梁停停，劉文麗，許浩，申立泉，李翔，馬立保(華中農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，武漢 430070)

水牛瘤胃微生物研究進展

梁停停，劉文麗，許浩，申立泉，李翔，馬立保
(華中農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，武漢 430070)

反芻動物瘤胃微生物在飼料降解過程中發(fā)揮著重要作用。水牛與其他品種牛相比具有耐粗性的優(yōu)勢，推測其瘤胃內(nèi)可能含有更高效的特殊的微生物系統(tǒng)，能為水牛的耐粗性提供保障。另外，通過日糧對瘤胃微生物群落的調(diào)控，可以了解瘤胃微生物與日糧之間的關系，從而為改善瘤胃系統(tǒng)、充分利用飼料資源、提高反芻動物生產(chǎn)性能提供理論依據(jù)與數(shù)據(jù)支持。

水牛；瘤胃微生物；日糧；耐粗性

反芻動物瘤胃被認為是一個重要的天然發(fā)酵罐，可以為反芻動物提供發(fā)酵終產(chǎn)物，比如揮發(fā)性脂肪酸（VFAs）和微生物蛋白等能量物質(zhì)和蛋白質(zhì)。瘤胃發(fā)酵的效率越高，所合成的發(fā)酵終產(chǎn)物越好。瘤胃微生物是迄今為止已知的降解轉(zhuǎn)化植物纖維素類物質(zhì)效率最高的天然體系，依賴瘤胃微生物群體的協(xié)同作用，可將天然纖維類物質(zhì)快速降解轉(zhuǎn)化成一系列動物所需營養(yǎng)物質(zhì)。瘤胃微生物每天消化的量占采食總碳水化合物的50%～55%，因此瘤胃微生物在反芻動物的飼料消化過程中起著重要的作用。瘤胃微生物包括細菌、原生蟲和厭氧真菌。以細胞數(shù)量計，瘤胃微生物數(shù)量約為反芻動物自身細胞數(shù)目的10倍。每克瘤胃內(nèi)容物中含細菌109～1010、原生蟲105～106、真菌105個菌體形成單位（thallus-forming units,TFU）[1]。動物本身并不能分解纖維類物質(zhì)，需要完全依賴棲居在其消化系統(tǒng)中的大量微生物。因此反芻動物最本質(zhì)的問題是瘤胃微生物的問題，瘤胃微生物群落的組成對于反芻動物充分利用飼料資源有重大影響。

水牛是熱帶、亞熱帶地區(qū)特有的畜種，主要分布于亞洲地區(qū)，約占全球飼養(yǎng)量的90%，被國際糧農(nóng)組織(FAO)認為是最具有開發(fā)潛力和價值的家畜[2]。水牛具有乳、肉、役多種經(jīng)濟用途，飼養(yǎng)方便，養(yǎng)殖成本低，多飼喂農(nóng)作物剩余物和工業(yè)副產(chǎn)品等低質(zhì)粗飼料，這些飼料原料含有高含量的木質(zhì)纖維素、低水平的可發(fā)酵碳水化合物和優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)。與其他品種牛相比，水牛具有耐粗性高的生物學特性[3]。但到目前為止，水牛比其他品種牛消化能力強的原因還未被完全闡明，可以推測它們的瘤胃體系與其他品種牛有一定差異，可能具有更高效的特殊的瘤胃微生物體系。本文查閱了國內(nèi)外研究的相關文獻，現(xiàn)綜述如下。

