張文燕，曹曉云

(天津市藥品檢驗所，天津 300070)

藥品質量與檢驗

鹽酸沙格雷酯片微生物限度檢查方法的建立

張文燕，曹曉云

(天津市藥品檢驗所，天津 300070)

目的：建立鹽酸沙格雷酯片的微生物限度檢查方法。方法：采用帶過濾功能均質袋對樣品進行粗濾，取粗濾后的供試溶液采用薄膜過濾法進行計數檢查，采用未經粗濾處理的供試液常規(guī)薄膜過濾法進行控制菌檢查。結果：該方法的需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數計數及控制菌檢查適用性試驗均符合《中國藥典》2015年版的要求。結論：該法可用于鹽酸沙格雷酯片微生物限度需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數計數及控制菌檢查。

鹽酸沙格雷酯片，微生物限度檢查，樣品粗濾，薄膜過濾法

鹽酸沙格雷酯片是口服固體給藥制劑，主要作用是改善慢性動脈閉塞癥所引起的潰瘍、疼痛以及冷感等缺血性諸癥狀。本品有一定的抑菌作用。執(zhí)行2010年版[2]時用500 r/min離心3 min，去除藥渣消除抑菌作用，取上清液以常規(guī)薄膜過濾法進行微生物限度檢查。和《中國藥典》2010年版微生物限度檢查方法相比，2015年版[1]有重大增修訂，如取消了500 r/min離心3 min處理的方法，這對于原采用此方法去除藥渣，進而消除抑菌成分的品種的微生物限度檢查帶來了挑戰(zhàn)，對檢查方法的建立帶來一定的困難。本文嘗試采用帶過濾功能均質袋對樣品進行粗濾，取粗濾后的供試液，采用薄膜過濾法進行鹽酸沙格雷酯片的微生物限度檢查，并按照《中國藥典》2015年版四部通則的要求進行方法適用性試驗，同時指出新版微生物限度檢查法進行日常檢測時所需注意的問題，旨在為檢測機構和藥品生產廠家提供參考，為《中國藥典》2015 年版的順利實施提供參考[5]。

1 儀器與材料

1.1 儀器 BD240 恒溫培養(yǎng)箱(德國BINDER)；SG-403A TX-INT生物安全柜(美國Baker)；SQP 精密電子天平(德國賽多利斯)；Lab dancer 漩渦混合器(德國IKA)；Yamato 810C 高壓滅菌鍋(日本Yamato株式會社)；SHAKE4000-8CE搖床 (美國Thermo)；薄膜過濾器(英國Whatman公司)；帶過濾功能均質袋(上新牌，過濾網孔徑<50 μm，規(guī)格30 cm×19 cm)；AESAP1069拍打儀(法國梅里埃)。

1.2 試驗菌種 金黃色葡萄球菌[Staphylococcus aureus,CMCC (B)26003]，枯草芽孢桿菌[Bacillus subtilis,CMCC(B)63501]，銅綠假單胞菌[Pseudomonas aeruginosa,CMCC(B)10104]，白色念珠菌[Candida albicans,CMCC (F) 98001]，黑曲霉[Aspergillus niger,CMCC (F)98003]，大腸埃希菌[Escherichia coli，CMCC(B) 44102]均購自中國食品藥品檢定研究院。

1.3 培養(yǎng)基及稀釋劑 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(批號 151202)、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(批號 151027)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(批號 151106)、麥康凱液體培養(yǎng)基(批號 151204)、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(批號 151124)均購自北京陸橋技術有限責任公司；pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(批號 1404112)購自中國食品藥品檢定研究院。以上市售脫水培養(yǎng)基均按標簽說明配制并高壓滅菌后備用。

1.4 試驗藥品 鹽酸沙格雷酯片(某公司生產，規(guī)格為100 mg/片，批號150401) 。

2 方法與結果

2.1 菌液制備 取金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物接種至10 ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，32.5 ℃培養(yǎng)24 h；取白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物，接種至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，22.5 ℃培養(yǎng)72 h。取上述四種菌的新鮮培養(yǎng)物，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成適宜濃度的菌懸液。取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物接種至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基(培養(yǎng)基約25 ml，試管內徑為25 mm)中，22.5 ℃培養(yǎng)7 d后，加入4 ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內，用含0.05%聚山梨酯80 的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成適宜濃度的黑曲霉孢子懸液。

