柴 華，張 浩，畢建威

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)· ·論著·

體外胃癌間質(zhì)成纖維細(xì)胞模型建立和生物學(xué)特性初步研究

柴 華，張 浩，畢建威

目的 采用原代培養(yǎng)胃間質(zhì)成纖維細(xì)胞(human gastric mucosal fibroblasts,HGMF)，構(gòu)建體外胃癌間質(zhì)成纖維細(xì)胞模型，研究其生物學(xué)特性。方法 將調(diào)整培養(yǎng)條件的胃癌細(xì)胞系MKN- 45的培養(yǎng)上清液加入HGMF中培養(yǎng)，使其發(fā)生轉(zhuǎn)化。MTT法檢測(cè)其細(xì)胞增殖，ELISA方法測(cè)定其肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor，HGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor beta 1，TGF-β1)、趨化因子9(chemokine ligand 9，CXCL9)、趨化因子5(chemokine ligand 5，CCL5)的表達(dá)變化，RT-PCR檢測(cè)其端粒酶活性，BSA法檢測(cè)蛋白合成能力。結(jié)果 胃癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液與HGMF共培養(yǎng)可使其發(fā)生轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化HGMF細(xì)胞增殖能力(0.860±0.055)較HGMF(0.639±0.074)增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，HGF、TGF-β1、CCL5和CXCL9表達(dá)增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，端粒酶活性增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，蛋白質(zhì)合成能力增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論 轉(zhuǎn)化成纖維細(xì)胞與親代細(xì)胞相比具有更強(qiáng)的生物學(xué)活性和分裂活性，蛋白質(zhì)合成增強(qiáng)，能表達(dá)和分泌更多的與胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)的生長(zhǎng)因子和趨化因子。

成纖維細(xì)胞；胃癌；轉(zhuǎn)化

胃癌來(lái)源于上皮組織，上皮細(xì)胞與間質(zhì)微環(huán)境相互作用，間質(zhì)細(xì)胞(絕大部分為成纖維細(xì)胞)顯示出活躍的生物學(xué)特性：如調(diào)控胃癌細(xì)胞的增殖信號(hào)新生血管生成，腫瘤發(fā)生與腫瘤細(xì)胞本身的惡性增殖和間質(zhì)之間的相互作用密不可分，腫瘤間質(zhì)在整個(gè)過(guò)程中發(fā)揮了主動(dòng)的作用。成纖維細(xì)胞是腫瘤基質(zhì)成分中主要的細(xì)胞，腫瘤組織結(jié)構(gòu)和功能的動(dòng)態(tài)平衡有賴于該細(xì)胞維持[1]。微環(huán)境對(duì)細(xì)胞成瘤潛能有很大影響，惡性細(xì)胞如果生長(zhǎng)于特定的微環(huán)境中可被誘導(dǎo)保持分化狀態(tài)[2-3]。以往研究認(rèn)為成纖維細(xì)胞能對(duì)來(lái)源于腫瘤細(xì)胞的信號(hào)改變作出應(yīng)答，這種作用是一個(gè)被動(dòng)過(guò)程，而新近的報(bào)道表明腫瘤基質(zhì)細(xì)胞可首先發(fā)生遺傳改變，從而主動(dòng)參與和發(fā)動(dòng)腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展過(guò)程[4]。

胃癌細(xì)胞與其微環(huán)境中的成纖維細(xì)胞關(guān)系密切，一方面胃癌細(xì)胞分泌的功能蛋白可影響周圍成纖維細(xì)胞的生物學(xué)特性，使其發(fā)生惡性改變；另一方面發(fā)生變化的成纖維細(xì)胞通過(guò)旁分泌的方式產(chǎn)生的蛋白也可作用于癌細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和血管形成。兩者相互作用有級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，增加腫瘤的惡性程度，但是目前對(duì)于產(chǎn)生作用的蛋白種類以及作用機(jī)制尚不清楚，本實(shí)驗(yàn)擬建立體外的胃癌成纖維細(xì)胞模型，為篩選差異蛋白提供細(xì)胞基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及材料

原代培養(yǎng)取材由第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院手術(shù)室提供，手術(shù)由長(zhǎng)海醫(yī)院普外科實(shí)施，選取進(jìn)展期胃癌標(biāo)本。標(biāo)本取材通過(guò)長(zhǎng)海醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并簽署知情同意書。DMSO、RPMI-1640、0.25% EDTA-胰蛋白酶、膠原酶I購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；青、鏈霉素購(gòu)自美國(guó)R&D公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Genmed公司；胃癌MKN- 45細(xì)胞株由東方肝膽外科醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室提供；端粒酶活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物；MTT、BCA試劑盒購(gòu)自博光生物；ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自博奧生物；Gentl MACS組織處理機(jī)購(gòu)自美天妮公司。

