蔡江瑜 艾承沖 盛旦丹 蔣佳 陳世益

復旦大學附屬華山醫(yī)院運動醫(yī)學與關節(jié)鏡外科（上海 200040）

蛋白組學相關技術在運動對骨骼肌重塑研究中的進展

蔡江瑜 艾承沖 盛旦丹 蔣佳 陳世益

復旦大學附屬華山醫(yī)院運動醫(yī)學與關節(jié)鏡外科（上海 200040）

運動對身體最直接的作用為重塑骨骼肌，但其潛在的分子機制仍不清楚。蛋白組學技術可為特定刺激物調節(jié)分子通路提供一個整體的視角，目前已在運動對骨骼肌重塑的作用機制方面取得一定進展。本文通過廣泛查閱近些年來有關運動對骨骼肌重塑的蛋白組學研究報道，并進行總結分析。結果發(fā)現，可通過蛋白質分離技術結合蛋白質鑒定技術有效地檢測出運動前后或運動組與安靜對照組骨骼肌差異表達的蛋白質。通過運動可引起骨骼肌的適應性應答，蛋白質組會發(fā)生相應的調整。不同運動的類型、強度和持續(xù)時間以及肌纖維類型可引起骨骼肌蛋白質組的不同變化。隨著現有技術的不斷完善和更多新技術的產生，蛋白組學研究會為闡明運動對骨骼肌重塑及其改善健康的機制研究等做出更大的貢獻。

運動；骨骼?。恢厮?；蛋白組學；蛋白質組

運動鍛煉對身體健康有一定益處，最直接的作用為可以重塑骨骼肌[1]。不同類型、強度和持續(xù)時間的運動鍛煉可刺激相應骨骼肌發(fā)生不同的微觀和宏觀的適應性改變。近年來，許多學者致力于揭示運動對骨骼肌重塑潛在的分子機制。但是，目前關于其機制的研究仍不夠深入。蛋白質組（Proteome）的概念是由澳大利亞Macquarie大學Wilkins和Williams在1994年提出，指由一個基因組，或一個細胞、組織內表達的所有蛋白質[2]。而蛋白組學（Proteomics）是研究在特定時間或環(huán)境下某個細胞或某種組織基因組表達的全部蛋白質[3，4]。蛋白組學技術結合生物信息學方法可為特定刺激物對信號通路的調節(jié)提供一個整體的視角，更好地闡明運動對于骨骼肌重塑的影響。本文就蛋白組學相關技術在運動對骨骼肌重塑研究中的進展作一綜述。

1 蛋白組學技術

蛋白組學技術可用于分析骨骼肌相關蛋白，通過蛋白組學分析可對肌肉的功能有更深入的了解。但是，骨骼肌包括功能多樣的纖維類型，在收縮動力學、骨纖維蛋白亞型、代謝酶和線粒體密度上都有所不同[5，6]。對骨骼肌進行復雜的蛋白質組分析在方法學上仍是一個挑戰(zhàn)，且各個肌肉之間的不同特性加大了分析的難度[7]。骨骼肌能量需求較大，許多蛋白組學研究重點關注線粒體的相關蛋白[8，9]。同時，骨骼肌分泌蛋白質組也是蛋白組學的重要研究對象，以用于發(fā)現肌肉釋放的可作用于局部或全身的分泌蛋白[10]。以下概述最常用的蛋白組學方法在運動對骨骼肌重塑研究中的應用。

1.1 基于凝膠的蛋白質技術

蛋白電泳技術是蛋白質分離最常用的技術之一。二維凝膠電泳（Two-dimensional gel electrophoresis，2DE）是根據蛋白質在第一維中的等電點及第二維中的分子量的不同，使蛋白變性分離。2DE的優(yōu)點是具有高分辨率，可分離上千種蛋白，對于分析蛋白質亞型和翻譯后修飾的特性描述十分有用[4，11]。目前大部分關于運動引起骨骼肌蛋白質組改變的數據來自于2DE。Burniston[12]通過2DE結合基質輔助激光解析電離飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）證實了中等強度的耐力運動可改變大鼠跖肌中15個蛋白點的表達，這些蛋白的變化表明大鼠體內代謝途徑由糖酵解向脂肪酸氧化轉變。Fontana等[13]利用2DE結合質譜串聯法（MS/MS）研究低強度運動對肌營養(yǎng)不良模型小鼠（mdx鼠）股四頭肌的影響，結果顯示，相較于安靜對照組，低強度運動組中有4個蛋白點表達有差異，其中，3個為碳酸酐酶3的亞型，顯著上調；另1個為超氧化物歧化酶，顯著下調。作者得出結論，低強度運動可通過阻礙氧化應激，減緩mdx鼠肌肉中細胞變性過程。但是，2DE存在諸如難以分離低豐度蛋白、極端分子量或極端等電點的蛋白質以及極酸或極堿蛋白質，重復性和靈敏度較差等問題，研究者也在尋找和開發(fā)其他新的分離方法。

