趙子德，張瑩瑩，柏 梅，梁 俊，王軍杰，魏彬彬，王 影△

(1. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院眼科醫(yī)院，北京 100041； 2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700)

視神經(jīng)萎縮是由他病引起的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及其軸突變性，表現(xiàn)為嚴(yán)重的視功能受損，尚無有效的治療措施。唐由之教授是我國(guó)著名的中醫(yī)眼科學(xué)家，在視神經(jīng)萎縮(optic atrophy, OA)的中藥治療中積累了豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)，提出“補(bǔ)虛化瘀法”，并圍繞其經(jīng)驗(yàn)方補(bǔ)腎益氣明目方(黨參、丹參、川芎、山茱萸、菟絲子、枸杞子、女貞子、生芪、熟地、當(dāng)歸)加減，臨床收效顯著[1]。

復(fù)方多藥物組合及藥物多組分給臨床藥理研究帶來極大挑戰(zhàn)。理清藥物-疾病靶向關(guān)系對(duì)揭示復(fù)雜藥理機(jī)制極為必要?！吧锘钚詫?dǎo)向下的化學(xué)研究思路”的提出，重視以中藥有效組分配伍的方劑架構(gòu)新模式[2]，因此借助開放生物數(shù)據(jù)平臺(tái)，以中藥組分作用靶點(diǎn)為分析單元的臨床藥理研究，展現(xiàn)了極強(qiáng)的驅(qū)動(dòng)力[3-5]。本研究擬基于該平臺(tái)，對(duì)唐由之治療視神經(jīng)萎縮之補(bǔ)腎益氣明目方，通過數(shù)據(jù)挖掘初步探索該方有效組分及分子靶向性。

1 材料與方法

1.1 藥物有效組分及其靶點(diǎn)篩選

本研究通過檢索中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)(TCMSP: Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，http:∥ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)，在草藥名稱“Herb name”中分別輸入各個(gè)中藥中文名稱，進(jìn)入搜索“Search”后，再點(diǎn)擊結(jié)果中顯示的所輸入中藥的拉丁名稱，在相關(guān)靶點(diǎn)“Related Targets”內(nèi)容中，便可獲取補(bǔ)腎益氣明目方中10味中藥相關(guān)的化合物及各化合物對(duì)應(yīng)的分子靶點(diǎn)，在此基礎(chǔ)上，結(jié)合藥物靶點(diǎn)和藥物作用信息數(shù)據(jù)庫Drugbank(http:∥www.drugbank.ca/檢索時(shí)間2015-7-18)，從中提取上述各中藥已被驗(yàn)證的有效組分及其對(duì)應(yīng)的分子靶點(diǎn)信息。

1.2 OA疾病靶標(biāo)獲取

利用囊括人類遺傳、基因表型及疾病基因圖譜數(shù)據(jù)庫OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man http:∥omim.org/檢索時(shí)間2015-11-29)，以“optic atrophy”為檢索詞進(jìn)行搜索，從顯示結(jié)果中便可獲取數(shù)據(jù)庫中收集的OA致病相關(guān)分子，將此作為本次研究的疾病靶標(biāo)。

1.3 藥物-疾病靶向分析

藥物作用被歸類為“中靶”與“脫靶”兩種效應(yīng)，藥物直接擾動(dòng)致病分子是靶向治療的主要形式。通過篩選具有直接擾動(dòng)OA分子靶標(biāo)的藥物、有效組分及其靶點(diǎn)信息，利用文獻(xiàn)挖掘與信號(hào)通路數(shù)據(jù)庫KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，http:∥www.kegg.jp)進(jìn)行信號(hào)通路信息比對(duì)，初步探索其靶向機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1 藥物組分及其靶點(diǎn)

通過檢索中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)，從中提取補(bǔ)腎益氣明目方中各中藥已被Drugbank數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證的有效組分，得到黨參、熟地、丹參、當(dāng)歸、川芎、枸杞子、山茱萸、女貞子、菟絲子、生芪被驗(yàn)證的組分?jǐn)?shù)目分別為11、5、20、6、14、14、22、19、7、13；上述各藥物有效組分涉及的靶點(diǎn)基因符號(hào)(gene symbol)數(shù)目分別為133、48、180、28、138、172、135、285、156、218。