1 水牛與其他品種牛瘤胃微生物差異性的對比

Wanapat報道，沼澤型水牛與肉牛在瘤胃發(fā)酵和飼料營養(yǎng)物質(zhì)消化率的水平上有顯著的差異，沼澤型水牛能夠更有效地利用粗飼料，特別是在供應低品質(zhì)的飼料時，飼料消化率高出其他品種牛2%～5%[4]。2000年研究發(fā)現(xiàn)，這可能是因為沼澤型水牛的瘤胃生態(tài)系統(tǒng)不同于肉牛，特別是瘤胃細菌屬于500多個不同的種類，其含有更高數(shù)量的纖維素分解菌和真菌游動孢子及較低的原蟲數(shù)量，且對瘤胃中氮循環(huán)利用有較強的能力[5]。Wora-anu對肉牛和水牛做了對比試驗，使用尿素溶液浸泡的稻草和木薯干草作為粗飼料原料，發(fā)現(xiàn)水牛瘤胃的總活菌數(shù)顯著高于肉牛，分別為4.4x1012cells/ mL和3.6x1012cells/mL。原蟲數(shù)量也高于肉牛，分別為2.3x105cells/mL和1.6x105cells/mL。丙酸和丁酸的濃度同樣高于肉牛，分別為22.3vs19.4mol/100mol和15.7vs13.5mol/100mol[6]。Pant對印度水牛和瘤牛在相同的飼養(yǎng)管理條件下飼喂相同的日糧，結果發(fā)現(xiàn)，水牛瘤胃液總細菌數(shù)濃度每天平均為25.5×109cells/ mL，瘤牛為21.8×109cells/mL，前者顯著高于后者。特別是季氏顫螺核菌一類微生物(Oscillospira)比瘤牛多10～25倍，每天平均濃度分別為10.46×105cells/ mL和0.56×105cells/mL。但是，總纖毛蟲數(shù)量在這兩個品種牛中沒有差異。另外，水牛瘤胃液中細菌氮濃度高于瘤牛，瘤牛瘤胃液中的原蟲氮濃度高于水牛。水牛瘤胃液中的細菌氮含量較高，并且含有較多的嗜碘微生物（顫螺菌屬），表明水牛瘤胃微生物具有更高的蛋白質(zhì)合成能力[7]。Wanapat對比研究水牛（印度水牛）和黃牛（婆羅門牛x本地牛）瘤胃中的原蟲、真菌游動孢子和細菌時發(fā)現(xiàn)，水牛瘤胃中總細菌的數(shù)量高于黃牛（分別為1.6×108cells/mL和1.36×108cells/mL），且含有更高數(shù)量的球菌、桿菌和橢圓型菌。水牛含有相對較低數(shù)量的原蟲，而黃牛卻含有相對較低數(shù)量的holotrichs和entodiniomorphs。水牛瘤胃中真菌游動孢子的數(shù)量顯著高于黃牛，分別為7.30×106cells/mL和3.78×106cells/mL。并且發(fā)現(xiàn)厭氧鞭菌屬（Anaeromyces）和Acuminate apex是水牛瘤胃中的優(yōu)勢菌。這些差異可能揭示了在沒有青草的旱季，水牛相比黃牛能夠保持較好體重的原因[8]。Chanthakhoun研究發(fā)現(xiàn)，水牛瘤胃中分解纖維的微生物數(shù)量顯著高于黃牛，并且在喂食4h后，水牛瘤胃中R. Albus顯著高于黃牛，而F. Succinogenes的含量在黃牛瘤胃中較高。白色瘤胃球菌（Ruminococcus albus，R. Albus）和F. Succinogenes是目前認為在瘤胃中最主要的纖維素分解菌，這可能是水牛對稻草具有較高消化率的原因[9]。Shuli Yang通過克隆和測序大額牛和沼澤型水牛瘤胃細菌16S rRNA基因序列庫，與數(shù)據(jù)庫中荷斯坦牛的細菌16S rRNA基因序列庫進行對比，證明不同種類動物瘤胃細菌的系統(tǒng)發(fā)育具有多樣性。研究共收集470個序列（236 OTUS），其中水牛173個序列（101 OTUs），荷斯坦牛150個序列（76 OTUs），大額牛147個序列（86 OTUs）。通過這三種牛的基因庫比較，發(fā)現(xiàn)在水牛的序列中，13.3%的序列為已培養(yǎng)細菌的序列，而荷斯坦牛為24%，大額牛為9.5%。在已培養(yǎng)的細菌中，略紫色梭菌（Clostridium puniceum）、雙孢梭菌（Clostridium disporicum）、Oscillospira guilliermondii、Schwartzia succinivorans、瓊氏不動桿菌（Acinetobacter junii）、Planococcus sychrotoleratus、松鼠葡萄球菌（Staphylococcus sciuri）、硫氧化細菌（Sulfideoxidizing bacterium）、溶纖維真桿菌（Eubacterium c e l l u l o s o l v e n s）僅存在于水牛序列中；Succiniclasticum ruminis、Pseudobutyrivibrio ruminis為三者共有的序列；溶纖維丁酸弧菌（Butyrivibrio fibrisolvens）為水牛和大額牛共有；生黃瘤胃球菌（Ruminococcus flavefaciens）為水牛和荷斯坦牛共有。瘤胃假丁酸弧菌（Pseudobutyrivibrio ruminis） 屬于纖維分解菌，琥珀酸菌（Succiniclasticum ruminis）可以將琥珀酸酯轉(zhuǎn)化為丙酸酯，從中獲得代謝能，這兩種菌出現(xiàn)在三種牛瘤胃中，顯示出對宿主的重要性以及與宿主的共生關系。Prevotella ruminicola是模擬瘤胃環(huán)境中最多的細菌之一，但是在大額牛和沼澤型水牛中未檢索到相似的序列。在未培養(yǎng)的OTUs，2個OTUs出現(xiàn)在三個不同品種牛的基因庫中，16個OTUs出現(xiàn)在其中兩個基因庫中，表明未培養(yǎng)的細菌在不同的瘤胃生態(tài)系統(tǒng)中存在差異。另外發(fā)現(xiàn)一些以前沒有被描述過的動物特定細菌，比如大額牛中的Allisonella histaminiforman，沼澤型水牛中的松鼠葡萄球菌（Staphylococcus sciuri）。這些數(shù)據(jù)說明不同品種牛瘤胃細菌的群落的組成具有一定的差異性[10]。

