王小琦，孫 巖，張 洋，趙宏斌，李文輝

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，云南 昆明 650032；2.中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所，云南 昆明 650032)

斑馬魚(yú)模型在常見(jiàn)骨疾病研究中的應(yīng)用

王小琦1，2，孫 巖1，2，張 洋1，趙宏斌1，李文輝2

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，云南 昆明 650032；2.中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所，云南 昆明 650032)

斑馬魚(yú)作為一種新型的脊椎模式生物，近年來(lái)在人類(lèi)疾病模型中已廣泛應(yīng)用，特別是在人類(lèi)骨疾病模型的研究中已顯示出優(yōu)勢(shì)，如在疾病的相關(guān)基因及其功能表達(dá)和藥效篩選評(píng)價(jià)等方面。這對(duì)于在骨疾病領(lǐng)域發(fā)揮特色療效的傳統(tǒng)醫(yī)藥而言，也具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。本文就斑馬魚(yú)在骨質(zhì)疏松、骨折、骨關(guān)節(jié)炎等常見(jiàn)骨疾病中的研究應(yīng)用進(jìn)行綜述,以便給未來(lái)的臨床相關(guān)研究提供一定的思路。

斑馬魚(yú)；骨疾?。粍?dòng)物模型

上世紀(jì)70年代初，美國(guó)的遺傳學(xué)家Streisinger所領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)對(duì)斑馬魚(yú)進(jìn)行了遺傳篩選, 建立了純合品系，并于1981年率先在《Nature》雜志報(bào)導(dǎo)了斑馬魚(yú)的各種基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)[1]。90年代初，《Nature》 和《Science》均發(fā)表相關(guān)專(zhuān)題[2, 3]，確立斑馬魚(yú)為一種新型的模式生物，完全具備成為分子發(fā)育生物學(xué)甚至人類(lèi)基因組計(jì)劃脊椎動(dòng)物模式生物的條件。而后，德美兩國(guó)的發(fā)育生物學(xué)家與遺傳學(xué)家通過(guò)高通量篩選，鑒定出幾千種斑馬魚(yú)基因突變體，開(kāi)啟了斑馬魚(yú)基因功能研究[4, 5]。國(guó)內(nèi)于1998年在清華大學(xué)建立了第一個(gè)以斑馬魚(yú)為模式動(dòng)物的發(fā)育生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，開(kāi)啟了斑馬魚(yú)在我國(guó)的研究。2012年，國(guó)家斑馬魚(yú)資源中心(China Zebrafish Resource Center，CZRC)在中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所正式成立，提供斑馬魚(yú)研究相關(guān)的資源共享和技術(shù)服務(wù)。目前我國(guó)已有250 個(gè)以上的實(shí)驗(yàn)室利用斑馬魚(yú)開(kāi)展多學(xué)科領(lǐng)域的研究。令人振奮的是，斑馬魚(yú)已被美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院(NIH)列為繼人和小鼠之后的第三大模式生物，并被歐洲替代方法驗(yàn)證中心(ECVAM)推薦為新的替代動(dòng)物[6]。隨著研究的深入，目前斑馬魚(yú)模型在骨骼研究中的優(yōu)勢(shì)也逐漸突顯，國(guó)內(nèi)外專(zhuān)家紛紛開(kāi)展以斑馬魚(yú)為動(dòng)物模型的骨疾病研究，以期對(duì)多基因的復(fù)雜性骨疾病的病理機(jī)制和高通量藥物篩選進(jìn)行更深入細(xì)致的探究而為人類(lèi)骨健康創(chuàng)造一個(gè)美好的未來(lái)前景。本文就斑馬魚(yú)在骨質(zhì)疏松、骨折、骨關(guān)節(jié)炎等常見(jiàn)骨疾病中的研究應(yīng)用作一綜述,以便給臨床相關(guān)研究提供新的思路和指導(dǎo)。

1 斑馬魚(yú)的生物特點(diǎn)