2.2 供試液制備 取本品10 g至無菌三角瓶中，加pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋至100 ml，振搖使分散均勻，作為1∶10的供試液。取1∶10供試液20 ml，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋至100 ml，制成1∶50供試液。以上各供試液分別平行制備6份。

2.3 計數方法適用性試驗

2.3.1 比值計算 計數方法適用性試驗中，采用平皿法或薄膜過濾法時，試驗組菌落數減去供試品對照組菌落數的值與菌液對照組菌落數的比值應在0.5～2范圍內[1,3,4]。公式1：試驗組的比值=(試驗組的平均菌落數-供試品對照組的平均菌落數)/菌液對照組的平均菌落數[1];公式2：粗濾處理后菌液組比值=粗濾處理后的平均菌落數/菌液對照組的平均菌落數。

2.3.2 1∶10和1∶50供試液平皿傾注法測定[1]

2.3.2.1 試驗組 A：取1∶10供試液9.9 ml置滅菌試管中，加入適量濃度的0.1 ml枯草芽孢桿菌菌液，制成菌含量<100 cfu/ml的供試液，取1 ml注皿，立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，置32.5 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48～120 h，逐日觀察結果。同法制備含金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌和黑曲霉的供試液。B：取1∶50供試液9.9 ml置滅菌試管中，后同A法。

2.3.2.2 供試品對照組 取1∶10和1∶50供試液各1 ml注皿，后同“2.3.2.1”項下試驗組A法。

2.3.2.3 菌液對照組 取適量濃度的0.1 ml枯草芽孢桿菌菌液加pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋至10 ml，制成菌含量<100 cfu/ml的供試液，取1 ml注皿，后同“2.3.2.1”項下試驗組A法。

2.3.2.4 結果 因本品抑菌性很強，各試驗組的比值均為0，因此不能采用上述方法進行本品微生物限度計數檢查。

2.3.3 1∶10和1∶50供試液薄膜過濾法測定[1]

2.3.3.1 試驗組 A：取1∶10供試液9.9 ml置滅菌試管中，加入適量濃度的0.1 ml枯草芽孢桿菌菌液，制成菌含量<100 cfu/ml的供試液，取1 ml薄膜過濾，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液500 ml分次沖洗，取膜貼于相應的瓊脂培養(yǎng)基上,置32.5 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48～120 h，逐日觀察結果。同法制備含金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌和黑曲霉的供試液。B：取1∶50供試液9.9 ml置滅菌試管中，后同A法。

2.3.3.2 供試品對照組 取1∶10和1∶50供試液各1ml薄膜過濾，后同“2.3.3.1”項下試驗組A法。

2.3.3.3 菌液對照組 取適量濃度的0.1 ml枯草芽孢桿菌菌液加pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋至10 ml，制成菌含量<100 cfu/ml的供試液，取1 ml薄膜過濾，后同“2.3.3.1”項下試驗組A法。

2.3.3.4 結果 按“2.3.1”項下公式1計算比值，結果見表1。根據表1結果，常規(guī)1∶10供試液1 ml薄膜過濾，由于本品藥渣的影響，在薄膜上無法正常計數，因此不能采取本方法進行計數試驗。常規(guī)1∶50供試液1 ml薄膜過濾，雖然藥渣影響減弱，但對菌落計數的影響依然存在，尤其是枯草芽孢桿菌和銅綠假單孢菌，因此不能采取本方法進行計數試驗。

表1 1∶50供試液薄膜過濾法測定試驗組比值

2.3.4 粗濾處理1∶10和1∶50供試液薄膜過濾法測定

2.3.4.1 試驗組 A：將三角瓶中1∶10供試液100 ml中，加入適量濃度的0.1 ml枯草芽孢桿菌菌液，制成菌含量<100 cfu/ml的供試液，將該供試液全量置于帶過濾功能均質器專用袋大體積一側中，在拍打儀中充分拍打30 s。取過濾后小體積一側的試液1 ml薄膜過濾，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液500 ml分次沖洗，取膜貼于相應的瓊脂培養(yǎng)基上，置32.5 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48～120 h，逐日觀察結果。同法制備含金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌和黑曲霉的供試液。B：將三角瓶中1∶50供試液100 ml中，加入適量濃度的0.1 ml枯草芽孢桿菌菌液，制成菌含量<100 cfu/ml的供試液，將該供試液全量置于帶過濾功能均質器專用袋大體積一側中，在拍打儀中充分拍打30 s。取過濾后小體積一側的試液1ml薄膜過濾，后同試驗組A法。