2.2 OA疾病靶標(biāo)

通過OMIM數(shù)據(jù)庫獲得視神經(jīng)萎縮疾病相關(guān)靶標(biāo)分子(Gene Symbol)379個(gè)。

2.3 藥物-疾病靶向分析

通過將經(jīng)驗(yàn)方中各藥物靶點(diǎn)與視神經(jīng)萎縮靶標(biāo)進(jìn)行比對(duì)，本研究最終確定上述10味中藥中的有效組分直接擾動(dòng)視神經(jīng)萎縮靶標(biāo)分子數(shù)目分別為1、0、2、0、0、3、2、3、5、3，其中涉及5個(gè)有效組分luteolin(木犀草素)、protocatechuic acid(原兒茶酸)、quercetin(槲皮素)、vitamin A(維生素A)和sesamin(芝麻脂素)，5個(gè)直接擾動(dòng)靶標(biāo)EGFR(Epidermal growth factor receptor)、KIF21 A(Kinesin family member 21 A)、GJA1(Gap junction alpha-1)、ACOX1(Acyl-CoA oxidase 1)、G6PD(Glucose-6-phosphate dehydrogenase)。

3 討論

研究表明，攻擊單個(gè)靶標(biāo)對(duì)于復(fù)雜疾病幾乎沒有影響[6]，這可能源于系統(tǒng)具有魯棒性，而抑制多個(gè)靶標(biāo)比單一抑制更加有效，因此設(shè)計(jì)多靶點(diǎn)干預(yù)的有效藥物組合極具挑戰(zhàn)。本文針對(duì)補(bǔ)腎益氣明目方10味組方藥物的直接作用靶點(diǎn)和OA疾病靶標(biāo)進(jìn)行挖掘，OA顯示其多基因復(fù)雜疾病特點(diǎn)，所有藥物均呈現(xiàn)多組分多靶點(diǎn)特征，其中黨參、丹參、枸杞子、山茱萸、女貞子、菟絲子、生芪的有效組分能直接干預(yù)OA靶標(biāo)，且藥物中靶顯示出高度集中性。其中，菟絲子所含有效組分(sesamin、quercetin)占有最高“中靶率”，并呈現(xiàn)多角度干預(yù)。

3.1 促神經(jīng)細(xì)胞的生成及穩(wěn)態(tài)

結(jié)果顯示，黨參、丹參、枸杞子、女貞子、菟絲子、黃芪均可直接直接調(diào)控EGFR分子。EGRF是一種絡(luò)氨酸激酶受體(RTK)，研究表明EGFR與配體結(jié)合促進(jìn)自噬體與溶酶體的融合，從而維持神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的穩(wěn)定狀態(tài)[7]，防止細(xì)胞變性，而在受損區(qū)域星形膠質(zhì)細(xì)胞可以形成不成熟的神經(jīng)細(xì)胞[8]，隨后又發(fā)育為成熟的神經(jīng)細(xì)胞。而在果蠅體內(nèi)，EGFR與配體Spitz(一種被視為轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子-α樣配體)結(jié)合時(shí)能促進(jìn)神經(jīng)上皮的增殖和成神經(jīng)細(xì)胞的形成[9]。另外，利用軸突蛋白tau和神經(jīng)元蛋白β微管蛋白/神經(jīng)絲評(píng)估神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)過程中軸突再生程度時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)EGFR過表達(dá)時(shí)Tau蛋白和β微管蛋白/神經(jīng)絲被上調(diào)，在EGFR被阻斷時(shí)后者被下調(diào)[10]，同時(shí)這種調(diào)控模式被發(fā)現(xiàn)存在于EGFR與mTOR和Akt之間，mTOR和Akt則在胎兒鼠和幼鼠的神經(jīng)元細(xì)胞中高度表達(dá)，而在老年鼠中低表達(dá)，這表明EGFR在mTOR和PI3K / Akt通路激活條件下具有調(diào)節(jié)神經(jīng)元固有再生的重要潛力。