1.1 斑馬魚(yú)的一般生物特性

以果蠅、線蟲(chóng)為代表的無(wú)脊椎動(dòng)物模型廣泛應(yīng)用于發(fā)育、遺傳及相關(guān)領(lǐng)域研究，并取得了令人矚目的發(fā)展，但它們?cè)谂咛ソY(jié)構(gòu)及器官形成等方面都與脊椎動(dòng)物存在差異，且一些器官缺乏基因同源性，導(dǎo)致人類(lèi)某些特征不能采用無(wú)脊椎動(dòng)物進(jìn)行研究[7]。此外，以嚙齒類(lèi)動(dòng)物、兔、犬、靈長(zhǎng)類(lèi)等為代表的脊椎動(dòng)物模型，雖可從整體水平直觀地模擬人的生理和病理過(guò)程，但存在費(fèi)用昂貴、飼養(yǎng)繁瑣、繁殖速度較慢、操作復(fù)雜且存在風(fēng)險(xiǎn)、實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、受到法律倫理的限制等弊端。斑馬魚(yú)作為一種脊椎動(dòng)物模式生物，以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)避免了其他脊椎動(dòng)物的缺點(diǎn)。Sanger研究院在2001年開(kāi)始對(duì)斑馬魚(yú)基因組測(cè)序[8]，于2009年完成全基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)其與人類(lèi)基因的相似度達(dá)到87%，而且兩者在基因和蛋白質(zhì)的序列、功能上都具有很高的保守性。斑馬魚(yú)的心血管、血液、消化道、肝臟、腎臟、骨骼系統(tǒng)以及生理功能毒性反應(yīng)方面與人類(lèi)有許多共同特點(diǎn)，為開(kāi)展比較醫(yī)學(xué)研究和建立人類(lèi)疾病動(dòng)物模型提供了重要基礎(chǔ)[9]。且斑馬魚(yú)具有飼養(yǎng)成本低、體積小、發(fā)育周期短、單次產(chǎn)卵數(shù)較高、胚胎體外發(fā)育且透明而可視、易獲突變體、施藥方式易操作、高通量篩選易實(shí)現(xiàn)等優(yōu)勢(shì)[10, 11]。由此，我們就可以便捷、經(jīng)濟(jì)、實(shí)時(shí)、有效地利用斑馬魚(yú)模型進(jìn)行正反向遺傳篩選法以及藥物誘導(dǎo)的方法，選擇合適的基因型建立疾病模型，進(jìn)行相應(yīng)研究。

1.2 斑馬魚(yú)的骨骼發(fā)育特點(diǎn)

