尤俊嶺

（遼寧省錦州市婦嬰醫(yī)院婦產科，遼寧 錦州 121001）

孕激素對人子宮內膜癌細胞體外增殖、凋亡的影響

尤俊嶺

（遼寧省錦州市婦嬰醫(yī)院婦產科，遼寧 錦州 121001）

目的探討孕激素對人子宮內膜癌細胞對體外增殖及凋亡的影響。方法體外培養(yǎng)子宮內膜癌細胞，采用流式細胞儀觀察不同濃度孕酮對細胞周期及凋亡率的影響、光學顯微鏡檢測其形態(tài)學變化、MTT比色法觀察不同濃度孕酮對細胞增殖的作用。結果流式細胞儀分析，實驗組G0/G1期上升，S期下降，細胞凋亡率上升；光鏡可觀察到細胞凋亡的形態(tài)學改變；MTT結果顯示，隨著孕酮濃度的增加，其對細胞生長的抑制作用明顯增強，與對照組比較，差異有顯著性，且具有劑量依賴性。結論孕酮抑制子宮內膜癌細胞的增殖，并誘導其凋亡。

子宮內膜癌；孕酮；增殖；凋亡

近年來，子宮內膜癌的孕激素治療已經受到越來越多的關注和研究，臨床應用也取得了較大進展。本研究采用MTT、FCM及形態(tài)學檢測手段觀察了不同濃度的孕激素在體外對子宮內膜癌細胞增殖及凋亡的影響，從而為臨床治療內膜癌可否進行激素替代治療提供了理論依據(jù)，進而證實孕激素治療子宮內膜癌的療效性和進一步探索的遠大前景。

1 材料與方法

1.1 材料：孕酮、DMEM培養(yǎng)基購自美國Sigma公司，胎牛血清、胰蛋白酶、MTT（四甲基偶氮唑鹽）購自北京華美生物技術有限公司，Annexin-V-FITC凋亡檢測試劑盒購自北京寶賽生物技術有限公司。子宮內膜癌細胞株HEC-1B細胞由北京大學醫(yī)學部細胞生物中心研究室惠贈。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組：將子宮內膜癌細胞株HEC-1B細胞于37 ℃、5%二氧化碳的飽和濕度條件下，在含10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基內培養(yǎng)。共分5組，對照組：不加孕激素；治療組根據(jù)所加濃度的不同分為：10-5mol/L組、10-6mol/L組、10-7mol/L組及10-8mol/L組。

1.2.2 細胞周期與凋亡率的檢測：將細胞濃度為1×105個/mL的子宮內膜癌單細胞懸液接種于24孔培養(yǎng)板中（每孔1 mL），每孔加入1 mL的DMEM培養(yǎng)液，于37 ℃、5%二氧化碳的飽和濕度培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，過夜貼壁后，4 ℃培養(yǎng)1 h，以促進細胞同步化生長；換培養(yǎng)液，實驗組分別加入含孕酮10-8、10-7、10-6、10-5mol/L的培養(yǎng)液，對照組加等體積的純培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，胰蛋白酶消化，收集細胞，應用Annexin-V-FITC凋亡檢測試劑盒（參照說明書的步驟），置流式細胞儀（FCM）分析。

1.2.3 細胞凋亡形態(tài)學觀察：24孔培養(yǎng)板底內放置消毒過的玻璃蓋片，每孔加入1 mL的濃度為1×105/mL的子宮內膜癌單細胞懸液，于37 ℃、5%二氧化碳的飽和濕度培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，實驗組和對照組處理同1、2、2，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，分別做AO染色和TUNEL染色。①AO染色：取出蓋片，溫Hanks液漂洗3～5 s；95%酒精固定15～30 min；1%冰醋酸作用30 s；1×10-4吖啶橙染色30 s～1 min；0.1 mol/L CaCl2處理30 s～2 min；PBS漂洗3次，封片。鏡下觀察并攝影。②TUNEL染色（按試劑盒內的說明書進行操作）：取出蓋片，3.7%中性甲醛液室溫固定10 min；cytonin15 min，3% H2O2抑制內源性過氧化物酶5 min；TDT標記反應液37 ℃，1 h；抗-Brdu 37 ℃，1 h；Streptavidin-HRP 10 min；DAB顯色，蘇木素復染。鏡下觀察并攝影。

