陳 剛，周 欣，薛文達(dá)，吳顥昕

(南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院轉(zhuǎn)化系統(tǒng)生物學(xué)與神經(jīng)科學(xué)研究中心，中醫(yī)腦病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210023)

【綜述】

全基因組關(guān)聯(lián)分析在中醫(yī)證候研究中的應(yīng)用展望*

陳 剛，周 欣，薛文達(dá)，吳顥昕

(南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院轉(zhuǎn)化系統(tǒng)生物學(xué)與神經(jīng)科學(xué)研究中心，中醫(yī)腦病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210023)

中醫(yī)證候的科學(xué)本質(zhì)是中醫(yī)基礎(chǔ)研究中的核心內(nèi)容，也是揭開(kāi)中醫(yī)辨證論治個(gè)性化治療奧秘的關(guān)鍵，但目前對(duì)其的認(rèn)識(shí)仍然有限。通過(guò)介紹復(fù)雜性狀遺傳學(xué)的基本概念，提出將證候作為生命活動(dòng)表現(xiàn)的復(fù)雜性狀，運(yùn)用復(fù)雜性狀遺傳學(xué)研究手段，特別是當(dāng)前迅速發(fā)展的全基因組關(guān)聯(lián)分析(Genome-wide association study，GWAS)方法，以解析證候個(gè)體化差異的分子遺傳基礎(chǔ)。除了進(jìn)行人群的證候GWAS研究，還可利用遺傳參照種群小鼠資源進(jìn)行證候的分子及系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)GWAS研究。故展望了在中醫(yī)基礎(chǔ)研究中利用模式動(dòng)物建構(gòu)合適的中醫(yī)病-證模型進(jìn)行GWAS研究的廣闊前景，該方法的推廣應(yīng)用將在新的方向上推動(dòng)中醫(yī)基礎(chǔ)研究的發(fā)展。

證候;復(fù)雜性狀遺傳學(xué);全基因組關(guān)聯(lián)分析;遺傳參照種群小鼠;模型

中醫(yī)的特色及優(yōu)勢(shì)在于整體觀念和辨證論治，即在系統(tǒng)了解疾病與患者特點(diǎn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)望聞問(wèn)切等手段辨識(shí)證候段，對(duì)證遣方用藥。證候是生命活動(dòng)的外在表現(xiàn)，體現(xiàn)出疾病病理的時(shí)空維度。證候本質(zhì)的研究是中醫(yī)學(xué)現(xiàn)代研究的核心，也是最有挑戰(zhàn)性的領(lǐng)域，一定程度上是制約中醫(yī)基礎(chǔ)理論學(xué)科乃至整個(gè)中醫(yī)學(xué)科現(xiàn)代發(fā)展的最主要因素［1］。揭示證候的生物學(xué)基礎(chǔ)對(duì)確立證候科學(xué)內(nèi)涵與闡明證候科學(xué)本質(zhì)不可或缺。盡管經(jīng)過(guò)多年的研究和探索，目前對(duì)證候的特點(diǎn)和機(jī)制有了一定的了解，但是由于病證機(jī)理復(fù)雜，特別是研究思想、方法與手段上的限制，對(duì)證候本質(zhì)的認(rèn)識(shí)仍然不夠深入。

1 中醫(yī)證候的特點(diǎn)及其復(fù)雜性

一般認(rèn)為，證候既反映疾病在同一個(gè)體上的階段性病理生理變化，具有鮮明的時(shí)相性特征;同一階段內(nèi)在不同人群中又有證候類(lèi)型之別，反映出空間性特征。證候的差異性來(lái)自于遺傳與環(huán)境共同作用，是遺傳物質(zhì)對(duì)生命活動(dòng)生物整體層面的表現(xiàn)。這種表現(xiàn)可以像任何可測(cè)量的物理或生物化學(xué)特征一樣進(jìn)行分析，該分析方法通常被稱(chēng)為“表現(xiàn)型”或“表型”(phenotype)分析。理論上，所有個(gè)體間的某表型差異可以通過(guò)與基因型的差異性進(jìn)行聯(lián)系，以解析基因型如何參與決定該表型。因此，可以運(yùn)用現(xiàn)代遺傳學(xué)技術(shù)，以證候的相關(guān)表型為研究對(duì)象，鑒別與說(shuō)明證候的分子遺傳基礎(chǔ)從而揭示其生物學(xué)本質(zhì)。