斑馬魚(yú)在骨骼發(fā)育方面與人類(lèi)極其相似，其骨發(fā)育與人類(lèi)骨生物礦化作用基本一致，存在軟骨內(nèi)骨化過(guò)程，發(fā)育完整的斑馬魚(yú)骨擁有與人類(lèi)長(zhǎng)骨一致的分層結(jié)構(gòu)[12]。此外，斑馬魚(yú)與人類(lèi)在骨骼生長(zhǎng)發(fā)育的分子機(jī)理方面也極為相似；參與人類(lèi)成骨作用的BMP和Wnt信號(hào)通路被證實(shí)也存在于斑馬魚(yú)中；而且參與斑馬魚(yú)骨發(fā)育調(diào)控的關(guān)鍵基因—runx2、osteoprogenin(BMP-3) 與哺乳動(dòng)物也具有高度的同源性。由此推斷，以斑馬魚(yú)為骨疾病模型做的相關(guān)實(shí)驗(yàn)在多數(shù)情況下也是適用于人類(lèi)的。因此，國(guó)內(nèi)外專(zhuān)家在此方面做了大量研究，并取得了令人矚目的成果。2005年，F(xiàn)leming[13]首次通過(guò)在培養(yǎng)水體中加入對(duì)哺乳動(dòng)物有效的促骨形成藥物維生素D3類(lèi)似物和甲狀旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)，觀察斑馬魚(yú)幼魚(yú)頭部骨骼的發(fā)育狀況，與哺乳動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,從而證實(shí)了斑馬魚(yú)為有效篩選促骨合成代謝藥物的動(dòng)物模型系統(tǒng)，而且與嚙齒類(lèi)動(dòng)物模型相比，假陽(yáng)性和假陰性發(fā)生率更小。而在成年斑馬魚(yú)骨骼發(fā)育不良的正向遺傳篩選中，Nan Li[14]以膠原蛋白Ⅰα1基因突變?yōu)榘悬c(diǎn)，成功模擬了人類(lèi)的成骨不全癥，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了Runx2基因、Osx基因、骨基質(zhì)基因的順序表達(dá)，以及成骨細(xì)胞分化所需的轉(zhuǎn)錄調(diào)控體系與哺乳動(dòng)物保持著一致性。隨后，Yang等[15]還發(fā)現(xiàn)，給斑馬魚(yú)胚胎注射與runx2b的表達(dá)相關(guān)的twist1a和twist1b mRNA 后，runx2b的表達(dá)被抑制，骨發(fā)育受阻；而敲除twist1a和twist1b基因后，runx2b表達(dá)增加，骨發(fā)育能力也相應(yīng)增加，為人類(lèi)骨骼發(fā)育疾病的治療提供新的研究靶點(diǎn)。最近，Pasqualetti S等[16]通過(guò)對(duì)成骨細(xì)胞特異標(biāo)記物(堿性磷酸酶)和魚(yú)鱗外觀形狀特征的研究，發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)魚(yú)鱗在分析成骨細(xì)胞在骨形成、骨礦化期間的行為是一種很好的模式樣本。由此可見(jiàn)，斑馬魚(yú)在篩選與骨發(fā)育疾病相關(guān)的靶向基因和有效藥物中，是一個(gè)強(qiáng)大的工具。

2 研究方法

以上述斑馬魚(yú)生物特點(diǎn)為基礎(chǔ)，國(guó)內(nèi)外研究人員已經(jīng)利用組織染色、轉(zhuǎn)基因技術(shù)以及影像學(xué)檢測(cè)對(duì)斑馬魚(yú)骨骼系統(tǒng)進(jìn)行了更全面的研究，從而為骨疾病相關(guān)研究提供堅(jiān)實(shí)的技術(shù)基礎(chǔ)。

2.1 組織染色

斑馬魚(yú)的胚胎發(fā)育全程透明、幼魚(yú)呈半透明，可觀察到器官形成。因此借助立體顯微鏡，熒光染色后就可清晰觀察到早期發(fā)育的骨骼。組織染色技術(shù)已廣泛應(yīng)用于對(duì)斑馬魚(yú)模型的研究。其中，骨骼固定染色是最經(jīng)典、可靠的方法, 適用于分析幼魚(yú)及成魚(yú)骨骼。目前國(guó)際上多采用阿辛藍(lán)、茜素紅復(fù)合染色法，較為公認(rèn)的方法是Dingerkus and Uhler的傳統(tǒng)染色法和MB Walke的無(wú)酸染色法。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)的張燕麗研究團(tuán)隊(duì)[17]根據(jù)斑馬魚(yú)的骨骼發(fā)育特點(diǎn)對(duì)上述染色方法進(jìn)行了改進(jìn)，即對(duì)不同發(fā)育階段的斑馬魚(yú)分別采用無(wú)酸染色法和雙染色法(傳統(tǒng)染色法+無(wú)酸染色法)染色，發(fā)現(xiàn)雖然兩種方法均可將其軟骨染為藍(lán)色，但仍存在一定差異。對(duì)于15 d內(nèi)的斑馬魚(yú)，由于骨礦化不完全，無(wú)酸染色法較適合；而對(duì)于15 d以上的斑馬魚(yú)，由于骨礦化程度高，運(yùn)用雙染色法更有利于突出其骨骼特征。利用張燕麗團(tuán)隊(duì)的方法，可更直觀地反映斑馬魚(yú)骨化程度的改變及骨化次序，有利于在骨疾病研究中分析影響骨發(fā)育的因素。而Du SJ等人[18]在建立篩選斑馬魚(yú)胚胎骨骼發(fā)育突變體的可視化方法研究中發(fā)現(xiàn)，特異性地結(jié)合含鈣骨結(jié)構(gòu)的鈣黃綠素?zé)晒馊旧攸c(diǎn)與所檢測(cè)的骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP2)的表達(dá)一致，以此從骨骼發(fā)育正常的斑馬魚(yú)中篩選出有缺陷的突變體。因此他們認(rèn)為與阿辛藍(lán)染色劑相比，鈣黃綠素?zé)晒馊旧珓┰诎唏R魚(yú)胚胎骨骼發(fā)育及其對(duì)骨發(fā)育缺陷突變體的有效可視化篩選中更具敏感性和兼容性。最近，國(guó)內(nèi)張姍姍等[19]首次采用鈣黃綠素染色法，分別對(duì)用于骨關(guān)節(jié)炎的氨基葡萄糖鹽酸鹽和骨質(zhì)疏松的淫羊藿提取物進(jìn)行促斑馬魚(yú)幼魚(yú)骨礦化的活性評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)此方法具有實(shí)驗(yàn)周期短、染色時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單且對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)毒性低等優(yōu)點(diǎn)，而具有早期、快速篩選促骨礦化藥物的可行性。當(dāng)然，對(duì)斑馬魚(yú)不同形態(tài)發(fā)育階段及各階段不同時(shí)期的骨骼染色采用何種染色方法，還需更多的研究進(jìn)一步證實(shí)，從而在提高實(shí)驗(yàn)效率的同時(shí)，也可推廣活體染色可視化的應(yīng)用。

