段新華 廖治鋒

（深圳市南山區(qū)動物防疫監(jiān)督所，廣東深圳 518052）

淺談馬傳染性貧血病瓊脂凝膠免疫擴散試驗的操作

段新華 廖治鋒

（深圳市南山區(qū)動物防疫監(jiān)督所，廣東深圳 518052）

馬傳染性貧血病簡稱馬傳貧（EIA），又稱沼澤熱，是由反轉錄病毒科馬傳貧病毒引起的以間歇性發(fā)熱、貧血、黃疸及出血、進行性消瘦及浮腫為臨診特征的一種馬屬動物傳染性疾病，已分別被世界動物衛(wèi)生組織和我國農(nóng)業(yè)部列為B類疫病和二類動物疫病。瓊脂凝膠免疫擴散試驗具有操作簡便、特異性強、對設備和技術要求較低、適用于大量血清樣本檢測等特點，是目前國際貿(mào)易中的指定診斷試驗方法，也是我國農(nóng)業(yè)行業(yè)現(xiàn)行標準（NY/T 569-2002）。現(xiàn)結合筆者多年馬傳染性貧血檢測經(jīng)驗對其試驗操作談幾點看法，以供參考。

馬傳貧 血清樣品 瓊脂板制備 打孔 加樣 結果判定

1 血清樣品

試驗要求待檢馬血清應為無沉淀、無渾濁、無溶血的清涼液體，但是，在日常監(jiān)測中常常會發(fā)現(xiàn)有些馬血清樣本出現(xiàn)溶血或凝固成膠凍狀現(xiàn)象，而無法用于檢測。出現(xiàn)溶血現(xiàn)象大多是由采血不當造成的，采血人員技術不熟練、馬匹不配合等都會造成采血困難、采血量少，造成溶血；另外，存放采好馬血的離心管在運輸或保存過程中出現(xiàn)搖晃和碰撞也會造成溶血。析出的血清出現(xiàn)凝固，大多與馬匹自身因素有關，血脂過高、營養(yǎng)不良、營養(yǎng)過剩及某些疾病都可能造成血清析出困難，因此，采樣前盡量減少對馬匹的刺激，不要在馬匹剛飼喂后或者過度勞累后立即采血。對于溶血的樣品，如果溶血不嚴重，實驗時盡量選擇清亮部分吸取，建議多做一次重復；如果溶血嚴重，則需重新采集血樣。對于出現(xiàn)果凍狀的血清樣品，可以在離心時適當增加離心時間和離心轉速進行血清分離，如果仍無血清析出，可以用移液器吸頭向管壁輕壓，通常會有血清出現(xiàn)。

2 瓊脂板制備

2.1 瓊脂和PBS

瓊脂要選用優(yōu)質純度高的瓊脂粉，因為其中礦物質、金屬離子和一些不溶性雜質都會對試驗結果造成影響。標準中要求PBS為加入萬分之一的硫柳汞的pH7.2的0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液。硫柳汞主要是用來作為防腐劑和抑菌劑，但是其對人體健康具有一定的毒副作用。筆者通過試驗對比發(fā)現(xiàn)，無須加入硫柳汞同樣能達到好的實驗效果。瓊脂的濃度建議為1.2%～1.4%，試驗發(fā)現(xiàn)1%的瓊脂會偏稀，不利于打孔，而1.3%左右的瓊脂試驗效果較佳。瓊脂可以用微波爐進行加熱，將稱好的瓊脂粉和相應磷酸緩沖液倒入錐形瓶中，搖勻，用錫紙封口，并用牙簽在瓶口扎幾個小洞，這樣不僅可以減少加熱時水分的揮發(fā)，同時也能防止瓊脂溶液沸騰時錫紙被沖開。瓊脂加熱時要使其多沸騰幾次，這樣能更好地除菌和除氣。