證候的復(fù)雜性決定了其表型分析需要運(yùn)用復(fù)雜性狀遺傳學(xué)(complex trait genetics)的方法［2］。在生物界，大多數(shù)疾病表型均是復(fù)雜性狀，受多種基因(polygenic)及其與環(huán)境相互作用的影響，而不是簡(jiǎn)單地遵循孟德?tīng)栠z傳，即單基因(質(zhì)量性狀)遺傳。數(shù)量眾多但是單個(gè)效果比較小的基因，及他們與環(huán)境的相互作用常常使表現(xiàn)型呈連續(xù)(數(shù)量)分布。因此，對(duì)此類(lèi)性狀的研究稱(chēng)為數(shù)量性狀遺傳學(xué)或復(fù)雜性狀遺傳學(xué)［3］。經(jīng)典的孟德?tīng)栠z傳學(xué)的觀點(diǎn)認(rèn)為，1種性狀(trait)是由1種基因控制的，某種基因的缺陷足以導(dǎo)致特定的障礙［4］。但是人體大部分性狀并不遵循孟德?tīng)枂位蜻z傳規(guī)律，如高血壓［5］、青光眼［6］等疾病都表現(xiàn)為復(fù)雜性狀。某種特定中醫(yī)證候在人群個(gè)體間常常在程度或范圍上有所差異，很少是全或者無(wú)這種典型的質(zhì)量性狀表現(xiàn)。由此，大部分中醫(yī)證候都應(yīng)歸于復(fù)雜性狀。

2 復(fù)雜性狀遺傳學(xué)研究方法及其在中醫(yī)證候研究中的應(yīng)用

復(fù)雜性狀遺傳學(xué)在研究方法上主要有兩類(lèi)。傳統(tǒng)的復(fù)雜性狀遺傳學(xué)通過(guò)雙生子、收養(yǎng)子家系研究來(lái)探索遺傳對(duì)特定性狀的貢獻(xiàn)率［7］。幾十年來(lái)的研究結(jié)果充分說(shuō)明，遺傳因素影響著幾乎所有的復(fù)雜性狀。遺傳變異對(duì)許多復(fù)雜性狀，如對(duì)行為影響的遺傳度估計(jì)值大多在0.4～0.6之間［8］，也就是說(shuō)，表現(xiàn)型變異的40%至60%是由遺傳差異性決定的。已有研究者提出運(yùn)用雙生子研究中醫(yī)證候［9］。通過(guò)家系的基因型連鎖研究(linkage studies)方法［10］，可以篩查出影響特定性狀的某個(gè)染色體區(qū)域，甚至可以精確定位影響該形狀的特定基因。然而大多數(shù)復(fù)雜性狀往往牽涉很多微效基因，單獨(dú)的連鎖研究很難鑒定這些微效基因?，F(xiàn)在常通過(guò)結(jié)合基因組、基因表達(dá)、蛋白質(zhì)相互作用等信息來(lái)幫助鑒別特定染色體片段內(nèi)的候選基因［11］。這種方法被稱(chēng)為系統(tǒng)遺傳學(xué)方法(systems genetics)［12］。另一種方法稱(chēng)為關(guān)聯(lián)研究(association studies)［13］。該研究方法直接將性狀的差異性與基因序列的差異性進(jìn)行關(guān)聯(lián)。如目前迅猛發(fā)展的全基因組關(guān)聯(lián)分析(Genome-wide association study;GWAS)，應(yīng)用基因組中數(shù)以百萬(wàn)計(jì)由單個(gè)核苷酸變異所引起的變異DNA序列為分子遺傳標(biāo)記，進(jìn)行全基因組水平的對(duì)照分析或相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)影響復(fù)雜性狀的基因變異［14］。從2005年《科學(xué)》雜志報(bào)道了第1篇重要的GWAS研究論文，到現(xiàn)在10年的時(shí)間里，GWAS研究成果呈爆炸性增長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)了許多影響不同疾病的基因。GWAS相對(duì)于連鎖研究的優(yōu)勢(shì)是能直接鑒定影響特定表型的基因或DNA序列。此方法可以直接對(duì)證候、體質(zhì)等不同中醫(yī)表型與全基因組范圍的遺傳變異性直接關(guān)聯(lián)，可作為解析影響中醫(yī)證候分子基礎(chǔ)的非常有力的工具。此分析不需要對(duì)所研究對(duì)象的機(jī)制作任何假設(shè)，這對(duì)中醫(yī)證候研究特別重要而有用，因?yàn)樵S多證候產(chǎn)生的原因及其細(xì)胞和組織病位生理基礎(chǔ)都不明確。目前證候的GWAS臨床研究從技術(shù)手段上是具備的，還應(yīng)盡早開(kāi)展相關(guān)研究。