3.2 胞間信號(hào)傳導(dǎo)及運(yùn)輸動(dòng)力調(diào)控

GJA是枸杞子、山萸肉、女貞子、菟絲子、黃芪共同的目標(biāo)調(diào)控分子,是一種間隙連接蛋白，這種蛋白在人類視神經(jīng)網(wǎng)膜組織中主要表達(dá)于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、血管和上皮細(xì)胞，并參與線粒體基質(zhì)離子流動(dòng)和呼吸調(diào)節(jié)。6個(gè)連接蛋白形成一個(gè)連接子或質(zhì)膜半通道，這種通道具有相對(duì)非特異性，允許小于1000道爾頓的分子以被動(dòng)擴(kuò)散的形式通過，如可以影響細(xì)胞發(fā)育命運(yùn)被稱為形態(tài)發(fā)生素的一組生化分子等。在病理?xiàng)l件下，損傷的細(xì)胞可能通過間隙連接影響周圍健康細(xì)胞，相反必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也可以通過間隙連接供給臨近健康細(xì)胞而避免損傷。研究表明,間隙連接蛋白可能牽連著中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后神經(jīng)元死亡的病理[11]。利用基因敲除/敲入技術(shù)，連接蛋白被證實(shí)對(duì)腦組織缺血再灌注損傷具有重要保護(hù)作用[12]。在誘導(dǎo)細(xì)胞毒性或缺血條件下，間隙蛋白的藥理阻斷還可以終止幾乎所有視網(wǎng)膜無長(zhǎng)突細(xì)胞的丟失以及降低大部分神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的丟失[13]。此外，EGFR和GJA同位于間隙連接通路(Gap junction pathway)的上游位置，且該通路顯示涉及視皮層與視網(wǎng)膜功能、細(xì)胞凋亡、鈣離子平衡等調(diào)控。間隙連接包含細(xì)胞間通道，不同于體內(nèi)神經(jīng)、內(nèi)分泌交互機(jī)制，這允許相鄰細(xì)胞之間通過細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行短程通訊[14]。間隙連接通訊被認(rèn)為不論對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)還是外周神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘和軸突生存都至關(guān)重要[15]，分別通過介導(dǎo)少突-星形膠質(zhì)細(xì)胞間和雪旺氏細(xì)胞間的胞間通訊。在脫髓鞘神經(jīng)膠質(zhì)中，間隙連接調(diào)控著生理過程，如細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、鈣信號(hào)傳導(dǎo)以及參與連接蛋白構(gòu)成的半通道所釋放的神經(jīng)遞質(zhì)介導(dǎo)的細(xì)胞外信號(hào)傳導(dǎo)。因此，針對(duì)這類間隙蛋白的干預(yù)被認(rèn)為是新的治療策略，以減少神經(jīng)病理?xiàng)l件下逐漸損失的細(xì)胞。

另外，KIF21 A是正端走向驅(qū)動(dòng)蛋白家族中的一員，在神經(jīng)元中這一蛋白通過利用ATP水解釋放能量，沿軸突微管運(yùn)輸必要細(xì)胞組分[16]，驅(qū)動(dòng)蛋白活性的嚴(yán)格調(diào)節(jié)與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及神經(jīng)系統(tǒng)致病密切相關(guān)[17-18]，盡管較多的研究集中在KIF21 A與眼動(dòng)神經(jīng)之間的關(guān)系。因此，方中藥物針對(duì)EGFR、GJA、KIF21 A的調(diào)控關(guān)系到胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及運(yùn)輸動(dòng)力調(diào)控等方面，可能涉及神經(jīng)細(xì)胞重要的物質(zhì)和能量代謝過程。