1.2.4 細胞增殖實驗：取對數(shù)生長期的子宮內膜癌細胞，制成濃度為1×105個/mL的單細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200 μL，過夜貼壁后，4 ℃培養(yǎng)1 h，以促進細胞同步化生長；換培養(yǎng)液，實驗組分別加入10-8、10-7、10-6、10-5mol/L的培養(yǎng)液，對照組加純培養(yǎng)液。每一濃度均設4個復孔，培養(yǎng)72 h后，每孔加入20 μL濃度為5 mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h后吸凈上清夜，每孔加入二甲亞砜200 μL，振蕩10 min，用酶標記光度儀在波長為492 nm時測定每孔的吸光度（A）值，計算不同濃度孕酮對細胞生長的抑制率[抑制率=（對照組A均值-實驗組A均值）/對照組A均值]。本實驗重復3次。

2 結 果

2.1 孕酮對子宮內膜癌細胞周期分布和凋亡率的影響：經FCM分析，不同濃度孕酮作用腫瘤細胞72 h后，與對照組相比，細胞周期分布、凋亡率均發(fā)生改變，即G0/G1期細胞比例數(shù)上升，S期和G2/M期下降，細胞凋亡率上升，均有顯著差異，且與孕酮濃度之間具有劑量依賴性，即呈顯著正相關。

2.2 子宮內膜癌細胞凋亡形態(tài)學變化：①AO染色：凋亡細胞體積明顯縮小，核碎裂，核內可見濃縮邊集的染色質，呈新月形或腎形致密濃染的黃綠色染色，熒光亢進。②TUNEL染色：細胞核經蘇木素復染呈淺藍色，核相對較大，形態(tài)較為一致。凋亡細胞斷裂的DNA片段末端經標記后顯色，核呈棕色或棕褐色，表現(xiàn)為固縮、邊集、碎裂，可見凋亡小體形成。

2.3 孕酮對子宮內膜癌細胞增殖的影響：MTT結果顯示，隨著孕酮濃度的增加，其對細胞生長的抑制作用明顯增強，與對照組比較，差異有顯著性，且具有劑量依賴性，抑制率與孕酮的濃度之間呈顯著正相關。

3 討 論

3.1 孕酮對子宮內膜癌細胞生長的影響：本研究選用的是高分化子宮內膜腺癌細胞，且為PR陽性，提示子宮內膜癌是性甾體激素依賴性腫瘤。Ishiwaia等在研究孕激素對人類內膜癌細胞系生長和分化作用時發(fā)現(xiàn)體外孕激素可抑制癌細胞的生長。本實驗MTT結果證實，隨著孕酮濃度的增加，其對細胞生長的抑制作用明顯增強，與對照組比較，差異有顯著性，且具有劑量依賴性。

3.2 孕酮對子宮內膜癌細胞凋亡的影響：細胞凋亡的發(fā)生往往是細胞先被阻滯在細胞周期的某一時相，然后發(fā)生凋亡[1]。在一些體外實驗中，也已經證實可通過誘導細胞凋亡清除某些腫瘤細胞，而認為孕激素促進凋亡可能是依賴PR機制影響了抗凋亡基因蛋白的表達。本實驗用FCM法觀察了不同濃度孕酮對內膜癌細胞周期分布及凋亡的作用，發(fā)現(xiàn)孕酮改變了細胞周期的分布，使細胞周期出現(xiàn)向G0/G1期移行的特征性動力學改變，即G0/G1期細胞明顯增多，S期減少，并可誘發(fā)細胞凋亡。當孕酮濃度在10-5 mol/L時，細胞周期分布顯示G0/G1峰前出現(xiàn)一個小于二倍體DNA含量的亞二倍體峰，即細胞凋亡峰。因此，我們可以推斷孕酮是通過在G0/G1→S間阻斷內膜癌細胞周期的進程，誘導癌細胞凋亡而抑制子宮內膜癌細胞的增殖。同時我們在光鏡下也觀測到了癌細胞凋亡的形態(tài)學上的典型特征。

