靳文仙，李艷貞，劉 歡，吳 赟，閻 卉，王成港

(天津藥物研究院，天津 300193)

骨化三醇注射液中甘氨酸含量測定方法研究

靳文仙，李艷貞，劉 歡，吳 赟，閻 卉，王成港*

(天津藥物研究院，天津 300193)

目的：建立HPLC法測定骨化三醇注射液中甘氨酸的含量。方法：采用柱前衍生高效液相色譜法測定，通過實(shí)驗(yàn)篩選出柱前衍生化的最佳反應(yīng)條件。結(jié)果：衍生反應(yīng)的最佳條件為pH 8.04，溫度20～30 ℃，反應(yīng)時間為1.5 min，試劑用量1 ml。含量測定的方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果顯示該方法專屬性好，線性關(guān)系、重復(fù)性、回收率較好。結(jié)論：采用鄰苯二甲醛柱前衍生高效液相色譜法能準(zhǔn)確測定骨化三醇注射液中甘氨酸含量。

高效液相色譜法，柱前衍生，鄰苯二甲醛，甘氨酸，骨化三醇注射液

甘氨酸(Glycine)又名氨基乙酸，常用于注射液中作為pH調(diào)節(jié)劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑等。為保證注射液質(zhì)量，需要嚴(yán)格控制注射液中甘氨酸含量。

目前氨基酸的測定方法主要有柱后衍生離子交換色譜法、柱前衍生高效液相色譜法、陰離子交換色譜法、衍生化氣相色譜法和毛細(xì)管電泳法等[1，2]。其中柱前衍生高效液相色譜法具有分離度高、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)。常用的衍生試劑主要有鄰苯二甲醛、二甲胺基偶氮苯、磺酰氯、氯甲酸、芴基甲酯、2,4-二硝基氟苯(DNFB)等[3，4]。本文采用C18柱，以鄰苯二甲醛(OPA)為柱前衍生化試劑，采用高效液相色譜法，紫外檢測器測定骨化三醇注射液中甘氨酸的含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀(LabAlliance series 1500系統(tǒng)，紫外檢測器，自動進(jìn)樣器)。Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。

2 方法與結(jié)果

2.1 測定方法

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；檢測波長為334 nm；流動相：0.02 mol/L乙酸胺水溶液(pH 5.5)-乙腈(70∶30)；流速1.0 ml/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μl。

2.1.2 溶液配制

2.1.2.1 鄰苯二甲醛反應(yīng)液 稱取0.1 g鄰苯二甲醛置100 ml棕色量瓶中，加1 ml無水乙醇溶解，加入0.2 ml巰基乙醇，用0.2%硼酸鈉水溶液定容，搖勻，避光保存(4 ℃冰箱可保存一周)。

2.1.2.2 磷酸鹽緩沖液 分別配制濃度為1/15 mol/L的磷酸二氫鉀溶液和磷酸氫二鈉溶液。將磷酸氫二鈉溶液和磷酸二氫鉀溶液按1∶99、10∶90、60∶40、95∶5和99∶1比例混合，制備成pH為4.92、5.91、6.98、8.04和8.67的緩沖液。

2.1.2.3 對照品溶液 稱取甘氨酸對照品適量，加水溶解配制成濃度為30 μg/ml的對照品溶液。

2.1.2.4 樣品溶液 精密量取1 ml骨化三醇注射液置10 ml棕色量瓶中，加水定容至刻度。

2.1.3 樣品測定 量取1 ml對照品溶液或供試品溶液置具塞玻璃管中，加入1 ml磷酸鹽緩沖液(pH 8.04)、1 ml鄰苯二甲醛反應(yīng)液，振勻并準(zhǔn)確計時，室溫避光反應(yīng)1.5 min后進(jìn)樣測定，按照外標(biāo)法計算注射液中甘氨酸的含量。理論塔板數(shù)不應(yīng)低于4 000，主峰與其他峰的分離度應(yīng)符合要求。

一是專業(yè)的角度。強(qiáng)調(diào)從財政視角看金融，分析不平衡不充分發(fā)展在財政金融領(lǐng)域的具體表現(xiàn)，找準(zhǔn)監(jiān)管的著力點(diǎn)。將資金流向作為關(guān)鍵變量，規(guī)范引導(dǎo)金融資源有序流動，努力在防范財政風(fēng)險與金融風(fēng)險相互轉(zhuǎn)化的同時，促進(jìn)金融更好服務(wù)實(shí)體經(jīng)濟(jì)。