雙向差異凝膠電泳（two dimension difference gel electrophoresis，2D-DIGE）是1997年由Unlu等首先報道[14]。它是在2DE的基礎上發(fā)展而來的一種高效的蛋白質分離方法，解決了2DE的一些技術難點[15]。這一方法是基于不同的熒光氰化物染料在蛋白質賴氨酸氨基上顯色不同，對樣本蛋白質進行標記，被標記的蛋白等電點和相對分子量基本不受影響。等量混合標記好的蛋白質后進行雙向電泳，蛋白質表達量的變化則通過不同的熒光強度來體現。與傳統(tǒng)雙向電泳方法相比，2D-DIGE具有高效性、檢測動態(tài)范圍廣、定量精確、靈敏度高、重復性好等優(yōu)點。Egan等[8]指出，在研究骨骼肌線粒體蛋白質組表達的差異時，2-DE方法僅能使肌肉樣品中很少的線粒體蛋白溶解。另外，由于2-DE敏感性較低，線粒體蛋白無法準確定位。作者利用2D-DIGE結合液相色譜—串聯質譜法（LC-MS/MS）分析8名受試者運動前后股外側肌內線粒體蛋白質組表達的差異，結果顯示有31個蛋白點出現表達差異。

1.2 基于非凝膠的蛋白質技術

近些年來，基于非凝膠的蛋白質分離技術因其高效、快速、高靈敏度、高自動化程度等優(yōu)點被用于骨骼肌蛋白組學分析[9，16-19]。其中，多維液相色譜法（Multi?dimensional liquid chromategraphy methods，MDLC）因其良好的分辨率和更高的峰容量而備受關注，在蛋白質樣品分離分析中得到廣泛的應用[20]。特別是高效液相色譜與串聯質譜連用，可以減小樣品損耗，且較低的蛋白含量也可被分析出來[21]。Ichibangase等[18]利用熒光衍生化-高效液相色譜-串聯質譜法（Fluoro?genicderivatization-high performance liquid chroma?tographytandem mass spectrometry，FD-HPLC-MS/MS）應用于純血馬運動前后骨骼肌蛋白表達譜的分析，結果顯示有16種與能量代謝特別是無氧代謝相關的蛋白質出現差異表達。Schild等[19]報道高效液相色譜—電噴霧串聯質譜法（High performance liquid chroma?tography-electrospray ionization-tandem massspec?trometry，HPLC-ESI-MS/MS）用于分析未經急性耐力運動和經急性耐力運動的人群的骨骼肌蛋白質組，結果顯示有92種蛋白質出現差異表達。在急性運動組中，肌肉纖維特定蛋白和氧化磷酸化、三羧酸循環(huán)相關蛋白均顯著增加。

1.3 聯合凝膠和非凝膠技術的蛋白組學分析

在一些蛋白組學研究中，有研究者聯合凝膠和非凝膠的蛋白質分離技術用于蛋白多維分離。通過凝膠電泳技術分離蛋白質，然后切取凝膠膠帶或膠點，用蛋白酶消化并作液相色譜-電噴霧串聯質譜分析（LCESI-MS/MS）。Hussey等[22]報道利用雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）聯合HPLC-ESI-MS/MS鑒定出糖尿病2型受試者股外側肌中共1329種蛋白，其中70種蛋白質受運動的調節(jié)。這種方法可以檢測到低豐度蛋白和膜蛋白，但是在蛋白質定量檢測及差異表達分析方面仍存在挑戰(zhàn)。

2 運動對骨骼肌蛋白組學的影響

2.1 特定運動對骨骼肌生物學過程的影響

骨骼肌可對運動的不同類型（抗阻力運動、耐力運動），不同強度（低、中、高）和持續(xù)時間（急性、慢性）做出不同的蛋白水平的應答。通過蛋白組學技術可以進一步發(fā)現其調節(jié)規(guī)律。

一般來說，運動可分為耐力運動和抗阻力運動，代表兩種能量消耗的形式，即有氧運動和無氧運動。雖然耐力和抗阻力運動均有利于身體健康，但骨骼肌的適應性改變與這兩種特定的運動模式高度相關[23，24]?？棺枇\動和耐力運動會引起不同類型的收縮刺激，促使不同的通路進行調控和蛋白應答的發(fā)生[24，25]。具體而言，耐力運動可促進線粒體生物合成和骨骼肌纖維由快肌纖維向慢肌纖維轉變，這可能與AMPK-PGC-1α信號通路的激活有關；抗阻力運動對骨骼肌纖維類型影響較小，會因蛋白質大量合成而使肌肉肥大，這可能與PKB-TSC2-mTOR信號通路有關[26]。Atherton等[26]將此結果歸納為“AMPK-PKB轉換”（AMPK-PKB switch）。

