謝欣 褚明亮 陳祎 張著學 楊迎春 易韋△ 于燕妮△

(1.貴州醫(yī)科大學，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學附屬人民醫(yī)院，貴州 貴陽 550002)

IMP3、EGFR和P53蛋白在神經膠質瘤組織中的表達

謝欣1褚明亮2陳祎2張著學2楊迎春2易韋2△于燕妮1△

(1.貴州醫(yī)科大學，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學附屬人民醫(yī)院，貴州 貴陽 550002)

目的 檢測IMP3、EGFR、P53蛋白在神經膠質瘤組織中的表達，研究其與患者預后的關系。方法 收集膠質瘤標本185例和20例因腦血管畸形手術切除的正常腦組織，采用免疫組化S-P二步法檢測IMP3、EGFR和P53的表達情況，并結合患者生存時間進行統(tǒng)計學分析。結果 IMP3、EGFR和P53在對照組中表達極低，在膠質瘤組織高級別組中表達水平均明顯高于低級別組。且三者表達呈顯著正相關。單因素及COX多因素模型分析表明，IMP3的表達可作為患者預后的獨立危險因素，EGFR的表達對患者預后存在一定影響，但不可作為預后獨立危險因素。結論 IMP3、EGFR和P53的聯(lián)合檢測可能成為膠質瘤生物標記的新指標，IMP3、EGFR可能成為腦膠質瘤治療的特異靶點。

神經膠質瘤； 免疫組化； 胰島素樣生長因子IImRNA結合蛋白3； 表皮生長因子受體； 抑癌基因P53蛋白

腦神經膠質瘤是顱內常見腫瘤，呈浸潤生長，術后易復發(fā)，目前治療效果較差。胰島素樣生長因子IImRNA 結合蛋白3 ( insulin-like growth factor-II mRNA-binding protein 3，IMP3)是IGF-IImRNA的翻譯激活子，通過上調IGF-IImRNA的翻譯進而促進腫瘤細胞的增生，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[1]。表皮生長因子受體 (epidermal growth factor receptor, EGFR)基因的編碼產物是一種具有酪氨酸激酶(tyrosines kinase,TK)活性的跨膜蛋白受體，在多種惡性腫瘤組織中表達增多,能誘導腫瘤細胞增殖和侵襲[2]。p53為抑癌基因，其基因突變是腦膠質瘤中最常見的基因突變，最終能導致腫瘤的惡性轉化[3]。本實驗旨在通過檢測神經膠質瘤組織中IMP3、EGFR及P53的表達情況，分析三者與膠質瘤病理分級及患者術后生存時間的關系，并探討三者間的關聯(lián)性。

1 資料與方法

1.1 資料與試劑

收集貴州省人民醫(yī)院病理科膠質瘤石蠟組織標本185例，其中男113例，女72例；年齡4～75歲，中位年齡46歲。所有患者術前均未行放、化療。根據2007年WHO中樞神經系統(tǒng)腫瘤分級標準，分為低級別組(Ⅰ-Ⅱ級)85例，高級別組(Ⅲ-Ⅳ級)100例。另取因腦血管畸形手術切除中的非瘤腦組織(白質)20例作為對照組。收集2012-2013年臨床膠質瘤患者臨床資料并進行隨訪，入組標準：膠質瘤初發(fā)病例，診斷明確，臨床資料完整；手術鏡下全切除。排除標準：確診為膠質瘤，同時患有其它系統(tǒng)嚴重疾?。唤M織石蠟標本過小。

主要試劑：兔抗人IMP3多克隆抗體(工作濃度1∶100)、兔抗人EGFR多克隆抗體(工作濃度1∶100)、兔抗人P53多克隆抗體(工作濃度1∶100)，購于北京博奧森生物技術公司。

1.2 儀器與設備

電熱恒溫水溫箱(上海躍進實驗設備有限公司)；Leica RM2135石蠟切片機(德國Leica公司)；低溫冰箱(青島海爾集團)；光學顯微鏡(DM2700 M)(德國Leica公司)；加樣器(日本Nichimate 公司)；玻片及蓋玻片(北京中杉金橋生物技術有限公司)；5810-R型臺式冷凍離心機(德國Eppendorf Germany公司)。

1.3 免疫組化方法

采用免疫組化S-P法，均以PBS代替一抗及探針作為陰性對照，試劑公司提供陽性對照。IMP3和EGFR陽性信號定位在腫瘤細胞胞質內，為棕黃色顆粒；P53陽性表達在細胞核，著色棕黃色；根據著色強度及陽性百分比進行評分：無色為陰性，計0分；淡黃色為弱陽性，計1分；棕黃色為中等陽性，計2分；棕褐色為強陽性，計3分。陽性細胞≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分，兩者相乘為免疫組化半定量評價標準：≤4分為低表達，>4分為高表達。