2.2 衍生條件的選擇 衍生反應(yīng)受反應(yīng)試劑用量、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、溶液pH等條件的影響特別顯著，因此需要嚴(yán)格控制反應(yīng)條件，以保證測定方法的重現(xiàn)性。

2.2.1 衍生時間 甘氨酸與鄰苯二甲醛的衍生物不穩(wěn)定，容易降解。為了確保測定的準(zhǔn)確性、重現(xiàn)性，需要確定二者的反應(yīng)時間。按“2.1.3”項下方法制備衍生反應(yīng)樣品，準(zhǔn)確反應(yīng)0.5、1、1.5、2、3和4 min后測定，以衍生物峰面積作為指標(biāo)，確定最佳反應(yīng)時間。結(jié)果見表1。

表1 衍生時間的考查

由結(jié)果可知，0.5 min時衍生反應(yīng)不完全，峰面積較低，反應(yīng)時間為1和1.5 min時，衍生物峰面積無明顯差異，此后衍生物峰面積降解迅速，因此確定樣品的衍生時間為1.5 min，為保證該測定方法良好的準(zhǔn)確性、重現(xiàn)性，每次衍生時間需要準(zhǔn)確計時。

2.2.2 試劑用量 取3支具塞試管，分別加入1 ml甘氨酸對照品溶液和1 ml磷酸鹽緩沖液(pH 8.04)，再分別加入0.5、1和2 ml 鄰苯二甲醛反應(yīng)液，分別用水補(bǔ)足至4 ml，搖勻并準(zhǔn)確計時，反應(yīng)1.5 min后進(jìn)樣測定，結(jié)果見表2。

表2 反應(yīng)液用量的考查

由表2可知，加入以上不同量的鄰苯二甲醛反應(yīng)液，生成的衍生物峰面積沒有顯著差異，最終選擇鄰苯二甲醛反應(yīng)液的用量為1 ml。

2.2.3 反應(yīng)溫度 將甘氨酸對照品溶液、鄰苯二甲醛反應(yīng)液、磷酸鹽緩沖液提前放置于冰浴中(10 ℃)，在冰浴條件下按“2.1.3”項下方法制備衍生反應(yīng)樣品，準(zhǔn)確反應(yīng)1.5 min后測定。同法考查10、20、30和40 ℃時樣品的反應(yīng)情況。以衍生物峰面積作為指標(biāo)，確定最佳反應(yīng)溫度。結(jié)果見表3。

表3 反應(yīng)溫度的考查

由表3可知，10 ℃時峰面積最小，說明衍生化反應(yīng)速度較慢。由于衍生物不穩(wěn)定，40 ℃時衍生物迅速降解，峰面積下降。反應(yīng)溫度為20～30 ℃時，衍生物峰面積最高，且二者無顯著區(qū)別。因此衍生反應(yīng)可在室溫下進(jìn)行。

2.2.4 溶液pH 取5支具塞試管，分別加入1 ml pH 4.92、5.91、6.98、8.04和8.67的磷酸鹽緩沖液，再各加入1 ml甘氨酸對照品溶液、1 ml鄰苯二甲醛反應(yīng)液，搖勻并準(zhǔn)確計時，反應(yīng)0.5、1、1.5、2、3和4 min后進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果見表4和圖1。

表4 溶液pH值的考查

圖1 溶液pH值的考查

從表4和圖1結(jié)果可知，在酸性條件下，衍生反應(yīng)迅速，但衍生物降解迅速，溶液穩(wěn)定性較差。堿性條件下，衍生反應(yīng)相對緩慢，溶液的穩(wěn)定性較好。因此選擇pH 8.04的緩沖液。

2.3 方法學(xué)考查

2.3.1 專屬性 取流動相、鄰苯二甲醛反應(yīng)溶液，分別直接注入高效液相色譜儀中測定，記錄色譜圖；另取空白輔料溶液、對照品溶液、骨化三醇注射液按“2.1.3”項下方法制備衍生反應(yīng)樣品，進(jìn)樣測定。結(jié)果見圖2，由圖可知，流動相、反應(yīng)溶液、空白輔料均不會干擾甘氨酸的測定，該方法的專屬性良好。