2.2 轉(zhuǎn)基因技術(shù)

轉(zhuǎn)基因技術(shù)可在時(shí)空上特異地表達(dá)或關(guān)閉特定基因，利用這類(lèi)技術(shù)可更確切地研究目標(biāo)基因及相關(guān)生物學(xué)過(guò)程。近年來(lái)，此技術(shù)也逐漸應(yīng)用于對(duì)斑馬魚(yú)骨疾病模型的研究，為此領(lǐng)域帶來(lái)新突破。2006年， Rembold等[20]首次發(fā)現(xiàn)將報(bào)告基因插入到骨骼組織特異的啟動(dòng)子后,即可篩選出穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)，實(shí)時(shí)、直接的觀測(cè)斑馬魚(yú)骨骼發(fā)育機(jī)制及相關(guān)基因的聯(lián)系，而開(kāi)啟了轉(zhuǎn)基因技術(shù)在斑馬魚(yú)骨骼發(fā)育研究中的應(yīng)用。俄勒岡大學(xué)的Delaurier A研究組[21]于2010年，利用轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)品系——Tg(sp7:EGFP)b1212，發(fā)現(xiàn)標(biāo)記成骨和軟骨細(xì)胞的Sp7基因在幼魚(yú)耳囊泡、骨骼的發(fā)育中及成魚(yú)斷鰭后的再生中表達(dá)，表明這一品系為研究耳囊泡的形成、骨骼發(fā)育和骨再生提供了一個(gè)基本的工具。最近，Mitchell RE等人[22]通過(guò)構(gòu)建一種新的斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)基因品系——Tg(Col10α1BAC: mCitrine)，真實(shí)地模擬Col2a1a和Col10a1在肥大軟骨細(xì)胞的可視化內(nèi)源性表達(dá)，用于實(shí)時(shí)追蹤其肥大軟骨細(xì)胞在骨骼發(fā)育過(guò)程中的功能，從而應(yīng)用于人類(lèi)骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)疾病模型中。此實(shí)驗(yàn)表明，此轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)品系可作為研究骨關(guān)節(jié)炎遺傳學(xué)的新工具，并有望用于其他軟骨遺傳疾病，如遺傳性多發(fā)性骨軟骨瘤(multiple hereditary exostoses，MHE)。目前，在國(guó)家斑馬魚(yú)資源中心(China Zebrafish Resource Center，CZRC)，我們可以根據(jù)研究需求獲得與骨疾病相關(guān)的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)資源。如Tg(-2.2col10a1a:GFP)，用于標(biāo)記來(lái)自成骨細(xì)胞的骨結(jié)構(gòu)；Tg(UAS:bmp2b-UTRnanos3)，標(biāo)記骨形態(tài)發(fā)生蛋2b (BMP-2b)；Tg(UAS:dnbmpr1aaUTRnan-os3)，標(biāo)記骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體IAa (BMPR-IAa)；Tg(UAS:wnt8a-UTRnanos3)，標(biāo)記與骨形成密切相關(guān)的信號(hào)通路Wnt8a；而Tg(UAS:fgf8a-UTRnanos3)，與顱腦軟骨發(fā)育相關(guān)。我們可以利用這些轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)品系，評(píng)估相應(yīng)基因及編碼蛋白的功能，創(chuàng)建相應(yīng)的疾病模型，也可根據(jù)其構(gòu)建新的轉(zhuǎn)基因品系，為骨疾病的研究創(chuàng)造更好的技術(shù)平臺(tái)。