Wanapat將水牛瘤胃內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到肉牛瘤胃中，轉(zhuǎn)移后14d發(fā)現(xiàn)肉牛的瘤胃生態(tài)發(fā)生了變化，瘤胃中纖維素分解菌、蛋白質(zhì)水解菌和淀粉分解菌顯著增加。說明通過將水牛瘤胃內(nèi)容物轉(zhuǎn)移給其他反芻動物可以提高其瘤胃消化率，但有關這方面的研究報道較少，在改善瘤胃生態(tài)方向，特別是以水牛為基礎的瘤胃生態(tài)還需進一步研究[11]。

2 飼料對水牛瘤胃微生物的組成及數(shù)量的影響

瘤胃微生物的群落結構是持續(xù)變化的，易受到日糧、季節(jié)、宿主健康和環(huán)境溫度濕度等多種因素的影響。對于健康生長的反芻動物來說，日糧是影響瘤胃微生物群落結構最重要的因素[12]。由于日糧對瘤胃微生物生存、繁衍的重要作用，因此，研究日糧對瘤胃細菌種群的影響意義重大。

Chanjula發(fā)現(xiàn)以稻草為基礎日糧，增加木薯干草含量，可以顯著降低水牛瘤胃原蟲數(shù)量，每克瘤胃內(nèi)容物原蟲數(shù)量從6.2x105CFU降低到2.1x105CFU，而纖維素分解菌數(shù)量呈現(xiàn)增加趨勢，從5.3x107CFU/g增加到7.2x107CFU/g ，出現(xiàn)這種結果的原因可能是木薯干草高含量的蛋白質(zhì)（25%）和濃縮的單寧(4%)[13]。Wanapat發(fā)現(xiàn)與木薯片相比，玉米棒作為能量來源可以增加水牛瘤胃的活菌數(shù)，特別是纖維素細菌數(shù)量[14]。Chanthakhoun在水牛飼喂稻草的基礎上補充絆牛豆干草，發(fā)現(xiàn)飼喂量為600g/d時，可以使細菌和真菌游動孢子的數(shù)量達到最大化，并降低原蟲數(shù)量。進一步研究發(fā)現(xiàn)，補充絆牛豆干草可以增加纖維素分解菌產(chǎn)琥珀酸擬桿菌(F. succinogenes)、生黃瘤胃球菌（R.flavefaciens）和白色瘤胃球菌（R. albus）的數(shù)量，在晨飼4h之后，纖維素分解菌 R. flavefaciens和R. albus高于晨飼前。R. flavefaciens 和 R. albus 這兩種細菌在水牛瘤胃中的高含量，進一步證明了水牛對高纖維飼料的高效利用率[9]。Wanapat發(fā)現(xiàn)在不同的粗飼料和精飼料的比例條件下，水牛瘤胃消化物和瘤胃液中F.succinogenes數(shù)量最多，其次為R. flavefaciens 和 R.albus。說明這三種細菌在水牛瘤胃中起著重要的作用[15]。Pitta利用16S rRNA焦磷酸測序方法，研究了三種精粗比日糧（50%精料:50%粗飼料，25%精料:75%粗飼料，100%粗飼料）條件下水牛瘤胃細菌的多樣性，結果顯示，瘤胃球菌屬(Ruminococcus)和瘤胃纖維桿菌屬(Fibrobacter)數(shù)量在100%粗飼料組中顯著多于另外兩組，普氏菌屬(Prevotella)在50:50組中數(shù)量最多。Prevotella主要參與半纖維素的降解，Ruminococcus 和Fibrobacter主要參與纖維素的降解[16]。