1.甘氨酸

2.3.2 線性關(guān)系考查 稱取25 mg甘氨酸置250 ml量瓶中，加水溶解，定容至刻度。分別取上述溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 ml至10 ml量瓶中，加水定容，制備成濃度為5、10、20、30、40和50 μg/ml的線性溶液。按“2.1.3”項下方法制備衍生反應(yīng)樣品，進(jìn)樣測定，以峰面積和甘氨酸濃度進(jìn)行線性回歸，求得回歸方程為Y=20 120X+2 752.4(r=0.999 8)。結(jié)果表明，在5～50 μg/ml的范圍內(nèi)甘氨酸濃度與峰面積的線性關(guān)系良好。

2.3.3 重現(xiàn)性試驗(yàn) 照“2.1.2.3”項下的方法配制對照品溶液,按“2.1.2.4”項下方法配制6份樣品溶液，分別進(jìn)樣，按照外標(biāo)法計算注射液中甘氨酸含量，結(jié)果RSD為1.27%，重現(xiàn)性良好，符合要求。

2.3.4 回收率試驗(yàn) 稱取甘氨酸適量，加水溶解配制成濃度為300 μg/ml的甘氨酸儲備液。按照處方配制不含甘氨酸的空白輔料注射液，備用。取9只10 ml量瓶，各加入1 ml空白輔料注射液，再分別加入0.5、1.0和1.5 ml甘氨酸儲備液，加去離子水稀釋定容至刻度，搖勻，作為供試品溶液，每個濃度配制3份。按“2.1.3”項下方法制備衍生反應(yīng)樣品，進(jìn)樣測定，采用外標(biāo)法計算回收率，結(jié)果平均回收率為100.1%，RSD為1.85%。見表6。

表6 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.4 含量測定 取20141101、20141102、20141103批樣品，按甘氨酸含量測定方法進(jìn)行測定，結(jié)果見表8。

表8 骨化三醇注射液中甘氨酸含量測定結(jié)果

由表8可知，樣品的甘氨酸含量均符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的要求，即每ml注射液中含甘氨酸的量應(yīng)控制在0.27～0.30 mg。

3 討論

甘氨酸本身在C18柱中沒有保留，無法進(jìn)行色譜分離，并且不能采用紫外檢測器或熒光檢測器直接進(jìn)行測定。經(jīng)OPA衍生后，甘氨酸在β-巰基乙醇等試劑存在下與鄰苯二甲醛迅速反應(yīng)生成的1-硫代-2-烷基異吲哚衍生物，具有紫外吸收，可采用紫外檢測器檢測。這種衍生方法步驟簡單，反應(yīng)迅速，并且剩余試劑不干擾測定。但甘氨酸衍生后的產(chǎn)物穩(wěn)定性差、見光易分解，因此樣品制備過程中需要避光操作，每次臨進(jìn)樣時才加入衍生試劑。

方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明，該方法專屬性好，線性關(guān)系、重復(fù)性、回收率較好。因此，采用OPA柱前衍生高效液相色譜法能準(zhǔn)確測定骨化三醇注射液中甘氨酸含量。并且，液相色譜儀的應(yīng)用廣泛，此方法更易于推廣和應(yīng)用，具有較高的使用價值。

1 丁永勝,牟世芬.氨基酸的分析方法及其應(yīng)用進(jìn)展[J].色譜,2004,22(5):210-215

2 戴紅，張宗才，張新申.氨基酸分析的檢測方法評述[J].皮革科學(xué)與工程,2004,14(3):39-43

3 張琳，平貴臣，于曉明,等. 氯甲酸-9-芴甲酯柱前衍生脂肪胺類化合物的反相高效液相色譜分析[J].現(xiàn)代儀器,2004,10(2):14-16

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Determination of glycine in calcitriol injection

Jin Wenxian, Li Yanzhen, Liu Huan, Wuyun, Yan Hui, Wang Chengang

(Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin 300193)

Objective: To establish a method for determination of glycine in calcitriol injection. Methods: An optimized condition for pre-column derivation of glycine in calcitriol injection was explored and then the derivative of glycerine was quantitatively determined by high performance liquid chromatogrphy. Results: Glycerine was best derivatized with one millimetre at pH 8.04，the reaction temperature of 20～30 ℃ and the reaction time of 1.5 min. The determination method was validated in a good specificity, linearity, reproducibility and recovery. Conclusions: The method can be used for the determination of glycine in calcitriol injection.

IHPLC，pre-column derivatization， o-phthalaldehyde，glycine，calcitriol injection

2016-05-06

*通訊作者：王成港：E-mail：wangcq@tjipr.com。

R927.2

A

1006-5687(2016)04-0019-04