1.2 研究方法

1.2.1 原代成纖維細(xì)胞培養(yǎng) 酶消化法培養(yǎng)，取材距離癌組織>10 cm以上的正常胃黏膜組織。貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞經(jīng)優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)法純化，免疫組織化學(xué)鑒定[5]。

1.2.2 體外構(gòu)建成纖維細(xì)胞模型 采取共培養(yǎng)法。復(fù)蘇MKN- 45細(xì)胞株，調(diào)整培養(yǎng)液RPMI 1640的FCS濃度為10%，PH值為7.4，培養(yǎng)箱37℃、5%CO2，3 d后吸取上清液，過(guò)濾雜質(zhì)并調(diào)整培養(yǎng)液PH值和血清濃度，-20℃低溫保存。將采集的MKN-45的培養(yǎng)上清液加入細(xì)胞濃度為6×104/ml原代成纖維細(xì)胞中培養(yǎng)至20代，平均每2～3 d傳代1次。細(xì)胞濃度為6×104/ml的原代成纖維細(xì)胞同步培養(yǎng)。

1.2.3 細(xì)胞增殖生長(zhǎng)情況 觀察采用MTT法，ELISA法檢測(cè)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β1)、趨化因子9(CXCL9)、趨化因子5(CCL5)表達(dá)變化，端粒酶活性檢測(cè)采用RT-PCR法，細(xì)胞總蛋白質(zhì)含量檢測(cè)采用BSA法。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)、方差分析。數(shù)據(jù)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 獲取轉(zhuǎn)化HGMF

消化法原代分離出人胃黏膜成纖維細(xì)胞，免疫組化染色結(jié)果為波形絲蛋白(+)，角蛋白(-)和結(jié)蛋白(-)。胃癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液與正常成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)構(gòu)建體外胃癌間質(zhì)成纖維細(xì)胞模型，得到轉(zhuǎn)化HGMF。

2.2 細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)測(cè)定

轉(zhuǎn)化HGMF增殖較HGMF明顯加快，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖1。

注：HGMF：胃間質(zhì)成纖維細(xì)胞圖1 MTT法測(cè)定2種細(xì)胞的OD值

2.3 HGMF和轉(zhuǎn)化HGMF中HGF、TGF-β1、CCL5和CXCL9的表達(dá)

轉(zhuǎn)化HGMF和HGMF培養(yǎng)上清液中HGF、TGF-β1、CCL5和CXCL9的表達(dá)值見表2。

表2 HGMF和轉(zhuǎn)化HGMF中HGF、TGF-β1、CCL5和CXCL9的表達(dá)(pg/L，x±s)

細(xì)胞測(cè)定次數(shù)HGFTGF-β1CCL5CXCL9轉(zhuǎn)化HGMF10426.02±87.83199.85±22.28480.32±121.86277.24±59.64HGMF 10101.37±21.17110.30±17.26267.56±54.36168.81±58.43P值0.00000.00000.00020.0008

注：HGMF：胃間質(zhì)成纖維細(xì)胞，HGF：肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，TGF-β1：肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子-β1，CCL5：趨化因子5，CXCL9：趨化因子9

2.4 端粒酶活性測(cè)定

10次測(cè)定得到的光密度(OD)值見表3。轉(zhuǎn)化HGMF和HGMF分別為0.860±0.055和0.639±0.074，前者明顯增強(qiáng)(t=7.515，P=0.000)。陰性對(duì)照OD=0.015，陽(yáng)性對(duì)照OD=1.29。見表3。

表3 2種細(xì)胞端粒酶活性測(cè)定的OD值

細(xì)胞測(cè)定次數(shù)12345678910轉(zhuǎn)化HGMF0.7850.8210.9430.8750.8030.8050.8940.8870.8550.932HGMF 0.6630.6460.5970.6870.5240.7080.5840.6860.7550.548

注：OD：光密度，HGMF：胃間質(zhì)成纖維細(xì)胞

2.5 細(xì)胞總蛋白測(cè)定

總蛋白檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)液一元線性方程為y=0.697 6x+0.013 5，各濃度與吸光度值相關(guān)值R2=0.988 7，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，吸光度符合標(biāo)準(zhǔn)曲線。在該條件下測(cè)得5×105個(gè)GCAF蛋白濃度明顯高于HGMF，分別為(0.442±0.075) g/L和(0.194±0.020) g/L(t=7.091，P=0.001)。