李萍對15頭雜交母水牛分別飼喂精粗比為0:10、3.5:6.5、5:5的試驗日糧，研究不同日糧精粗比對后備雜交母水牛瘤胃主要纖維降解菌數(shù)量的影響，結果表明隨著日糧精料水平的升高，瘤胃中原蟲數(shù)量逐漸增多，產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌和丁酸弧菌數(shù)量逐漸降低，白色瘤胃球菌和黃色瘤胃球菌數(shù)量差異不顯著，但是呈下降趨勢，說明不同日糧精粗比能有效影響雜交后備母水牛瘤胃內(nèi)纖維降解菌數(shù)量，且數(shù)量隨著精料水平的升高而降低[17]。周祥研究了3種不同NDF水平（38%、44%、51%）日糧對雜交水牛瘤胃細菌群落結構和一些主要功能菌數(shù)量的影響，發(fā)現(xiàn)在不同NDF水平日糧條件下，雜交水牛瘤胃固相與液相細菌群落區(qū)系都顯示出了一定的差異性，但差異性并不顯著。另外發(fā)現(xiàn)，在不同NDF水平日糧條件下，擬桿菌門與厚壁菌門均為瘤胃內(nèi)的優(yōu)勢菌群。在雜交水牛瘤胃液相細菌區(qū)系中，當NDF水平為 44%時，瘤胃內(nèi)瘤胃球菌屬(Ruminococciis sp.)、解纖維熱酸菌(Acidothermus cellulolyticus)、解纖維梭菌(Clostridium cellulolyticum)與另兩組存在差異。在雜交水牛瘤胃固相細菌區(qū)系中，當NDF水平為38%時，普雷沃氏菌科(Prevotellaceae) 較另外兩組有差異。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，反芻獸新月單胞菌受到日糧NDF水平的影響，當NDF水平為44%時，其數(shù)量最多。纖維降解菌（產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、白色瘤胃球菌和黃色瘤胃球菌）數(shù)量在各NDF水平下未產(chǎn)生顯著性差異，但高NDF水平組數(shù)量高于另外兩組。不同NDF水平下脂解厭氧弧菌數(shù)量未受到影響[18]。

關于飼料對水牛瘤胃微生物群落影響的研究，大部分學者仍側(cè)重于與粗纖維相關的微生物，這可能與受關注度越來越高的生物能源有關。

3 瘤胃微生物的研究方法

傳統(tǒng)的瘤胃生態(tài)系統(tǒng)中微生物群落多樣性及結構分析主要通過分離培養(yǎng)、計數(shù)和分類鑒定，然后通過一般的生物化學性狀或者特定的表現(xiàn)型來分析。微生物的分離培養(yǎng)可以充實瘤胃微生物菌種資源，用于研究微生物生理功能與代謝，尤其參與日糧營養(yǎng)物質(zhì)降解代謝[19]。目前常用的瘤胃微生物分離培養(yǎng)的方法主要包括以下幾種：

3.1 亨氏滾管法

亨蓋特厭氧滾管技術是美國微生物學家Hungate于1950年首次提出并應用于瘤胃厭氧微生物研究的一種厭氧培養(yǎng)技術。目前滾管法是培養(yǎng)厭氧微生物最常用的方法，并以其姓氏命名為亨氏管。亨蓋特厭氧滾管培養(yǎng)技術可以用于微生物的分離和鑒定，也可以用于活菌培養(yǎng)計數(shù)。

3.2 厭氧培養(yǎng)箱

厭氧培養(yǎng)箱亦稱厭氧工作站或厭氧手套箱，是機械和電子技術發(fā)展的產(chǎn)物。原理是通過真空泵先將箱內(nèi)氧氣抽出，充入氮氣和混合氣體使箱內(nèi)形成厭氧環(huán)境，能夠為厭氧微生物提供嚴格的厭氧環(huán)境和恒定的溫度培養(yǎng)條件，進而可以進行取樣制樣、劃線分離、接種、生化鑒定等標準的微生物實驗操作。其優(yōu)點是可以避免厭氧微生物在大氣中操作時接觸氧氣而死亡；操作簡便，可隨時進行樣品的放置、取出、觀察；箱體容量大，可以大規(guī)模地生產(chǎn)。缺點是建設成本及維護成本都非常高[20]。