1.4 隨訪方法

采用電話聯(lián)系方式進行隨訪，截止時間：2015年5月。隨訪內容包括：一般情況；是否復發(fā)及復發(fā)后是否繼續(xù)治療；是否存活，若死亡，具體死亡原因及時間?？偵嫫谟嬎銖幕颊叩谝淮问中g時間開始到隨訪截止日期或患者死亡日期為止。共獲訪65例，其中54例死亡，11例生存。

1.5 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據采用SPSS19.0軟件包進行分析，計數(shù)資料差異性分析采用四格表χ2檢驗及連續(xù)校正和Fisher精確法，關聯(lián)性分析采用Spearman等級相關分析，生存分析采用Kaplan-Meier單因素分析及Cox回歸多因素模型分析。P<0.05示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 IMP3、EGFR、P53蛋白在各組中表達情況

IMP3、EGFR和P53蛋白在20例對照組中表達極低或不表達；在腦神經膠質瘤組織高級別組中的表達率均明顯高于低級別組(χ2=26.673，χ2=18.846，χ2=13.812，P均<0.001)，且陽性表達程度均隨腫瘤級別增高而增高(rs=0.391，rs=0.330，rs=0.284)。見表1、圖1。

注：a連續(xù)校正。

圖1 免疫組化檢測IMP3、EGFR和P53在神經膠質瘤中的表達(×100)

2.2 IMP3、EGFR和P53表達強度間的相關性分析

Spearman相關性分析結果顯示， IMP3、EGFR與P53表達水平皆呈正相關(rs=0.197，rs=0.477，P均<0.01)，且IMP3表達與EGFR表達水平呈顯著正相關(rs=0.374，P<0.001)。見表2。

表1 IMP3、EGFR和P53表達強度間的相關性

2.3 IMP3、EGFR和P53表達對患者生存期的影響

Kaplan-Meier生存分析結果顯示，65例隨訪者中，IMP3和EGFR 高表達的患者總生存時間均低于低表達患者(Log-rank=15.389，Log-rank=4.230，P均<0.05，見圖2a、圖2b)。但P53高表達患者與低表達患者術后生存時間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,見圖2c)。運用多變量Cox比例風險回歸分析影響膠質瘤預后的危險因素，結果顯示膠質瘤組織中IMP3蛋白的表達可作為患者預后的獨立危險因素，雖單因素分析顯示EGFR對患者預后存在影響，但多因素分析顯示其暫不作為膠質瘤預后的獨立危險因素。P53的表達對患者預后無明顯影響。見表3、表4。

βSβWaldχ2RR395．0%CIRRPIMP31．1270．30213．9041．707，5．5823．0870．000EGFR-1．0270．7262．0030．086，1．4850．3580．157P530．9790．7951．5180．561，12．6362．6620．218

表4 Cox回歸自變量賦值情況

3 討 論

IMP3是癌胚mRNA 結合蛋白，為VICKZ 家族[4]成員，在胚胎早期組織中呈高表達，但在成人正常組織中表達極低。在腫瘤發(fā)展中，IMP3是IGF-IImRNA的翻譯激活子，通過上調IGF-IImRNA的翻譯促進腫瘤細胞的增生。IMP3基因編碼產物通過結合目的信使RNA如IGF-2，調控RNA的轉錄及轉錄后控制[5-6]。一方面，具有抗凋亡、使惡變傾向的細胞逃避凋亡而形成腫瘤，另一方面IGF2可通過甲硫氨酸腦啡肽信號傳導系統(tǒng)上調腫瘤細胞中VEGF的表達,促進腫瘤血管的形成[7]。本研究結果顯示，IMP3蛋白的表達隨膠質瘤級別增高而增高(P<0.01)，高級別組表達顯著高于低級別組(P<0.001)。且IMP3蛋白的表達對患者預后有明顯影響，多變量Cox比例風險回歸分析提示，可將其作為預后的獨立監(jiān)測因子。結果均提示IMP3蛋白與腦膠質瘤的發(fā)生發(fā)展和預后密切相關。