2.2 倒板

用直徑為90mm的玻璃平板或者一次性塑料平板，倒板建議在平整的超凈工作臺內(nèi)操作，這樣既能保證瓊脂表面平坦，又能加快平板冷卻，且也能減少空氣中細菌的污染。將熱瓊脂液15～18ml輕輕倒入平板，注意不要產(chǎn)生氣泡，如果產(chǎn)生小氣泡，可用移液器或一次性吸管將氣泡吸出。瓊脂板冷卻后要及時加蓋，防止水分蒸發(fā)，并將其翻轉放入4℃冰箱過夜。

2.3 打孔

反應孔應采用現(xiàn)用現(xiàn)打、按需打孔的原則，用七孔打孔器進行打孔。打孔最好用放置冰箱過夜后的平板，這樣瓊脂容易挑出。每塊平板建議打2～3組孔，孔組之間要有較寬的間隔，每個組有7孔，中間1孔，外圍6孔，每組孔可以檢測3個血清樣品，試驗中根據(jù)樣品數(shù)量確定所需孔組數(shù)。打孔時要水平輕輕壓下打孔器，不要太用力，以免破壞瓊脂板；然后用針頭或牙簽挑出孔內(nèi)切下的瓊脂，注意挑出時一定不能把瓊脂板凝膠挑破，使孔與孔之間出現(xiàn)裂痕，這樣會嚴重影響實驗結果。

2.4 封底

由于在打孔挑出孔內(nèi)瓊脂過程中會破壞瓊脂板底部的牢固性，甚至出現(xiàn)松動脫離，加樣后會導致陽性血清、待檢血清和抗原的相互混合，造成實驗失敗，因此瓊脂板在打孔后一定要經(jīng)過封底處理。試驗常采用酒精燈加熱的方法進行封底，但這常常造成加熱不均，封底效果欠佳，而且，對于塑料平板則更難控制溫度。筆者發(fā)現(xiàn)，用燒開的沸水進行封底，效果較好。只需將瓊脂板放入倒有沸水的器皿中，1min左右取出，冷卻即可。注意，當需要封底的瓊脂板較多時，要增加沸水量，以保證水溫在90℃～100℃之間。

3 加樣

瓊脂板上每組梅花形7孔中，中間1孔加入抗原，四周孔間隔（按1、3、5）加入標準陽性，其余孔（2、4、6）加入待檢血清。加樣前要在瓊脂板上標記日期和及編號。編號時可以用油性記號筆的細端直接在樣品孔對應的平板底面進行標記，只需標記樣品序號即可，這樣在加樣中可以避免樣品加錯，而且能提高加樣操作效率，特別適用于大量樣本操作。加樣量大概是每孔25μl左右，因為每個平板瓊脂孔容量會有不同，建議加樣時將移液器調(diào)到30μl，然后緩慢加入孔中，當加入液面與瓊脂孔周圍成水平時停止加樣，這樣不僅能避免加樣時產(chǎn)生氣泡，而且能保證每孔能剛好加滿。注意加入每個待檢血清樣品用一個吸頭，避免交叉污染，而且加樣時不要產(chǎn)生氣泡，如果有小氣泡可以先吸出氣泡，然后再加滿孔。樣品加完后靜置等待5min，使孔中液體吸干，再將平皿倒置放在濕盒內(nèi)，置于25℃～27℃恒溫箱進行反應。

4 結果判定

通常反應6h左右就開始出現(xiàn)沉淀線，12h沉淀線已經(jīng)比較明顯，已經(jīng)可以進行結果判定。判斷結果用時過久沉淀線會逐漸模糊甚至消失，可以在12h、24h做記錄，如結果無明顯差別，可作最終結果。

總之，每一個環(huán)節(jié)都有可能影響實驗結果的判定，這需要檢測工作者根據(jù)本實驗室具體情況進行操作總結，以制定出適合本實驗室的最優(yōu)檢測方案。

[1]盛曉輝.馬傳貧血病瓊脂凝膠免疫擴散試驗的方法[J].中國畜禽種業(yè)，2014，10（4）：105.