3 利用模式動(dòng)物進(jìn)行中醫(yī)證候GWAS研究的展望

除人群研究之外，還可以從合適的動(dòng)物模式系統(tǒng)進(jìn)行證候的GWAS研究。在各種人群研究中，即使在實(shí)驗(yàn)控制的條件下，也很難獲得大量的有關(guān)疾病所涉病位的組織樣本進(jìn)行分子機(jī)制上的分析(如進(jìn)行心臟或腦區(qū)的基因表達(dá))。因此需要嚴(yán)格控制的基因組和環(huán)境，又忠實(shí)地反映群體的遺傳復(fù)雜性及個(gè)體差異性的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。在這方面，模式動(dòng)物特別是小鼠具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。小鼠的基因組85%以上與人相似［15］，目前各國(guó)研究者已經(jīng)培育出幾百種基因組系統(tǒng)變化的遺傳參照品系，在研究復(fù)雜性狀遺傳學(xué)上發(fā)揮了基礎(chǔ)性的作用。運(yùn)用小鼠進(jìn)行復(fù)雜性狀的GWAS研究不僅理論與實(shí)踐上可行，其研究成果也在《自然—遺傳綜述》等雜志上引起廣泛關(guān)注，成為一個(gè)重要方向［16］。充分利用小鼠遺傳信息優(yōu)勢(shì)，對(duì)不同品系的近交系小鼠及重組近交系(由2種近交系小鼠雜交重組后產(chǎn)生的近交系)小鼠進(jìn)行分型，是眾多小鼠GWAS研究方法中應(yīng)用性最強(qiáng)的方法。其最大的優(yōu)點(diǎn)是，由于每個(gè)近交系小鼠品系的基因型信息是確定一致的，只需要進(jìn)行一次基因分型，這樣便可以節(jié)省大筆用于基因分型的費(fèi)用。其次，近交系及其雜交子一代小鼠具有同基因(isogenic)性，便于獲得穩(wěn)定的基底及造模表型值，提高了關(guān)聯(lián)分析的精確性和有效性。為增加遺傳統(tǒng)計(jì)效力，還使用了重組近交系小鼠，目前約300多種。其中種群數(shù)量最多、研究使用也最廣的是由C57BL/6J和DBA/2J 2個(gè)品系衍生而來(lái)的BXD重組近交小鼠品系［17］，已有100多種，以該品系為基礎(chǔ)的genenetwork．org網(wǎng)站已成為分析基因網(wǎng)絡(luò)遺傳調(diào)控的重要工具和數(shù)據(jù)庫(kù)［18］。近年來(lái)，國(guó)際上還進(jìn)一步將多種近交系進(jìn)行重組近交，獲得了遺傳多樣性和重組性大為增強(qiáng)的新一代重組近交系小鼠(collaborative cross)［19］。這些基因組各異但是遺傳信息確定的小鼠共同組成了遺傳參照種群［20］，可以利用不同水平的遺傳參照種群小鼠進(jìn)行多元化的全基因組關(guān)聯(lián)研究。