3.3 抑制退行進(jìn)程與抗氧化

過氧化物酶體酰基輔酶A氧化酶是由ACOX1編碼的一種蛋白，ACOX1的缺乏是過氧化物酶體長(zhǎng)鏈脂肪酸氧化的一種罕見性疾病，它的缺乏在人類可能引起包括視神經(jīng)萎縮在內(nèi)的致命性神經(jīng)退化過程，即神經(jīng)元的丟失導(dǎo)致持續(xù)脫髓鞘改變[19]，嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)異常在該基因敲除小鼠模型中同樣可以觀察到[20]。G6PD是一種存在于人體紅細(xì)胞內(nèi)、協(xié)助葡萄糖進(jìn)行新陳代謝的酵素。研究表明，G6PD的缺乏可以降低缺血性視神經(jīng)病變的風(fēng)險(xiǎn)[21]，這可能是由于其缺乏而導(dǎo)致NADPH產(chǎn)生不足，降低NADPH依賴的氧化酶衍生的活性氧，保護(hù)組織或器官免受氧化損傷[22]。然而G6PD似乎是把雙刃劍，這源于其高表達(dá)在缺血再灌注期間又呈現(xiàn)出對(duì)抗DNA氧化損傷及防止神經(jīng)退行性病變等神經(jīng)保護(hù)作用[23]。

綜上可見，唐由之經(jīng)驗(yàn)方組方藥物可能通過其有效組分直接命中多個(gè)OA靶標(biāo)，其機(jī)制涉及促神經(jīng)細(xì)胞的生成及穩(wěn)態(tài)、胞間信號(hào)傳導(dǎo)、胞間運(yùn)輸動(dòng)力調(diào)控、抑制退行進(jìn)程、抗氧化等神經(jīng)再生和神經(jīng)保護(hù)等。組方藥物間存在共享和獨(dú)有靶點(diǎn)，預(yù)示著可能存在藥物聯(lián)合應(yīng)用的復(fù)雜機(jī)制或組方機(jī)制。在此，大數(shù)據(jù)分析為深入揭示方證、方病相關(guān)性帶來巨大潛力[24]，未來研究將基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)理論框架進(jìn)一步解析該組方藥物有效組分靶點(diǎn)與OA疾病靶標(biāo)之間的復(fù)雜關(guān)系，并進(jìn)行生物學(xué)驗(yàn)證，揭示其組方機(jī)制，指導(dǎo)臨床用藥(致謝：感謝唐由之教授對(duì)本研究的支持)

[1] 王影, 邱禮新, 唐由之.唐由之視神經(jīng)萎縮診治經(jīng)驗(yàn)[J].中國(guó)中醫(yī)眼科雜志, 2015, (1):35-36.

[2] 張伯禮, 王永炎. 方劑關(guān)鍵科學(xué)問題的基礎(chǔ)研究——以組分配伍研制現(xiàn)代中藥[J]. 中國(guó)天然藥物, 2005, 3(5): 258-261.

[3] ZHANG Y Y, LI H X, CHEN Y Y, et al. Convergent and Divergent Pathways Decoding Hierarchical Additive Mechanisms in Treating Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury[J]. CNS neuroscience & therapeutics, 2014, 20(3): 253-263.

[4] WANG Z, WANG Y. Navigating personalized medicine dependent on modular flexibility[J]. Trends in molecular medicine, 2013, 19(7): 393-395.

[5] WANG Z, LIU J, CHENG Y, et al. Fangjiomics: in search of effective and safe combination therapies[J]. The Journal of Clinical Pharmacology, 2011, 51(8): 1132-1151.

[6] HOPKINS A L. Network pharmacology: the next paradigm in drug discovery[J]. Nature chemical biology, 2008, 4(11): 682-690.

[7] LEE Y M, SUN Y H. Maintenance of Glia in the Optic Lamina Is Mediated by EGFR Signaling by Photoreceptors in Adult Drosophila[J]. PLoS Genet, 2015, 11(4): e1005187.

