼠模型，阻斷左冠脈前降支(ADC)血流30 min后恢復血供。阻斷1 h后測定外周血清中GSH-PX、SOD、ROS、MDA濃度的變化及其前降支供血區(qū)心肌組織Bax與Bcl-2基因mRNA水平的表達。結果 C組小鼠外周血清GSH-PX、SOD活性值低于A組，高于B組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；C組小鼠外周血清ROS、MDA高于A組，低于B組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；C組小鼠心肌組織中Bax基因mRNA水平明顯高于A組，低于B組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；C組小鼠心肌組織中Bcl-2基因mRNA水平明顯低于A組，高于B組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論 瑞舒伐他汀能改善經缺血再灌注后高脂血癥小鼠心肌組織的氧化與抗氧化平衡失調并抑制心肌細胞凋亡。

瑞舒伐他??； 心肌缺血/再灌注； 高脂血癥； GSH-PX； SOD； ROS； MDA； 凋亡

心臟冠狀動脈介入治療后缺血組織發(fā)生的心肌缺血/再灌注損(MI/R)傷一直是介入治療需要解決的問題，MI/R損傷與氧化/抗氧化平衡失調導致的血管內皮損傷有關，而氧化/抗氧化平衡失調加重血管內皮細胞發(fā)生凋亡[1-2]。瑞舒伐他汀(rosuvastatin)是他汀類降脂藥物中的新品種，已經廣泛應用于抑制并延緩動脈粥樣硬化與冠心病的治療，能很好地改善血管內皮功能抑制內皮細胞增生，此外還有一定的調節(jié)免疫、抑制炎性因子的作用[3]，但該藥在MI/R損傷抑制細胞凋亡與調節(jié)免疫方面還需進一步研究，本實驗以合并高脂血癥MI/R損傷ICR小鼠實驗動物模型，并給予瑞舒伐他汀進行干預，進一步研究其具體作用機制。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 60只性成熟ICR小鼠(雌雄各30只)由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，周齡6～8周，28～32g(雌鼠)，30～34 g(雄鼠)，合格證號SCXK-(京)2012-0002。

1.2 藥品與試劑 瑞舒伐他汀為英國阿斯利康公司提供；GSH-PX、SOD、MDA、ROS酶活性檢測試劑盒為南京建成生物技術公司提供；血清TG、TC濃度檢測試劑盒為上海復星長征有限公司提供；Trizol試劑盒為美國Invitrogen公司提供；RT-PCR檢測試劑盒由日本TaKaRa公司提供。

1.3 實驗儀器 生物分光光度計為BioPhotometer型，由德國Eppendorf公司提供；超速低溫離心機為美國Beckman公司提供；UA-265雙光道紫外分光光度計為日本島津公司提供；RT-PCR儀為美國Sigma公司提供。

1.4 實驗動物分組與造模 60只小鼠用隨機數字法分為A、B、C三組，每組均為20只，每籠5只飼養(yǎng)(雌雄分開飼養(yǎng))，飼養(yǎng)溫度控制在20～26 ℃，12 h光照，12 h黑暗，顆粒飼料(高脂飼料)喂養(yǎng)28 d，自由飲水飲食，28 d后開始MI/R損傷動物模型的制備。A組(假手術組)、B組(心肌缺血再灌注模型組)、C組(瑞舒伐他汀組，造模前連續(xù)給予瑞舒伐他汀3 d)。MI/R損傷模型制備：使用異氟烷吸入麻醉法，麻醉后接小動物呼吸機，沿著胸骨左側縱向切開皮膚約1.5 cm，逐層分離表皮、皮下組織、肌肉、肋骨、胸膜(從第4肋間穿透胸膜經膈肌進入胸腔)，擠壓右胸廓，暴露出心臟，分離心包后暴露出左前降支冠脈(anterior descending coronary，ADC)并將其分離，用絲線(6.0)在ADC起始端打一活結，維持30 min后打開結[4]，A組小鼠只穿線不打結，B、C兩組打結，C組造模前3 d連續(xù)給予瑞舒伐他汀(每日空腹灌胃5 mg/kg，用0.9%氯化鈉溶解配成混懸液現用現配)，B、C兩組造模前3 d連續(xù)給予相同體積的0.9%氯化鈉灌胃，閉鎖ADC 30 min，松開后30 min后處死(頸椎脫臼法)小鼠，抽取靜脈血，測定氧化與抗氧化酶，切取心臟左室ADC供血區(qū)檢測凋亡相關基因mRNA水平表達。

1.5 GSH-PX、SOD、ROS酶活性及其MDA濃度測定 抽取1 mL靜脈血，注入玻璃試管中，靜置10 min，以3 000 r/min離心10 min，分離血清在-70 ℃超低溫冰箱內保存待測。按試劑盒說明測定GSH-PX、SOD、ROS活性并檢測MDA含量。所取標本均在1周內測定。

1.6 外周血清TG、TC濃度檢測 抽取的靜脈血保存于10 mL的玻璃試管內，放于高速離心機(3 000 r.min-1)離心5 min后，用微量移液器抽取上層血清1 mL，隨后將血清放入容積為1.5 mL的離心管中，將離心管立即放于-30 ℃冰箱中冷凍保存，檢測時按試劑盒說明分別檢測血清TG、TC濃度，所取標本均在1周內測定。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學數據分析，采用方差分析法分析各組小鼠的外周血清GSH-PX、SOD、ROS、MDA酶活性與心肌組織凋亡相關基因Bax、Bcl-2基因mRNA水平表達情況，分析前先進行方差齊性檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 外周血清氧化/抗氧化酶活性 C組小鼠外周血清GSH-PX、SOD活性值低于A組，高于B組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；C組小鼠外周血清ROS、MDA高于A組，低于B組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，結果見表1。