小鼠是中醫(yī)證候研究的主要模式動(dòng)物之一，目前已經(jīng)積累了大量的研究資料，部分證候模型的有效性也獲得了多方面的驗(yàn)證［21］。如方肇勤研究組對(duì)小鼠的四診模型進(jìn)行了探索，結(jié)果顯示小鼠可表現(xiàn)出與臨床相似的中醫(yī)證候，并在標(biāo)準(zhǔn)化、客觀化和數(shù)量化上體現(xiàn)出特定優(yōu)勢(shì)［22］。他們以及其他研究人員還進(jìn)行了不同小鼠品系的比較，發(fā)現(xiàn)了品系間中醫(yī)證候表現(xiàn)的差異，提示遺傳對(duì)病證差異性的影響［23］。通過(guò)對(duì)中醫(yī)證候表現(xiàn)可重復(fù)性的量化分析，將其基因組變異性與其基因表達(dá)組、蛋白組等差異性進(jìn)行關(guān)聯(lián)，還可以從系統(tǒng)水平揭示中醫(yī)證候易感性的物質(zhì)基礎(chǔ)及中醫(yī)辨證論治個(gè)性化醫(yī)療的生物學(xué)本質(zhì)。而多種系統(tǒng)性基因組差異小鼠種群的建立，也為中醫(yī)各種系統(tǒng)生物學(xué)研究提供了穩(wěn)定可重復(fù)的平臺(tái)。小鼠的GWAS方法用于疾病或生理性狀的研究已獲得令人矚目的成功，證明它可作為闡釋多基因疾病的分子基礎(chǔ)的重要手段。這種方法也可以在揭示中醫(yī)證候的分子基礎(chǔ)的研究中發(fā)揮重要作用。但是，由于目前國(guó)內(nèi)近交小鼠品系數(shù)量較少，其遺傳資源還相對(duì)匱乏，實(shí)驗(yàn)費(fèi)用相對(duì)較高等原因，小鼠的GWAS研究還開(kāi)展得不多。針對(duì)這些問(wèn)題，我們提出并實(shí)施了引進(jìn)利用國(guó)內(nèi)外小鼠遺傳參照種群，建立系統(tǒng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，開(kāi)展病證復(fù)雜性狀遺傳學(xué)研究的計(jì)劃。以抑郁癥小鼠病證模型為重點(diǎn)進(jìn)行了前期研究，結(jié)果支持證候表現(xiàn)的遺傳效應(yīng)［24］，為下一步進(jìn)行GWAS研究打下良好基礎(chǔ)。

4 結(jié)語(yǔ)

傳統(tǒng)中醫(yī)臨床實(shí)踐重視人的生物系統(tǒng)性及人與自然和社會(huì)環(huán)境的協(xié)調(diào)統(tǒng)一性，很早就注意到疾病的發(fā)生發(fā)展及病證表現(xiàn)的多樣性依人群、個(gè)體稟賦及環(huán)境而有別的現(xiàn)象，提出了“因人因時(shí)因地”治宜的區(qū)別化診療理論，這與西方醫(yī)學(xué)隨著基因組學(xué)的快速發(fā)展而勃興的“個(gè)性化醫(yī)學(xué)”方向是一致的［25］。復(fù)雜性狀遺傳學(xué)和GWAS的運(yùn)用，將有利于揭示中醫(yī)證候的分子及網(wǎng)絡(luò)物質(zhì)基礎(chǔ)，也為復(fù)方的個(gè)性化多靶點(diǎn)多層次協(xié)同運(yùn)用治療疾病提供了依據(jù)?？梢灶A(yù)期，充分利用小鼠在中醫(yī)證候的定量化與標(biāo)準(zhǔn)化上的模型優(yōu)勢(shì)［26］以及系統(tǒng)化可知的實(shí)驗(yàn)小鼠的基因組變異的遺傳優(yōu)勢(shì)，將為中醫(yī)基礎(chǔ)理論及中醫(yī)學(xué)研究的創(chuàng)新發(fā)展和推廣應(yīng)用的飛躍性提高作出貢獻(xiàn)。