[8] MAGNUSSON J P, G?RITZ C, TATARISHVILI J, et al. A latent neurogenic program in astrocytes regulated by Notch signaling in the mouse[J]. Science, 2014, 346(6206): 237-241.

[9] MORANTE J, VALLEJO D M, DESPLAN C, et al. Conserved miR-8/miR-200 defines a glial niche that controls neuroepithelial expansion and neuroblast transition[J]. Developmental cell, 2013, 27(2): 174-187.

[10] XU M F, ZHOU H, HU C Y, et al. The mechanisms of EGFR in the regulation of axon regeneration[J]. Cell biochemistry and function, 2014, 32(1): 101-105.

[11] KERR N M, JOHNSON C S, DE SOUZA C F, et al. Immunolocalization of gap junction protein connexin43 (GJA1) in the human retina and optic nerve[J]. Investigative ophthalmology & visual science, 2010, 51(8): 4028-4034.

[12] SCHULZ R, G?RGE P M, GRBE A, et al. Connexin 43 is an emerging therapeutic target in ischemia/reperfusion injury, cardioprotection and neuroprotection[J]. Pharmacology & therapeutics, 2015, 153: 90-106.

[13] AKOPIAN A, ATLASZ T, PAN F, et al. Gap junction-mediated death of retinal neurons is connexin and insult specific: A potential target for neuroprotection[J]. The Journal of Neuroscience, 2014, 34(32): 10582-10591.

[14] KUMAR N M, GILULA N B. The gap junction communication channel[J]. Cell, 1996, 84(3): 381-388.

[15] NUALART-MARTI A, SOLSONA C, FIELDS R D. Gap junction communication in myelinating glia[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes, 2013, 1828(1): 69-78.

[16] FINK S, M?MKE S, DISTL O. PLXNC1 and RDH13 associated with bilateral convergent strabismus with exophthalmus in German Brown cattle[J]. 2012,18:2229-2240.

[17] BIANCHI S, VAN RIEL W E, KRAATZ S H W, et al. Structural basis for misregulation of kinesin KIF21A autoinhibition by CFEOM1 disease mutations[J]. Scientific Reports, 2016, 6:30668.

[18] SALEMI M, BARONE C, ROMANO C, et al. KIF21A mRNA expression in patients with Down syndrome[J]. Neurological Sciences, 2013, 34(4): 569-571.

[19] WANG R Y, MONUKI E S, POWERS J, et al. Effects of

的痛苦的同時(shí)縮短病程，在緩解現(xiàn)有癥狀的同時(shí)調(diào)理未受邪臟腑。且此法簡(jiǎn)單易學(xué)、無毒副作用，易于被家長(zhǎng)和患兒接受，適合臨床推廣。

參考文獻(xiàn)：

[1] 胡亞美，江載芳. 諸福棠實(shí)用兒科學(xué)[M].7版. 北京: 人民衛(wèi)生出版社，2006: 1168-1169.

[2] 汪受傳.中醫(yī)兒科學(xué)[M]. 北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2004：91.

[3] 熊仙華. 用解表和胃湯治療小兒風(fēng)熱感冒夾食滯證的療效觀察[J].當(dāng)代醫(yī)藥論叢, 2015, 2(5):33-34.

[4] 陸權(quán)，等.中國(guó)兒童普通感冒規(guī)范診治專家共識(shí)(2013)[J].中國(guó)實(shí)用兒科雜志， 2013，9(28)： 680-686.

[5] 汪受傳.中醫(yī)兒科學(xué)[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社，1998：175-176.

[6] 張素芳.近代全國(guó)著名小兒推拿流派-孫重三小兒推拿[M].青島：青島出版社，2014:82.

[7] 周麗娟，葛湄菲.三字經(jīng)流派推拿治療小兒外感發(fā)熱臨床研究[J].中醫(yī)學(xué)報(bào)，2014, 29(196):1385-1386.

[8] 謝俊英，龐繼明，葛翠瑤. 擠痧對(duì)急性扁桃體炎的特殊治療作用[J]. 中國(guó)針灸，2008，28(11): 822.