2.3 影像學(xué)檢查

影像學(xué)檢查具有快捷方便、直觀精確的特點(diǎn)。如雙能X線吸收法(dual-energy X-ray absorptiometry，DXA)是骨密度測(cè)定的金標(biāo)準(zhǔn)，而顯微CT (Micro-CT)是一種可以在不破壞樣本的情況下清楚了解樣本的內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu),直接評(píng)估骨骼結(jié)構(gòu)的方法, 其分辨率可達(dá)到15 μm, 通過(guò)三維重建可獲得骨骼的三維結(jié)構(gòu)及其參數(shù)。2009年，華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)部的Green等人[23]將雙能X線吸收法、顯微CT等技術(shù)運(yùn)用于斑馬魚(yú)成魚(yú)突變體的研究，可更精確地得到骨密度、礦物質(zhì)含量等組織染色無(wú)法測(cè)量的參數(shù)，這樣就能為斑馬魚(yú)疾病模型及后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供更有力的科學(xué)依據(jù)。梅西大學(xué)的Bruneel B和Witten PE[24]在2015年回顧了X光、Micro-CT、光學(xué)投影層析和活體成像技術(shù)在斑馬魚(yú)骨骼可視化技術(shù)應(yīng)用中的優(yōu)點(diǎn)和局限性，最后還探討了光片照明顯微鏡 (light-sheet fluorescence microscopy) 在斑馬魚(yú)骨骼分析中應(yīng)用的可能性。表明了影像可視化技術(shù)在斑馬魚(yú)骨骼分析中更精確的發(fā)展，斑馬魚(yú)模式生物在骨骼發(fā)育模型的研究應(yīng)用中就更有價(jià)值。