［1］江峰，王宗殿．反思中醫(yī)證候本質(zhì)研究［N］．中國(guó)醫(yī)藥報(bào)，2006-1-7(7)．

［2］HARIRI A．R．The neurobiology of individual differences in complex behavioral traits［J］．Annu Rev Neurosci，2009，32: 225-47．Review

［3］PLOMIN R，OWEN M J，MCGUFFIN P．The genetic basis of complex human behaviors［J］．Science，1994，264:1733-1739

［4］AITA VM，CHRISTIANO AM，GILLIAM TC．Mapping complex traits in diseases of the hair and skin［J］．Exp Dermatol，1999，8:439-452．

［5］EHRET GB，CAULFIELD MJ．Genes for blood pressure:an opportunity to understand hypertension［J］．Eur Heart J，2013，34(13):951-961．

［6］CARNES MU，LIU YP，ALLINGHAM RR，et al．Discovery and functional annotation of SIX6 variants in primary open-angle glaucoma［J］．PLoS Genet，2014，29，10(5):e1004372．

［7］GINNS EI，OTT J，EGELAND JA，et al．A genome-wide search for chromosomal loci linked to bipolar affective disorder in the Old Order Amish［J］．Nat Genet，1996，12(4):431-435．

［8］ENOCH MA．The influence of gene-environment interactions on the development of alcoholism and drug dependence［J］．Curr Psychiatry Rep，2012，14(2):150-158．

［9］文欽，張?zhí)於?，韓玉萍，等．雙生子方法在證候(表型)研究中探討［J］．遼寧中醫(yī)雜志，2011，38(10):2102-2104．

［10］TAKAMOTO M，ARAIE M．Genetics of primary open angle glaucoma［J］．Jpn J Ophthalmol，2014，58(1):1-15．

［11］MIDDLETON FA，ROSENOW C，VAILAYA A，etal．Integrating genetic，functional genomic，and bioinformatics data in a systems biology approach to complex diseases:application to schizophrenia［J］．Methods Mol Biol，2007，401(401):337-364．

［12］CIVELEK M，LUSIS AJ．Systemsgeneticsapproachesto understand complex traits［J］．Nat Rev Genet，2014，15(1):34-48．

［13］PARKES M，CORTES A，VAN HEEL DA，et al．Genetic insights into common pathways and complex relationships among immune-mediated diseases［J］．Nat Rev Genet，2013，14(9): 661-673．

［14］LU YF，GOLDSTEIN DB，ANGRIST M，et al．Personalized Medicine and Human Genetic Diversity［J］．Cold Spring Harb PerspectMed，2014，doi: 10.1101/cshperspect．a(chǎn)008581 originally published online July 24，2014．

［15］PIRETSE，THAKKER RV．Mousemodelsforinherited endocrine and metabolic disorders Sep［J］．J Endocrinol，2011，211(3):211-230．

［16］FLINT J，ESKIN E．Genome-wide association studies in mice［J］．Nat Rev Genet，2012，13(11):807-817．

［17］WU Y，WILLIAMS EG，DUBUIS S，et al．Multilayered genetic and omics dissection of mitochondrial activity in a mouse reference population［J］．Cell，2014，11，158(6):1415-1430．

［18］MULDOON PP，JACKSON KJ，PEREZ E，et al．The α3β4* nicotinic ACh receptor subtype mediates physical dependence to morphine:mouse and human studies［J］．Br J Pharmacol，2014，171(16):3845-3857．

［19］PHILIP VM，SOKOLOFF G，ACKERT－BICKNELL CL，et al．Genetic analysis in the Collaborative Cross breeding population［J］．Genome Res，2011，21(8):1223-1238．