關于運動持續(xù)時間對骨骼肌蛋白質組影響的研究顯示，相對于急性運動而言，慢性運動產生變化的蛋白質數量更多[27]。據Padrao等[11]報道，有49種蛋白質在急性和慢性運動中常規(guī)受到調節(jié)，其中大部分蛋白質屬于細胞呼吸和線粒體轉運等生物過程中的功能蛋白。急性運動促進細胞氨基酸代謝過程、鈣離子跨膜轉運體活動、鈣離子釋放入細胞質和肌原纖維組裝，而慢性運動誘發(fā)代謝前體物和能量的生成，三羧酸循環(huán)、肌肉收縮調節(jié)等過程的增強。研究顯示，相較于慢性運動，骨骼肌纖維在急性運動后對氨基酸的需求量更大。這種新陳代謝的變化可能有助于急性運動恢復期蛋白質的合成和肌原纖維組裝[28]。在肌原纖維組裝過程中，支架蛋白如伴肌動蛋白相關錨定蛋白（N-RAP）、Kelch相關蛋白1（Krp1）以及伴侶蛋白如熱休克蛋白90（Hsp90）、結構型熱休克蛋白70（Hsc70）及UNC-45蛋白對肌纖維生成起著重要的調節(jié)作用[29]。

通常根據最大攝氧量的區(qū)別，可將耐力運動強度分為低、中、高強度運動（最大攝氧量分別＜60%，60%～80%和＞80%）。目前僅發(fā)現β-烯醇酶在任何運動強度下均有變化[30-32]。成年人β-烯醇酶在快縮肌纖維中積聚最多，其中ββ亞型占所有烯醇酶含量的90%以上，對生理刺激十分敏感[33]。ββ亞型具有較高的親和力，易與糖酵解途徑相關的酶或肌鈣蛋白結合，作用于能量代謝，為肌肉收縮提供必需的能量[34]。運動主要影響骨骼肌吡啶核苷酸代謝NAD+，NADH的水平，以及線粒體ATP的生成[35]。高強度運動主要影響吡啶核苷酸代謝，中強度運動主要影響代謝前體產物、酮代謝、三羧酸循環(huán)和肌絲滑動，而低強度運動主要影響糖酵解途徑中的β-烯醇酶。

2.2 肌纖維類型對運動引發(fā)的蛋白質組重構的影響

肌纖維類型對運動相關的蛋白質組的重塑也有影響[36]。根據肌纖維的收縮速度和代謝特征，可將其分為快縮-糖酵解型、慢縮-氧化型[37]。兩種纖維在糖酵解、游離脂肪酸代謝、檸檬酸循環(huán)和氧化磷酸化等代謝過程相關的蛋白表達均存在差異[38]。而運動可引起兩種肌纖維類型中的ATP合成酶亞基5B、線粒體肌酸激酶、肌紅蛋白、葡萄糖磷酸變位酶-1和WD1重復蛋白等6種蛋白質均受到調節(jié)[11]。Magherini等[32]比較快縮-糖酵解型（脛骨前?。┖吐s-氧化型（比目魚?。┰谟醒踹\動前后蛋白表達的差異，結果顯示，脛骨前肌中有α-烯醇酶、β-烯醇酶、乳酰谷胱甘肽裂解酶、肌酸激酶M型、磷酸丙糖異構酶和ES1蛋白同系物6種蛋白質存在差異表達，其中糖酵解相關的酶（α-烯醇酶、β-烯醇酶和磷酸丙糖異構酶）均出現下調，表明脛骨前肌作為快縮-糖酵解型肌肉，在有氧運動過程中其代謝途徑可能部分向有氧代謝轉換；而比目魚肌中僅有線粒體NADH脫氫酶1α子復體2和延伸因子Tu兩種蛋白存在差異表達，均出現下調。Roca-Rivada等[10]比較快縮-糖酵解型（腓腸肌）和慢縮-氧化型（比目魚?。┘∪夥置诘鞍捉M學，發(fā)現19種蛋白質出現差異表達，且經耐力運動后在腓腸肌和比目魚肌中分別產生了10種和17種獨特的分泌蛋白。其中，DJ-1蛋白在腓腸肌中更為豐富，而脂肪酸結合蛋白-3（FABP-3）則在比目魚肌中含量更高。作者認為DJ-1蛋白與肌肉收縮后的氧化應激有關，而FABP-3與脂質代謝有關。

綜上所述，通過蛋白組學相關技術可對骨骼肌蛋白質組做一整體而深入的研究。運動可引起骨骼肌的適應性應答，蛋白質組會發(fā)生相應的調整。不同運動的類型、強度和持續(xù)時間以及肌纖維類型可引起骨骼肌蛋白質組的不同變化。目前關于運動對骨骼肌重塑蛋白組學研究正在開展，但仍存在一定的技術難點。隨著現有技術的不斷完善和更多新技術的產生，蛋白組學研究會為闡明運動對骨骼肌重塑及其改善健康的機制研究等做出更大的貢獻。

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2016.08.04

第1作者：蔡江瑜，Email：caijiangyu1@126.com；

陳世益，Email:cshiyi@163.com