3 斑馬魚(yú)在骨疾病領(lǐng)域的研究應(yīng)用

3.1 骨質(zhì)疏松

骨質(zhì)疏松是以骨量減低、骨顯微結(jié)構(gòu)退化、骨脆性增高、易發(fā)生骨折為特征的全身代謝性骨疾病，而糖皮質(zhì)激素是引起骨質(zhì)疏松、增加骨折風(fēng)險(xiǎn)的常見(jiàn)因素。因此，國(guó)內(nèi)外許多專(zhuān)家建立以糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松的斑馬魚(yú)模型，并開(kāi)展后續(xù)研究。2006年，Barrett R等[25]首次采用不同濃度潑尼松龍作用不同時(shí)間，創(chuàng)建斑馬魚(yú)骨質(zhì)疏松模型，并最終確定潑尼松龍建模的最佳濃度為25 μM，最佳暴露時(shí)間為斑馬魚(yú)受精后4～5 h，且連續(xù)作用5 d；隨后還驗(yàn)證了藥物RU486和雙膦酸鹽作用于骨質(zhì)疏松模型后，斑馬魚(yú)骨量得到恢復(fù)，進(jìn)一步表明糖皮質(zhì)激素發(fā)揮作用是通過(guò)糖皮質(zhì)激素受體介導(dǎo)的，也為目前廣泛應(yīng)用于骨質(zhì)疏松治療的雙膦酸鹽提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。而后，有國(guó)外研究人員利用此動(dòng)物模型，對(duì)目前常用藥物阿侖膦酸鈉和依替膦酸鈉的抗骨質(zhì)疏松藥效進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室藥效評(píng)價(jià)，證實(shí)其與臨床應(yīng)用一致。而Siccardi 等[12]在1月齡斑馬魚(yú)的飲食中添加不同濃度的鍶鹽，采用Micro-CT 檢測(cè)12周后的骨密度，發(fā)現(xiàn)隨鍶鹽濃度增加，骨密度亦相應(yīng)增加。這些研究都與臨床研究結(jié)果一致，亦提示斑馬魚(yú)骨質(zhì)疏松模型對(duì)骨質(zhì)疏松的治療具有臨床用藥指導(dǎo)價(jià)值。國(guó)外研究還發(fā)現(xiàn)[26]，使用糖皮質(zhì)激素可導(dǎo)致斑馬魚(yú)魚(yú)鱗再生的缺損，且成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞中與骨質(zhì)疏松相關(guān)基因的表達(dá)改變，與骨質(zhì)疏松的病理機(jī)制一致。自2012年后，國(guó)內(nèi)的研究團(tuán)隊(duì)[27-30]也分別建立了地塞米松、潑尼松龍誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)骨質(zhì)疏松模型，先后用此類(lèi)模型對(duì)西藥依替膦酸二鈉，中藥淫羊藿、續(xù)斷的代表成分以及復(fù)方接骨湯進(jìn)行了抗骨質(zhì)疏松活性評(píng)價(jià)，并采用計(jì)算斑馬魚(yú)頭骨礦化面積等數(shù)據(jù)，檢測(cè)淫羊藿黃酮對(duì)骨骼生長(zhǎng)的促進(jìn)作用，結(jié)果與已有的大鼠或細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致，進(jìn)一步揭示斑馬魚(yú)骨質(zhì)疏松模型可用于高通量篩選防治骨質(zhì)疏松的藥物，對(duì)臨床的指導(dǎo)具有合理性。

3.2 骨折修復(fù)與再生

斑馬魚(yú)的鰭相當(dāng)于人類(lèi)的四肢，又因尾鰭結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易于手術(shù)操作、損傷后不影響生存和便于觀察等特點(diǎn),成為目前研究器官再生及骨折修復(fù)的重要部位。早在2003年，就有研究表明斑馬魚(yú)魚(yú)鰭有較強(qiáng)的再生能力，成年斑馬魚(yú)尾鰭被截?cái)嗪?，可重新激活骨分化信?hào)，使受損傷的骨骼、血管、神經(jīng)、結(jié)締組織及表皮得到修復(fù)[31]。2006年底，美國(guó)華盛頓州立大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)也通過(guò)對(duì)斑馬魚(yú)模型的研究，發(fā)現(xiàn)Wnt/β-Catenin信號(hào)通路可促進(jìn)斑馬魚(yú)尾鰭的再生，相關(guān)蛋白Wnt8對(duì)成骨細(xì)胞增殖起到增強(qiáng)作用，而由Wnt5b激活的細(xì)胞信號(hào)通路可關(guān)閉由Wnt/β-Catenin開(kāi)啟的基因，削弱成骨細(xì)胞的再生能力。斑馬魚(yú)機(jī)體通過(guò)開(kāi)啟或關(guān)閉這些基因來(lái)調(diào)控成骨細(xì)胞的增殖狀態(tài)，從而調(diào)節(jié)尾鰭再生。而Sousa等[32]于2013年發(fā)表文章證實(shí)了斑馬魚(yú)鰭的擠壓骨折與人類(lèi)骨折更為相似，當(dāng)魚(yú)鰭受到擠壓時(shí)，骨細(xì)胞開(kāi)始發(fā)生沉積，與骨發(fā)育相關(guān)的基因表達(dá)減緩，而骨橋蛋白、肌腱蛋白-C 表達(dá)時(shí)間延遲，這些表現(xiàn)與人類(lèi)骨折修復(fù)機(jī)理都非常接近。因此，斑馬魚(yú)擠壓骨折模型較截?cái)嗄Ｐ湍芨玫哪M哺乳動(dòng)物創(chuàng)傷引起的骨折，有助于此類(lèi)骨折修復(fù)研究。De Vrieze 等[33] 通過(guò)研究在細(xì)胞外基質(zhì)中與發(fā)育和再生相關(guān)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)換酶——基質(zhì)金屬蛋白酶 (Matrix，metalloproteinases，MMPs)，發(fā)現(xiàn)其可影響斑馬魚(yú)鱗片在再生過(guò)程中的重建，證實(shí)斑馬魚(yú)魚(yú)鱗再生模型可很好的應(yīng)用于研究骨發(fā)育、再生、重建的機(jī)制。此外，Geurtzen K等[34]通過(guò)分析斑馬魚(yú)斷鰭和骨折以及顱骨損傷模型，闡明了成骨細(xì)胞去分化可提高骨愈合的機(jī)制。上述研究均體現(xiàn)了斑馬魚(yú)骨創(chuàng)傷模型，將有助于了解骨折修復(fù)和再生的關(guān)鍵機(jī)制，為骨折的修復(fù)再生帶來(lái)新的思路。

