聶曉潔，尹云澤，趙 欣，王守旺

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193； 2.天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司樂仁堂制藥廠，天津 300112)

清心牛黃片中芍藥苷含量測定方法的探索

聶曉潔1，尹云澤2，趙 欣2，王守旺2

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193； 2.天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司樂仁堂制藥廠，天津 300112)

目的：建立HPLC法測定清心牛黃片中芍藥苷的含量。方法：Symmetry C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)；以乙腈-0.1%磷酸水(12∶88)為流動(dòng)相；檢測波長為230 nm；柱溫30 ℃；流速1 ml/min。結(jié)果：芍藥苷在3.312 5～53 μg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(R2=0.999 9)，回收率為96.18%，RSD為0.42%。結(jié)論：建立的含量測定標(biāo)準(zhǔn)可以更有效地控制藥品質(zhì)量。

清心牛黃片，芍藥苷，含量測定，高效液相色譜法

清心牛黃片由白芍、肉桂、阿膠、桔梗、山藥、蒲黃、大豆黃卷、大棗、麥冬、甘草、白蘞、柴胡、黨參、當(dāng)歸、川芎、苦杏仁、防風(fēng)、白術(shù)、干姜、黃芩、茯苓、六神曲、牛黃、雄黃、水牛角濃縮粉、琥珀和冰片等27味藥組成，具有清心化痰、鎮(zhèn)驚祛風(fēng)之功效，主治神志昏亂、言語不清、痰涎壅盛、頭暈?zāi)垦?、中風(fēng)不語、半身不遂。該藥現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑》第十九冊。為提高清心牛黃片的質(zhì)量控制水平，現(xiàn)將其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行提高，建立了白芍中芍藥苷的含量測定方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 E 2695高效液相色譜儀(美國Waters公司)；2489紫外檢測器(美國Waters公司)；Empower 3.0工作站。

1.2 試藥 芍藥苷對照品(批號(hào)110736-201136，中國食品藥品檢定研究院提供，供含量檢測用)；乙腈為色譜純(德國Merk公司)，水為去離子水(娃哈哈純凈水)，其他試劑均為分析純；清心牛黃片樣品(批號(hào)D216011、D216013、D216018、D216022、D216024、D216029,由天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司樂仁堂制藥廠提供)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Symmetry C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)；以乙腈-0.1%磷酸水(12∶88)為流動(dòng)相；檢測波長為230 nm；柱溫30 ℃；流速1 ml/min。理論塔板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取芍藥苷對照品10.88 mg，置于100 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻；從中精密移取5 ml溶液，置于50 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品，除去包衣，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇50 ml，稱定重量，加熱回流60 min，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)重，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 空白對照品溶液的制備 按處方配比，取除白芍以外的其他藥味，按工藝制得片劑[1]，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制得空白對照品溶液。精密吸取對照品、供試品和空白對照溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，色譜圖見圖1。

2.3 線性關(guān)系考查 精密稱取芍藥苷對照品10.6 mg，置于100 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為0.106 mg/ml的對照品溶液。依次稀釋為0.053、0.026 5、0.013 25、0.006 625和0.003 312 5 mg/ml的系列溶液。依次進(jìn)樣10 μl，測定峰面積。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得芍藥苷的回歸方程為Y=13 827 727.13X-2 493.80(R2=0.999 9)，表明芍藥苷在3.312 5～53 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 精密度試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品(批號(hào)D216011)，按照“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備操作，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定樣品中芍藥苷峰面積。測得芍藥苷峰面積平均值為180 216，RSD為0.22%，表明儀器精密度良好。

1.芍藥苷

2.5 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)(批號(hào)D216011)樣品，共6份，按照“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備操作，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，測定每份樣品中芍藥苷含量。測得芍藥苷含量平均值為1.281 1 mg/g，RSD為0.57%，表明重現(xiàn)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批號(hào)(批號(hào)D216011)樣品，按照“2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備操作，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，分別在0、3、6、9、12和15 h進(jìn)樣，測定樣品中芍藥苷峰面積。測得RSD為0.88%，說明15 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定。

2.7 回收率試驗(yàn) 取同一批號(hào)(批號(hào)D216011)樣品，約0.25 g，共6份，精密稱定，分別精密加入芍藥苷對照品(0.065 04 mg/ml，稀乙醇溶解)5 ml和稀乙醇45 ml，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備操作，制得供回收率用的供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，計(jì)算回收率。結(jié)果芍藥苷的平均回收率為96.18%，RSD為0.42%，符合規(guī)定，結(jié)果見表1。

2.8 樣品測定 取該品種6個(gè)批號(hào)的樣品，按照“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備操作，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，測定6批樣品中芍藥苷的含量。每批測定3次，RSD均小于1.0%，結(jié)果見表2。

表1 芍藥苷回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表2 樣品含量測定結(jié)果(n=3)

3 討論

3.1 提取方法的確定

3.1.1 提取溶劑的選擇 參考《中國藥典》2010年版第一部白芍含量測定項(xiàng)[2]的提取溶劑，確定提取溶劑為稀乙醇。

3.1.2 提取方式的選擇 取同一批(批號(hào)D216011)樣品，除去包衣，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇50 ml，稱定重量，以加熱回流或者超聲方式提取30 min，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)重，濾過，取續(xù)濾液。分別測定樣品中芍藥苷含量，結(jié)果表明，樣品經(jīng)加熱回流提取后，供試品溶液中的芍藥苷含量高于超聲提取，故選用加熱回流的提取方式。

3.1.3 溶劑量的選擇 取同一批(批號(hào)D216011)樣品，除去包衣，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，分別精密加入稀乙醇25、50和75 ml，稱定重量，加熱回流30 min，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)重，濾過，取續(xù)濾液。分別測定樣品中芍藥苷含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)提取溶劑量為50 ml的時(shí)候，供試品溶液中的芍藥苷含量最高，故選擇提取溶劑量為50 ml。

3.1.4 提取時(shí)間的選擇 取同一批(批號(hào)D216011)樣品，除去包衣，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇50 ml，稱定重量，分別加熱回流30、60和90 min，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)重，濾過，取續(xù)濾液。分別測定樣品中芍藥苷含量，結(jié)果表明，當(dāng)提取時(shí)間為60 min時(shí)，供試品溶液中芍藥苷的含量最高，故提取時(shí)間確定為60 min。

3.2 含量測定方法的建立 在本品處方中，白芍為君藥，且白芍在《中國藥典》2010年版一部[1]中的含量測定指標(biāo)為芍藥苷，因此選擇芍藥苷為該藥品的定量指標(biāo)。通過對不同提供方式、溶劑量和提取時(shí)間進(jìn)行考查，確定了提取方法。采用不同品牌的色譜柱進(jìn)行測定，含量基本一致，說明所建立方法的耐用性良好。

3.3 樣品的測定結(jié)果討論 樣品測定結(jié)果顯示，不同批次間的含量結(jié)果較為穩(wěn)定，表明該企業(yè)所用藥材的質(zhì)量穩(wěn)定。芍藥苷的測定可以作為清心牛黃片中對白芍的測定方法與對清心牛黃片的質(zhì)量控制的依據(jù)之一。通過上述研究，可以對清心牛黃片的深入性藥理及臨床研究提供幫助與探索依據(jù)。此次研究未對清心牛黃片開展其他藥味的探索，只將作為君藥的白芍進(jìn)行含量測定方法的摸索，其他藥味將作為后續(xù)的研究方向進(jìn)行跟蹤研究。

1 中國藥典[S].一部.2010：96-97

2016-05-19

R927.2

A

1006-5687(2016)04-0015-03