注:與A組比較，aP<0.05；與B組比較，cP<0.05。

2.2 凋亡相關基因表達情況 C組中Bax基因mRNA水平明顯高于A組(P<0.05)，低于B組(P<0.05)；C組中Bcl-2基因mRNA水平明顯低于A組(P<0.05)，高于B組(P<0.05)；C組中Bax/Bcl-2明顯高于A組(P<0.05)，低于B組(P<0.05)，兩基因mRNA水平表達量間呈負相關性(r=-0.723，P=0.032<0.05)，結果見表2,圖 1。

表2 三組ICR小鼠心肌組織Bax、Bcl-2基因相對 GAPDH基因mRNA水平表達量

注: 與A組比較，aP<0.05；與B組比較，cP<0.05。

圖1 三組ICR小鼠心肌組織Bax、Bcl-2基因相對 GAPDH基因的相對mRNA水平表達量

3 討 論

瑞舒伐他汀商品名為可定，它是羥甲基戊二酰輔酶A(hydroxy-methy1-glutaryl coenzyme A，HMG-CoA)還原酶抑制劑中的一種，流行病學調查[5]顯示該藥物能顯著降低心血管事件的發(fā)生，并能很好地改善心血管功能。可定除了有很好的降低血脂作用外，還有很好的抗血小板聚集、調節(jié)免疫、抗氧化、抗炎作用，這些非降脂作用是目前研究的熱點[3]，S.Atar等[6]研究表明連續(xù)給予瑞舒伐他汀(10 mg/kg) 3 d，隨后造MI/R動物模型，發(fā)現大鼠心肌梗死面積明顯少于未用瑞舒伐他汀組，戴一等[4]研究表明給予瑞舒伐他汀干預治療后外周血心肌組織Tunnel表達量明顯低于對照組。本實驗結果表明，在造模前給予瑞舒伐他汀預處理后可以明顯降低心肌組織的Bax基因mRNA水平表達升高Bcl-2基因mRNA水平表達，說明能很好地抑制心肌細胞凋亡，與戴一等[4]研究結果相同。

合并高脂血癥的患者往往存在外周血的氧化/抗氧化平衡失調，維生素E等抗氧化劑能改善其氧化/抗氧化平衡失調[7]。他汀類降脂藥物有較強的抗氧化作用已經得到了廣泛認可[3]。線粒體是細胞內能量物質生成與儲存的重要場所，對缺氧缺血敏感性高，正常情況下，細胞內部氧化/抗氧化處于平衡狀態(tài)，抗氧化體系(SOD、GSH-PX、維生素E、維生素C及其機體自身的調控技能如脂肪酶、蛋白酶、DNA修復酶等)能清除氧化物質，但是缺血時線粒體不能進行有氧氧化而進行無氧酵解，能量產生減少，再灌注血液突然進入時帶來的氧氣能在蛋白激酶C、髓化過氧化物酶、黃嘌呤氧化酶催化生成活性氧類物質、單線態(tài)氧、過氧化氫和氫過氧基等物質，同時產生大量類脂類物質，大量的ROS、MDA產生，超出了SOD、GSH-PX等酶的清除能力，造成過氧化物質集聚而導致?lián)p傷[8-10]。本實驗結果顯示：C組小鼠外周血清GSH-PX、SOD活性值低于A組，高于B組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；C組小鼠外周血清ROS、MDA高于A組，低于B組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，再次證實了瑞舒伐他汀有著很強的抗氧化活力。其抑制凋亡作用可能與其抗氧化作用有關。

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Effect of Rosuvastatin on concentration of oxidative related substances after myocardial ischemia/reperfusion in mouse with hyperlipemia

DengXu1,ZhaoYueping2,LinLin2,KangJingjia2,JiaDalin1.

1.DepartmentofCardiology,theFirstAffiliatedHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110031,China. 2.DepartmentofCardiology,LiaoningProvincialCorpsHospitalofChinesePeople'sArmedPoliceForces,Shenyang110034,China.

Objective To explore the effect of Rosuvastatin on concentration of oxidative related substances after myocardial ischemia/reperfusion in mouse with hyperlipemia and the expression of apoptosis gene. Methods 60 viripotent female ICR mice were randomly divided into A, B, C three groups, every group included 20 mice which were A group (Sham group, Sodium Chloride injected,n=20), B group (Model group, the model of myocardial ischemia/reperfusion,n=20), and C group (MI/R model after given Rosuvastatin last 3 days,n=20). The model of MI/R was made,reperfusion after blocking the anterior descending coronary for 30 min. After blocking ADC 1 h, and that were detected the oxydic (ROS, MDA) and antioxidative (GSH-PX, SOD) index and the gene of Bax and Bcl-2 in the level of mRNA in the cardiac muscle of ADC blood-supply and the concentration of TG, TC in the serum. Results The activity of GSH-PX, SOD in the C group were lower than A group, higher than B group, and the activity of ROS and concentration of MDA in the C group were higher than A group, lower than B group, and there were statistical significantly differences (P<0.05); The expression of Bax in the level of mRNA in the C group were super than A group, lower than B group, and the expression of Bcl-2 in the level of mRNA in the C group were lower than A group, higher than B group and there were statistical significantly differences (P<0.05). Conclusion Rosuvastatin can improve the unbalance of oxydic and antioxidative after myocardial ischemia/reperfusion in mouse with hyperlipemia and inhibit apoptosis of cardiac muscle.

Rosuvastatin； Myocardial ischemia/reperfusion； Hyperlipemia； GSH-PX； SOD； ROS； MDA； Apoptosis

遼寧省自然科學基金項目(2014021066)

R-332,R541.4

A

1000-744X(2016)05-0453-03

2015-08-01)

△通信作者，E-mail: 736724666@qq.com