3.3 厭氧罐

厭氧罐是用聚碳酸酯制成的圓柱形透明罐體，配有硅橡膠密封圈，以保證密封。原理是采用抽氣換氣法徹底驅(qū)走罐內(nèi)原有空氣，操作步驟為：抽真空→灌N2→抽真空→灌混合氣體（N2、CO2和H2），最后罐內(nèi)少量剩余氧氣將在鈀的催化下，與混合氣體中的H2合成H2O，從而形成良好的無氧環(huán)境。也可以用商品化的“GasPak”內(nèi)源性產(chǎn)氣袋替代上述繁瑣的抽氣換氣方法。只需把這種產(chǎn)氣袋的外表塑料層移去，立即放入?yún)捬豕薏⒎忾]，它就會通過袋內(nèi)藥品的化學反應消除氧氣，產(chǎn)生CO2和H2。

此外，還有蠟燭耗氧法和厭氧袋法。前者是利用蠟燭燃燒消耗封閉容器里的氧氣，產(chǎn)生二氧化碳，在封閉容器內(nèi)形成厭氧環(huán)境。此法產(chǎn)生的厭氧環(huán)境很難得到保證，培養(yǎng)過程不方便操作。后者是利用袋內(nèi)的藥品將氧氣吸收從而達到無氧狀態(tài)，優(yōu)點是能夠保證厭氧環(huán)境；缺點是不能滿足大量生產(chǎn)的需要，而且成本較高。

4 分子生物學在瘤胃微生物中的應用

分子生物學方法可以用來研究瘤胃微生物的多樣性、群落結構、種群動態(tài)及日糧組分的降解和轉(zhuǎn)化，既能夠精確地反映微生物的分布情況，也可以直接對微生物數(shù)量進行準確定量。

目前常用的分子生物學方法有實時熒光定量PCR （RT-PCR）[21]、Sanger測序、16S rDNA克隆文庫分析[22]，PCR-DGGE[23]、末端限制性片段長度多態(tài)性（T-RFLP）、基因芯片[24]、焦磷酸測序[25]、宏基因組測序[26]和高通量測序[27]等。雖然分子生物學技術的廣泛應用在微生物多樣性、挖掘基因資源、功能驗證方面發(fā)揮了作用，充分彌補了純培養(yǎng)技術的不足，但其不能得到單個的微生物菌體，不能充分了解微生物的生理生化特點和其在瘤胃發(fā)酵中的作用，所以將分子生物學方法和傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法結合起來，才能夠深入地了解瘤胃微生物和開發(fā)應用這些微生物資源。

5 小結

綜上所述，在反芻動物瘤胃中，真菌、細菌和原蟲的比例和數(shù)量之間的任何變化，都可能導致不同種類反芻動物消化能力的差異，所以可以推測，水牛擁有一個獨特的瘤胃系統(tǒng)，其多樣性的微生物群落與其他品種牛是有差異的，也許正是這些差異解釋了水牛的耐粗性等生物學特性。日糧可以調(diào)控水牛瘤胃微生物群落的組成和分布，通過了解水牛瘤胃微生物與日糧之間的關系，可為粗飼料在水牛日糧中的應用提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。同樣也可以從水牛瘤胃中分離出纖維素降解能力較高的菌株接種到其他反芻動物中，通過調(diào)控該菌來提高粗飼料消化率，充分利用瘤胃微生物資源，提高反芻動物生產(chǎn)性能。根據(jù)目前的數(shù)據(jù)，水牛瘤胃微生物的多樣性還未充分了解，需利用現(xiàn)代分子生物技術進行進一步探索。

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S823.4

A

1004-4264（2017）02-0001-05

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.02.001

2016-10-18

“十二五”國家支撐計劃“豬牛繁殖障礙控制及生殖激素制劑開發(fā)”(2011BAD19B03)。

梁停停（1990-），女，碩士生，研究方向為動物營養(yǎng)與飼料科學。

李翔（1971-），湖北監(jiān)利人，男，副教授，研究方向為特種經(jīng)濟動物飼養(yǎng)。馬立保（1965-），湖北隨州人，男，副教授，研究方向為動物營養(yǎng)與飼料科學。