［20］IRAQI FA，ATHAMNI H，DORMAN A，et al．Heritability and coefficient of genetic variation analyses of phenotypic traits provide strong basis for high-resolution QTL mapping in the Collaborative Cross mouse genetic reference population［J］．Mamm Genome，2014，25(3-4):109-119．

［21］潘秋，方朝暉，王偉．淺談糖尿病病證結(jié)合動(dòng)物模型研究的思路［J］．中醫(yī)藥臨床雜志，2012，24(2):166-168．

［22］方肇勤，潘志強(qiáng)，盧文麗，等．大鼠和小鼠辨證論治標(biāo)準(zhǔn)的建立和用途［J］．中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào)，2009，10(7):907-912．

［23］盧文麗，方肇勤，潘志強(qiáng)，等．四種不同品系小鼠氣虛/血虛證候的比較與評(píng)價(jià)［J］．遼寧中醫(yī)雜志，2007，34(4):519-522．

［24］周欣，薛文達(dá)，李守雪，等．不同抑郁癥模型下證候差異的品系依賴(lài)性研究［J］．世界科學(xué)技術(shù):中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2016，18 (2):151-155．

［25］ZHOU X，LI Y，PENG Y，et al．Clinical phenotype network: the underlying mechanism for personalized diagnosis and treatment of traditional Chinese medicine［J］．Front Med，2014，12:337-346．

［26］王少賢，白明華，陳家旭，等．關(guān)于建立中醫(yī)證候模型評(píng)價(jià)量表的思考［J］．中華中醫(yī)藥雜志，2011，26(3):531-534．

Perspectives on the TCM Zheng Research Using Genome-Wide Association Study Approach

CHEN Gang，ZHOU Xin，XUE Wen-da，WU Hao-xin
(Center for Translational Systems Biology and Neuroscience，and Key Laboratory of Integrative Biomedicine of Brain Diseases，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China)

The scientific nature of TCM Zheng is a key for understanding the hallmarks and advantages of TCM in treatment based on Zheng differentiation and personalized medicine．It is also a fundamental theme of TCM research but remains largely unclear．Here by introducing the concept of complex trait genetics，the authors propose to use related methods，particularly the approach of cutting-edge genome-wide association study(GWAS)to dissect the molecular genetics of the individual differences in TCM Zheng．Moreover，the authors discuss the practicability and necessity to study the molecular and systematic networks underlying Zheng，by taking advantage of genetic reference mouse population resources，and point out the plausible advancement to TCM research and clinic by applying GWAS to validated models of disease-Zheng in the informative mouse population．

TCM Zheng;Complex trait genetics;GWAS;Genetic reference population mice;Model animal

R2-03

A

1006-3250(2017)01-0141-03

2016-06-12

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81673625)-基于PACAPCREB信號(hào)通路的越鞠丸快速抗抑郁機(jī)制研究;江蘇省自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(BK20140962)-基于GWAS分析策略研究越鞠丸抗抑郁作用的分子機(jī)制研究;江蘇省雙創(chuàng)項(xiàng)目(2013455)-中醫(yī)辨證治療抑郁癥的系統(tǒng)生物學(xué)研究;江蘇六大人才高峰項(xiàng)目(2013-YY-11);南京中醫(yī)藥大學(xué)自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(13XZR006)-基于“五志化火”探討梔子抗抑郁作用特點(diǎn)及其機(jī)制研究;中醫(yī)學(xué)江蘇省優(yōu)勢(shì)學(xué)科中醫(yī)系統(tǒng)生物學(xué)及腦病學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)

陳 剛(1972-)男，湖北武漢人，教授，醫(yī)學(xué)博士，博士研究生導(dǎo)師，從事重大腦病中醫(yī)藥治療的分子與系統(tǒng)生物學(xué)研究與中醫(yī)證候及方劑的系統(tǒng)遺傳學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)研究。