3.3 骨關(guān)節(jié)炎

斑馬魚(yú)在骨關(guān)節(jié)炎(OA)模型中的應(yīng)用研究相對(duì)較晚，國(guó)外也鮮見(jiàn)報(bào)道。越來(lái)越多的證據(jù)表明，OA的易患因素中遺傳因素約占一半，而斑馬魚(yú)是理想的發(fā)育生物學(xué)和遺傳學(xué)模式生物。由此推斷，將斑馬魚(yú)模型運(yùn)用于骨關(guān)節(jié)炎的研究將有助于闡明該病的發(fā)生機(jī)制。Mitchell[22]等以轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)為模型，首次采用分析OA相關(guān)基因Mcf2l的時(shí)空表達(dá)模式，表明了Mcf2l在軟骨發(fā)育上的功能。此外，還對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)中六個(gè)OA易感基因的表達(dá)進(jìn)行了篩選。說(shuō)明轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)模型在OA相關(guān)基因的功能研究方面的實(shí)用性，并可將其用于高通量篩選研究項(xiàng)目。萊頓大學(xué)醫(yī)學(xué)中心的Wiweger團(tuán)隊(duì)[35]發(fā)現(xiàn)在骨軟骨瘤和骨性關(guān)節(jié)炎中，蛋白多糖上的糖胺聚糖(GAGs)在結(jié)構(gòu)和組成上都發(fā)生了變化，并采用斑馬魚(yú)突變體分析了五種參與蛋白多糖合成的基因，表明了各個(gè)基因所決定的表型：dackel與軟骨形態(tài)；hi307與細(xì)胞外基質(zhì)的組成；pinscher與細(xì)胞外基質(zhì)的超微結(jié)構(gòu)；hi954與軟骨細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)；Knypek在Simpson-Golabi-Behmel綜合征顱面表型中的表達(dá)，支持了磷脂酰肌醇蛋白多糖4(GPC4)的參與。此外，他們推測(cè)骨骼發(fā)育不良可能與slc35b2，β3gat3和uxs1表達(dá)有關(guān)。這項(xiàng)研究促進(jìn)了利用斑馬魚(yú)作為一種人類(lèi)骨骼發(fā)育和相關(guān)病理學(xué)研究的動(dòng)物模型，并證實(shí)斑馬魚(yú)可作為研究人類(lèi)病因復(fù)雜的骨疾病的理想模型。