3.3 孕激素對子宮內膜癌細胞的作用機制：孕激素治療子宮內膜癌的歷史已有40多年，至今機制不明。一般認為孕激素對癌細胞有直接抑制作用，在外源性孕激素作用下，子宮內膜癌細胞分化趨向成熟，分泌活躍，細胞發(fā)生凋亡和萎縮[2]。目前，對于孕激素治療子宮內膜癌作用機制的研究主要涉及以下幾個方面：①基因水平：有研究[3]發(fā)現(xiàn)，子宮內膜癌孕激素治療過程中，bcl-2基因表達均發(fā)生降調節(jié)，并伴隨著腫瘤細胞分化逐漸成熟，從而認為bcl-2可作為子宮內膜癌孕激素治療效果的一個標記。②細胞因子：實驗顯示孕激素可直接作用于內膜樣腺癌細胞的血管內皮生長因子（VEGF）的基因轉錄，消除雌激素對內膜血管內皮生長因子mRNA表達的抑制作用，同時抑制內膜細胞的血管生成多肽mRNA表達[4]。還可減少子宮內膜癌細胞表面的硫酸酯，從而減少細胞與層粘連蛋白結合，降低腫瘤的侵犯和轉移能力。③性激素結合球蛋白和酶：孕激素可通過影響性激素結合球蛋白對子宮內膜癌發(fā)生作用。也有文獻報道，谷光甘肽過氧化物酶，雌激素磺基轉移酶，17B-羥甾脫氫酶芳香硫基轉移酶等可能在孕激素對子宮內膜癌的治療中發(fā)揮作用。④細胞增生與分化：許多研究指出，孕激素治療可減低子宮內膜癌的細胞增生，促使其分化，從而發(fā)揮治療作用。Saegusa[5]等發(fā)現(xiàn)，孕激素治療并不影響腫瘤細胞凋亡，而是通過促使細胞分化來抑制子宮內膜癌細胞增生，使組織動力學向癌細胞缺失的方向移動。

本實驗通過孕酮對子宮內膜癌細胞增殖及凋亡的作用結果，提示了合理劑量的孕酮的應用對內膜癌患者的激素替代治療有極大的益處，也希望本實驗能為尋求腫瘤治療的新方法提供一定的實驗依據(jù)。（如將孕激素與細胞周期阻滯藥等抗癌藥物耦聯(lián)成生物制劑，既能阻斷癌細胞與細胞外基質的黏附，抑制腫瘤浸潤性生長，又可以將之阻滯于某一細胞周期，抑制其增殖，誘導細胞凋亡，從而達到治療癌癥的目的。）

[1] 曾益新.腫瘤學[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1999.

[2] 陳晨,華祖穆,金曉龍,等.孕激素治療子宮內膜癌的形態(tài)學觀察與治療機制探討[J].中華婦產科雜志,1997,32(7):415.

[3] Saegusa M,Okayasu I.Down-regulation of bcl-2 expression is closely related to squamous differentiation and progesterone therapy in endometrial carcinoma[J].J Pathol,1997,182(4):429-436.

[4] Zhang L,Rees MC,Bicknell R.The isolation and long term culture of normal human endometrial epitbelium and stroma,expression of m-RNAfor angiogenic polypeptides basslly and on oestrogen and progesterone challenges[J].J Cell Sci,1995,108(2):323.

[5] Saegusa M,Okayasu I.Progesterone therapy for endometrial carcinomas reduces cell proliferation but alter apoptosis[J].Cancer,1998, 83(1):111-121.

R737.33

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1671-8194（2017）19-0053-02