3 討論

成纖維細(xì)胞是主要的基質(zhì)細(xì)胞成分，也是產(chǎn)生基質(zhì)蛋白的重要場(chǎng)所，支持腫瘤的基質(zhì)形成與腫瘤生長(zhǎng)關(guān)系密切。受腫瘤微環(huán)境影響，成纖維細(xì)胞出現(xiàn)活化異常，改變了原有的調(diào)控狀態(tài)，可影響胃癌細(xì)胞的分裂和侵襲進(jìn)程?；诔衫w維細(xì)胞在胃癌形成和發(fā)展中的重要作用，有學(xué)者提出抗腫瘤基質(zhì)新的治療方向，即靶向成纖維細(xì)胞的策略[6]。有研究表明，腫瘤細(xì)胞與成纖維細(xì)胞合并培養(yǎng)，觀察兩者表型變化情況，可模擬成纖維細(xì)胞活化進(jìn)程[7]。胃癌細(xì)胞系MKN-45是一種侵襲能力較強(qiáng)的胃癌細(xì)胞，能以實(shí)體瘤或腹水瘤形式生長(zhǎng)，因其可分泌功能蛋白對(duì)成纖維細(xì)胞產(chǎn)生作用，促進(jìn)正常成纖維細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化。微生物學(xué)首先引入轉(zhuǎn)化概念，即依賴于新遺傳物質(zhì)攝入的變化，而培養(yǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化是指自發(fā)性的或誘導(dǎo)引起的永久性表型改變。本實(shí)驗(yàn)選擇培養(yǎng)代數(shù)為20代，考慮到成纖維細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性，如果培養(yǎng)代數(shù)過(guò)少，則很難產(chǎn)生轉(zhuǎn)化效應(yīng)，而培養(yǎng)代數(shù)過(guò)長(zhǎng)，即使沒有實(shí)驗(yàn)干預(yù)，連續(xù)培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞也可能自發(fā)性發(fā)生轉(zhuǎn)化。

胃癌細(xì)胞MKN-45培養(yǎng)上清液和人胃粘膜成纖維細(xì)胞共同培養(yǎng)后，促使成纖維細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，在很多方面有異于人胃粘膜成纖維細(xì)胞的活化特征。端粒酶活性升高表明有更多細(xì)胞處于S期，因?yàn)榧?xì)胞在G1/G0期開始表達(dá)端粒酶，S期達(dá)高峰[8]。實(shí)驗(yàn)表明轉(zhuǎn)化HGMF總蛋白量明顯增加，原因是轉(zhuǎn)化細(xì)胞以旁分泌方式分泌功能因子刺激腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[9]。成纖維細(xì)胞是體內(nèi)HGF和TGF-β1的主要合成場(chǎng)所。HGF受體c-Met表達(dá)于上皮細(xì)胞，其信號(hào)通路的失常可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的侵襲性生長(zhǎng)。TGF-β1具有廣泛的生物學(xué)作用，TGF-β1的高水平表達(dá)與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[10]。CXCL9和CCL5是目前已報(bào)道的與胃癌相關(guān)的趨化因子，不僅可自分泌系統(tǒng)直接刺激腫瘤細(xì)胞增殖，也可激活機(jī)體的特殊免疫應(yīng)答，調(diào)控腫瘤血管生成。趨化因子誘導(dǎo)靶細(xì)胞趨化性遷移，參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，微環(huán)境中成纖維旁分泌是趨化因子/受體的一個(gè)重要來(lái)源[11-12]。結(jié)果表明以上與胃癌密切相關(guān)的生長(zhǎng)因子和趨化因子在轉(zhuǎn)化成纖維細(xì)胞上清液中表達(dá)上調(diào)，提示其生物學(xué)特性活躍。

以往研究正常成纖維細(xì)胞和腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞之間的差異需要原代培養(yǎng)出兩種細(xì)胞，難度較大。本實(shí)驗(yàn)用胃癌細(xì)胞MKN-45培養(yǎng)上清液和人胃黏膜成纖維細(xì)胞共同培養(yǎng)并促使后者發(fā)生轉(zhuǎn)化，為進(jìn)一步進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究，篩選出差異蛋白提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

[1] Bhowmick NA, Neilson EG, Moses HL.Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression[J]. Nature, 2004, 432(7015): 332-337. DOI:10.1038/nature03096.