EGFR/ErbB-1/HER1是一種具有TK活性的跨膜蛋白受體，其基因位于人第7號染色體短臂，含28個外顯子[8]，包含細胞外配體結合區(qū)、跨膜區(qū)和細胞內激酶區(qū)[9]。目前研究已發(fā)現(xiàn)多條EGFR下游信號傳導分子通路，其主要通路有三條：Ras/Rsf/MEK/MAPK通路、PI3K/PDK1/AKT/mTOR通路和JAK/STAT通路。這三條通路間存在廣泛聯(lián)系，相互影響，構成一個復雜的信號網共同參與到腫瘤的形成中[9]。同時對EGFR與腫瘤的血管生成、高侵襲性及轉移關系的研究[10]發(fā)現(xiàn)，EGFR可通過Ang-1及VEGF等因子水平的調節(jié)影響腫瘤血管生成。本研究結果顯示，EGFR蛋白表達隨膠質瘤級別增高而增高(P<0.01)，高級別組表達顯著高于低級別組(P<0.001)，很好地反映了EGFR的生物學特性?；颊哳A后分析結果顯示，EGFR蛋白的表達對患者預后存在一定影響，但多變量Cox比例風險回歸分析結果暫不支持將其作為膠質瘤的獨立監(jiān)測因子。

P53基因位于染色體17p13.1，屬于抑癌基因，分野生型和突變型兩種，其編碼產物為P53蛋白，是由393個氨基酸組成的53kD的核內磷酸化蛋白[11]。P53基因的突變與多種腫瘤發(fā)生有關[12-13]，穩(wěn)定的突變型P53蛋白可通過免疫組化檢測出。在對兒童膠質瘤研究中一部分檢出了P53基因的突變，且約半數(shù)病例中P53呈顯著表達[14]。也有研究[15-16]顯示膠質母細胞瘤中P53突變率高達35%～60%。本研究結果顯示，P53蛋白表達隨膠質瘤級別增高而增高(P<0.01)，高級別組表達顯著高于低級別組(P<0.001)，患者預后分析顯示，P53蛋白的表達雖對患者預后有一定影響，但暫不可作為預后的獨立危險因素。

本研究結果還顯示，IMP3與EGFR的表達呈顯著正相關，提示在膠質瘤發(fā)展過程中，IMP3與EGFR可能存在一定協(xié)同作用。目前研究發(fā)現(xiàn)，二者均可通過相關通路使血管內皮生長因子(VEGF)表達水平增高，從而促進腫瘤血管生成，進一步為腫瘤生長提供營養(yǎng)，加速腫瘤細胞增殖，形成惡性循環(huán)[7,10]。相關分析還顯示，EGFR與P53表達亦呈顯著正相關，說明二者可能協(xié)同參與了膠質瘤的惡性轉變，這也可能與P53的突變引起EGFR的過表達有關；但還需進一步研究加以明確。同時本研究結果還顯示IMP3表達與P53表達亦呈正相關性，提示三者與膠質瘤的發(fā)展關系非常密切，對三者的聯(lián)合檢測可能對膠質瘤分級提供幫助。

綜上所述，膠質瘤的發(fā)生發(fā)展是一個多步驟多因素相互作用的過程，IMP3、EGFR和P53蛋白的表達其關系密切，三者聯(lián)合檢測可能成為膠質瘤生物標記的新指標，IMP3和EGFR的靶點治療有望成為膠質瘤的有效治療方案。

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Study on the detections of IMP3, EGFR and P53 in glioma and their relationships with the prognosis

XieXin1,ChuMingliang2,ChenYi2,ZhangZhuxue2,YangYingchun2,YiWei2,YuYanni1.

1.GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China. 2.People'sHospitalofGuizhouMedicalUniversity, 550002,Guizhou,China.

Objective To investigate the expressions and clinical significance of IMP3, EGFR and P53 protein in glioma. Methods Expression of IMP3, EGFR and p53 were analyzed by S-P immunohistochemsitry in 185 cases of gliomas and 20 cases of normal brain tissues. Kaplan-Meier and multivariate analysis of Variance was used to analysis the survival rate of patients with gliomas. Results Positive expression rate of IMP3, EGFR and P53 in glioma tissue were higher than those in normal brain tissue. The expression rate of IMP3, EGFR and p53 were positively correlated with the pathologic stage. Meanwhile, there was a significantly positive correlation between IMP3, EGFR and IGF2. Histological grading and expression of IMP3 were the independent risk factors of prognosis of glioma, there was a certain effect on the prognosis of patients for EGFR, but it is not an independent risk factor for prognosis.Conclusions Combined detection of IMP3, EGFR and P53 may be new markers of glioma, and IMP3 and EGFR might be possible novel targets for molecular treatment of gliomas.

Glioma; Immunohistochemistry; IMP3; EGFR; P53

貴州省科技廳基金資助課題 (黔科合字LH[2014]7017號)

R R739.41

A

1000-744X(2016)08-0794-04

2016-06-21)

△通信作者，E-mail：yiwei6252@sina.com(易韋)；gyyxybl2010@163.com(于燕妮)