2.3.4.2 供試品對照組 取1∶10和1∶50供試液分別全量置于帶過濾功能均質器專用袋大體積一側中，在拍打儀中充分拍打30 s。取過濾后小體積一側的試液各1 ml薄膜過濾，后同“2.3.4.1”項下試驗組A法。

2.3.4.3 菌液對照組 取適量濃度的0.1 ml枯草芽孢桿菌菌液加pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋至100 ml，制成菌含量<100 cfu/ml的供試液，取1 ml薄膜過濾，后同“2.3.4.1”項下試驗組A法。

2.3.4.4 粗濾處理后菌液對照組 取適量濃度的0.1 ml枯草芽孢桿菌菌液加pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋至100 ml，制成菌含量<100 cfu/ml的供試液，將該供試液全量置于帶過濾功能均質器專用袋大體積一側中，在拍打儀中充分拍打30 s。取過濾后小體積一側的試液1 ml薄膜過濾，后同“2.3.4.1”項下A法。

2.3.4.5 結果 按“2.3.1”項下公式1和公式2計算比值，結果見表2和表3。根據表2結果可以看出，帶過濾功能的均質器專用袋對樣品進行粗濾處理后菌液對照組的菌落數與菌液對照組的菌落數的比值在0.5～2之間，是符合《中國藥典》規(guī)定的。因此，本品可以采用上述粗濾的方法進行供試液的處理。從表3可以看出，粗濾處理后的1∶10供試液1 ml進行薄膜過濾，雖然藥渣影響減弱，但對菌落計數的影響依然存在，尤其是枯草芽孢桿菌和銅綠假單孢菌，而且由于藥渣的殘留，本品對試驗菌的抑菌作用依然存在，所以不能采用此方法進行方法適用性試驗。粗濾處理后1∶50供試液1 ml薄膜過濾，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液500 ml分5次進行沖洗，結果試驗組菌數與菌液對照組菌數的比值均在0.5～2之間，因此，鹽酸沙格雷酯片微生物限度需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數檢查可采用此法。

表2 粗濾處理后菌液對照組回收率比值(n=3)

2.4 控制菌方法適用性試驗 鹽酸沙格雷酯片為口服固體制劑，控制菌檢查大腸埃希菌。在之前按照《中國藥典》2010年版二部附錄[2]進行檢測的時候，采用的方法為：取本品10 g，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成1∶10供試液。取1∶10供試液適量，置離心管中，以500 r/min離心3 min后，取全部上清液10 ml，薄膜過濾，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液500 ml分次沖洗，在最后一次沖洗液中加入規(guī)定量大腸埃希菌(約10～100 cfu)后過濾，取濾膜加入到500 ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，依法檢查。因此，嘗試新的方法進行控制菌檢查法的方法適用性試驗。

2.4.1 供試液制備 同“2.2”項下供試液制備。

2.4.2 菌液制備 取大腸埃希菌的新鮮培養(yǎng)物接種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，32.5 ℃培養(yǎng)24 h。取上述大腸埃希菌的新鮮培養(yǎng)物，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成適宜濃度的菌懸液。2.4.3 方法適用性試驗 曾嘗試取1∶10的供試液10 ml薄膜過濾，因藥渣殘留太多，根本無法過濾下去，因此采用分兩張濾膜過濾，每膜5 ml，加入規(guī)定量試驗菌(不大于100 cfu)，取兩濾膜置500 ml和800 ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，試驗組均未有菌落生長。因此不能采用上述方法進行檢查。①試驗組：取1∶10的供試液10 ml薄膜過濾，分兩張濾膜過濾，每膜5 ml，加入規(guī)定量試驗菌(不大于100 cfu)，取兩濾膜置1 000 ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，依法檢查。②陽性對照組：取規(guī)定量大腸埃希菌(不大于100 cfu)，加入1 000 ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，32.5 ℃培養(yǎng)18 h。③陰性對照組：取10 ml pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液同試驗組操作。取試驗組、陽性對照組上述培養(yǎng)物各1 ml接種至100 ml麥康凱液體培養(yǎng)基中，43 ℃培養(yǎng)24 h。取上述麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上， 32.5 ℃培養(yǎng)18 h。陽性對照組平板上菌落形態(tài)為鮮桃紅色，菌落中心呈深桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，濕潤。試驗組上菌落形態(tài)與陽性對照組一致。陽性對照組麥康凱瓊脂平板上有大腸埃希菌生長；試驗組麥康凱瓊脂平板上有大腸埃希菌生長。陰性對照組無菌落生長。見表4。