[2] Kenny PA, Bissell MJ. Tumor reversion: correction of malignant behavior by microenvironmental cues[J]. Int J Cancer, 2003, 107(5): 688-695. DOI:10.1002/ijc.11491.

[3] Radisky DC, Bissell MJ. Cancer. Respect thy neighbor[J]. Science, 2004, 303(5659): 775-777. DOI:10.1126/science.1094412.

[4] Waite K A, Eng C. From developmental disorder to heritable cancer: it′s all in the BMP/TGF-βfamily[J]. Nature Rev Genet, 2003, 4(10): 763-773. DOI:10.1038/nrg1178.

[5] 張浩，申曉軍，唐古生，等. 人胃黏膜成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J]. 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志, 2009, 26(5): 610-611. DOI:10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2009.05.024.

[6] Mersmann M, Schmidt A, Rippmann JF, et al. Human antibody derivatives against the fibroblast activation protein for tumor stroma targeting of carcinomas[J]. Int J Cancer, 2001, 92(2): 240-248.

[7] Anderson IC, Mari SE, Broderick RJ, et al. The angiogenic factor interleukin 8 is induced in non-small cell lung cancer/pulmonary fibroblast cocultures[J]. Cancer Res, 2000, 60(2): 269-272.

[8] Holt SE, Wright WE, Shay JW. Regulation of telomerase activity in immortal cell lines[J]. Mol Cell Biol, 1996, 16(6): 2932-2939. DOI:10.1128/mcb.16.6.2932.

[9] Satyamoorthy K, Li G, Vaidya B, et al. Insulin-like growth factor-1 induces survival and growth of biologically early melanoma cells through both the mitogen-activated protein kinase and beta-catenin pathways[J]. Cancer Res, 2001, 61(19): 7318-7324.

[10] Lin Y, Kikuchi S, Obata Y, et al. Serum levels of transforming growth factor beta1 are significantly correlated with venous invasion in patients with gastric cancer+.[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2006, 21(2): 432-437. DOI:10.1111/j.1440-1746.2005.03939.x.

[11] Ohtani H, Jin Z, Takegawa S, et al. Abundant expression of CXCL9 (MIG) by stromal cells that include dendritic cells and accumulation of CXCR3+ T cells in lymphocyte-rich gastric carcinoma[J]. J Pathol, 2009, 217(1): 21-31. DOI:10.1002/path.2448.

[12] Mizukami Y, Kono K, Kawaguchi Y, et al. CCL17 and CCL22 chemokines within tumor microenvironment are related to accumulation of Foxp3+ regulatory T cells in gastric cancer[J]. Int J Cancer, 2008, 122(10): 2286-2293. DOI:10.1002/ijc.23392.

(本文編輯：彭潤(rùn)松)

Establishment of vitro cell model of human gastric mucosal fibroblasts and preliminary exploration of its biological features

Chai Hua, Zhang Hao, Bi Jianwei

(DepartmentofGeneralSurgery,ShanghaiJiangwanHospital，Shanghai200434,China)

Objective To establish vitro cell model of human gastric mucosal fibroblasts (HGMF) in gastric cancer and explore its biological features.MethodsHGMF were cultured with the regulated supernatant of MKN-45 cells, facilitating its transformation. Cell proliferation was detected by MTT assay. The expressions of hepatocyte growth factor(HGF), transforming growth factor beta 1(TGF-β1), chemokine ligand 5 (CCL5)and chemokine ligand 9(CXCL9)were detected by ELISA. The activity of telomerase and the ability to synthesize proteins were detected by RT-PCR and BSA assay respectively.ResultsSupernatant of MKN-45 could induce HGMF transformation. The ability of cell proliferation was enhanced (P<0.05), and the expression levels of HGF, TGF-β1, CCL5 and CXCL9 were also increased (P<0.01). Telomerase activity and the ability to synthesize proteins were also enhanced respectively (P<0.01).ConclusionDetection results suggested that the transformed HGMF seemed to display higher biological activity, as compared with that of the parent cells, with stronger proliferation activity and higher protein synthesis, and the HGMF could express and secrete more growth factor and chemokines associated with the growth of gastric cancer cells.

Fibroblast; Gastric cancer; Transformation

200434 上海，上海市虹口區(qū)江灣醫(yī)院普外科(柴華)；第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院普外科(張浩、畢建威)

畢建威，電子信箱：noflyzone@163.com

R735.2

A

10.3969/j.issn.1009-0754.2016.06.004

2016-08-15)