4 展望

斑馬魚(yú)的諸多優(yōu)點(diǎn)，使其經(jīng)過(guò)幾十年的研究發(fā)展，積累了很多研究成果，也建立了一系列技術(shù)平臺(tái)，從而在人類(lèi)骨疾病的相關(guān)基因、功能研究及其藥效篩選和評(píng)價(jià)中，成為一個(gè)可靠工具。作為一種新興的脊椎模式生物，斑馬魚(yú)的基因與人類(lèi)更加相似，在鑒定和分析調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育和器官發(fā)生的未知基因、人類(lèi)疾病的基因治療和藥物開(kāi)發(fā)等方面都將 發(fā)揮重要作用，從而帶動(dòng)整個(gè)生命科學(xué)的變革和發(fā)展。對(duì)于以經(jīng)方驗(yàn)方為特色的我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥而言，通過(guò)斑馬魚(yú)模型，可深入研究傳統(tǒng)醫(yī)藥的體內(nèi)代謝特點(diǎn)及其在骨形成信號(hào)通路中的調(diào)控機(jī)制，從而有力推動(dòng)我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥得到國(guó)際認(rèn)可。

但斑馬魚(yú)模型還存在一些問(wèn)題有待深入研究。如它缺少哺乳動(dòng)物的一些器官，如：肺、皮膚、前列腺和乳腺，使其生物代謝過(guò)程與人存在差異性。以斑馬魚(yú)作為模式生物進(jìn)行骨疾病模型及藥物篩選、藥效評(píng)價(jià)的研究報(bào)道相對(duì)較少，特別是與已深入基因水平的國(guó)外研究相比，國(guó)內(nèi)剛剛起步，研究成果不多；斑馬魚(yú)缺乏滑膜關(guān)節(jié)，因此不能在此模型中充分研究參與滑膜關(guān)節(jié)形成的基因；此外，斑馬魚(yú)有20%相對(duì)于人類(lèi)的的基因存在兩個(gè)同源基因，導(dǎo)致兩者基因絕對(duì)相似度沒(méi)有87%；斑馬魚(yú)模型與現(xiàn)有模型研究的相關(guān)性，以及斑馬魚(yú)模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性和重復(fù)性也不十分明朗等?？紤]到這些潛在的不足，我們并不是以期斑馬魚(yú)短期內(nèi)取代經(jīng)典的哺乳動(dòng)物模型，而是在以脊椎動(dòng)物為模式生物的骨疾病模型及其藥物開(kāi)發(fā)研究中做一名探路者。

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Application of zebrafish models in the research on bone diseases

WANG Xiao-qi1，2, SUN Yan1，2,ZHANG Yang1, ZHAO Hon-bin1,LI Wen-hui2

(1. First Affiliated Hospital, Kunming Medical University, Kunming 650032, China; 2. Kunming Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Kunming 650032)

Zebrafish (Daniorerio), as a new vertebrate model organism, has been widely used in human disease research in recent years, especially in the study of human bone diseases. The zebrafish models show some advantages, such as expression of disease-related genes and application in pharmacodynamic screening and evaluation, etc. It is also of great practical significance for the traditional medicine, which has a characteristic efficacy in the treatment of bone diseases. This paper reviews the research and application of zebrafish in research on bone diseases such as osteoporosis, fracture, osteoarthritis, and so on, aiming to provide some inspiration for the future clinically relevant research.

Zebrafish; Bone diseases; Animal models

國(guó)家自然科學(xué)基金委-云南省人民政府聯(lián)合基金項(xiàng)目(編號(hào)：U150220034)。

王小琦(1984-)，女，碩士研究生，研究方向：骨質(zhì)疏松及骨質(zhì)疏松后骨折，E-mail：287253120@qq.com。

趙宏斌(1967-)，男，主任醫(yī)師，研究方向：骨質(zhì)疏松和民族醫(yī)藥學(xué)，E-mail：596829191@qq.com；李文輝(1967-)，男，研究員，研究方向：動(dòng)物活性多肽，E-mail：leewh@mail.kiz.ac.cn。

綜述與專(zhuān)論

R-33

A

1671-7856(2017) 06-0086-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.06.018

2016-11-15