2.4.4 結果 從表4可以看出，陰性對照組未檢出試驗菌，試驗組檢出試驗菌，因此鹽酸沙格雷酯片控制菌檢查可以采用薄膜過濾法。取本品10 g，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成1∶10供試液。取1∶10的供試液10 ml薄膜過濾，分兩張濾膜過濾，每膜5 ml，加入規(guī)定量試驗菌(不大于100 cfu)，取兩濾膜置1 000 ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，依法檢查。

表3 粗濾處理后1∶10和1∶50供試液薄膜過濾法測定試驗組比值(n=3)

表4 控制菌檢查法方法適用性試驗結果

注：“+”表示液體培養(yǎng)基變渾濁，或分離平板上有菌落生長，且生長特征與相應目標菌標準菌株一致?！?”表示液體培養(yǎng)基澄清，或分離平板上無菌生長，或有菌生長但生長特征與相應目標菌標準菌株不一致。 “/”表示空白。

3 討論

3.1 通過上述方法摸索，成功建立了鹽酸沙格雷酯片的微生物限度檢查方法?！吨袊幍洹?015年版將500 r/min離心3 min處理供試液的方法取消，這是出于“需氧菌總數”計數里包含霉菌和酵母菌計數的考慮，因為霉菌和酵母菌菌體較細菌重量大，在離心的過程中，會隨著藥渣離心到下部分，若藥品被這些菌污染，則檢驗結果并不能完全真實反映藥品的污染情況，對患者的使用帶來了潛在的安全隱患。這個供試液處理方法的取消，對于本身具有抑菌性的口服固體，尤其是含有藥渣的藥品的微生物限度檢查方法的建立帶來了一定的困難。本課題采用帶過濾功能的均質袋進行粗濾，可以截留一部分顆粒比較大的藥渣，減少試驗中薄膜上藥渣殘留過多導致無法沖洗或者藥渣殘留過多導致薄膜上無法計數的問題，以及藥渣的殘留導致藥品的抑菌性無法消除，從而試驗菌的回收率無法達到《中國藥典》要求的困局。

3.2 《中國藥典》2015年版方法接種和稀釋的步驟中，將供試液和試驗菌混勻后，再加入到平皿中或者進行薄膜過濾的操作。這樣的操作更能真實的反映藥品被微生物污染的情況。

3.3 根據實際操作經驗，在接種和稀釋的步驟中，供試液和菌液的混合時間不宜太短，應至少混合5～10 min之上，保證藥品和試驗菌的充分混合，以及試驗更好的重復性，更真實地模擬藥品被微生物污染的情況。

3.4 方法適用性試驗表明，鹽酸沙格雷酯片的微生物限度方法為：取本品10 g至無菌三角瓶中，加pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋至100 ml，振搖使分散均勻，作為1∶10的供試液。取1∶10供試液20 ml，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋至100 ml，制成1∶50供試液。將三角瓶中1∶50供試液全量置于帶過濾功能均質器專用袋大體積一側中，在拍打儀中充分拍打30 s。取過濾后小體積一側的試液作為粗濾1∶50供試液進行計數試驗。取粗濾1∶50供試液1 ml薄膜過濾，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液500 ml分5次進行沖洗，取濾膜貼于相應的培養(yǎng)基上，依法進行需氧菌總數計數、霉菌和酵母菌總數檢查。取1∶10供試液10 ml薄膜過濾，分兩張濾膜過濾，每膜5 ml，取兩濾膜置1 000 ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，依法進行大腸埃希菌檢查。

1 中國藥典[S]. 四部.2015：140-151

2 中國藥典[S]. 二部.2010：附錄107-116

3 美國藥典[S]. 38 版. 2015：106-120

4 歐洲藥典[S]. 8.0版．2014：185-194

5 李趣嫦，江艷芳.《中國藥典》2010版與2015版微生物限度檢查法對四種藥物檢測結果的比較[J].中國藥品標準，2015，16(2):86-90

2016-07-22

R927.11

A

1006-5687(2016)05-0014-04