崔美巖，張淼，許宗為，王佳蕊，王棟，張志霞，陳駿，談重芳

（鄭州大學(xué)河南省離子束生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州450000）

乳酸菌在極端條件下抗逆性的研究進(jìn)展

崔美巖，張淼，許宗為，王佳蕊，王棟，張志霞，陳駿，談重芳

（鄭州大學(xué)河南省離子束生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州450000）

乳酸菌在自然界中的分布范圍非常廣泛，其中，有些特殊種類的乳酸菌在某些極端條件下仍然具有很好的生存能力。篩選具有較強(qiáng)耐鹽性、pH值耐受性以及較寬溫度生長范圍的乳酸菌，能夠大大拓寬其應(yīng)用范圍，其耐性機(jī)制也是微生物學(xué)家研究的熱點(diǎn)。綜述了乳酸菌在高質(zhì)量分?jǐn)?shù)鹽、極低pH值、極高溫、極低溫等極端條件下，對乳酸菌的篩選與鑒定，耐性機(jī)理及應(yīng)用。

耐鹽性；pH值；溫度；乳酸菌

0 引 言

極端環(huán)境指對生物生長產(chǎn)生限制因子的環(huán)境，如高溫、低溫、高酸、高堿、高鹽等環(huán)境。乳酸菌能夠發(fā)酵動(dòng)植物產(chǎn)品形成特征性的發(fā)酵食品[1]，耐鹽性、耐酸性乳酸菌經(jīng)常存在于醬類、泡菜等發(fā)酵食品中，對產(chǎn)品的風(fēng)味、質(zhì)地等特征具有非常重要的作用[2]，耐鹽性乳酸菌是腌漬過程的主要微生物類群[3]。檢測益生菌的一個(gè)重要指標(biāo)就是胃腸道環(huán)境的耐受性，胃液的pH值在3.0以下,對于微生物來說,這是一個(gè)極其嚴(yán)峻的環(huán)境,只有極少數(shù)耐酸的乳酸菌才能以活菌形式通過胃部。因此,開發(fā)出在強(qiáng)酸環(huán)境中也能較好存活的耐酸性乳酸菌和擴(kuò)大乳酸菌的應(yīng)用范圍是息息相關(guān)的[4]。本文將從乳酸菌在極端溫度、pH值、鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)等惡劣生存條件下的篩選分離，所包含菌株種類以及耐受機(jī)理做一綜述。

1 乳酸菌的耐鹽性

乳酸菌能夠影響食品的氣味、色澤、質(zhì)量甚至保藏時(shí)間等。由高鹽濃度引起的高滲透壓，觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)水分外流，細(xì)胞胞質(zhì)分離，從而引起細(xì)胞在結(jié)構(gòu)和生理上的損傷，導(dǎo)致細(xì)胞停止生長，甚至死亡[5]。因此高濃度的食鹽能夠抑制致病性及一些腐敗性微生物的生長，但是也會(huì)對乳酸菌的生長造成影響。篩選耐鹽性比較強(qiáng)的乳酸菌并非易事，文獻(xiàn)中所提到的乳酸菌對鹽度的耐受性大多在20%以內(nèi)。

耐鹽性乳酸菌大多應(yīng)用于食品中，比如醬油、農(nóng)家大醬、腌制食品等。采用高鹽稀醪發(fā)酵工藝生產(chǎn)醬油時(shí)需要在醬醅發(fā)酵過程中添加酵母菌和乳酸菌，但是醬油的NaC l質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)18%,于是耐鹽度達(dá)18%的乳酸菌就成為生產(chǎn)醬油的關(guān)鍵因素[6]。在大醬發(fā)酵過程中，高濃度的鹽會(huì)抑制乳酸菌的生長，對最終大醬質(zhì)量有很大影響，所以耐鹽的乳酸菌對大醬品質(zhì)的好壞起著決定性作用[7]。嗜鹽乳酸菌是魚醬發(fā)酵的最后階段的一種優(yōu)勢菌株，這時(shí)魚醬的顏色、風(fēng)味、氣味已經(jīng)形成。據(jù)推測，這些嗜鹽乳酸菌對魚醬的風(fēng)味及氣味的形成起著重要作用。

1.1 常見耐鹽性菌株

大多數(shù)乳酸菌的耐鹽濃度都在10%以下，在0-6%的濃度范圍內(nèi)幾乎所有乳酸菌都可以正常生長。耐鹽度能達(dá)10%以上的乳酸菌基本都屬于片球菌屬和四聯(lián)球菌屬這二個(gè)屬內(nèi)。Natteewan Udomsil[8]等人從發(fā)酵魚醬中分離出7株具有代表性的耐鹽性的乳酸菌，這7株乳酸菌在25%濃度的培養(yǎng)基上經(jīng)過七天的培養(yǎng)，菌落數(shù)達(dá)到10～100 mL-l，這些乳酸菌大都為四聯(lián)或二聯(lián)球菌，并且具有產(chǎn)揮發(fā)性化合物的能力。郭迪[6]從醬醅中分離篩選出一株耐鹽性乳酸菌,在18%和20%的N aC l的質(zhì)量分?jǐn)?shù)下都能生長,并產(chǎn)生乳酸。對該菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，證明篩選菌應(yīng)屬四聯(lián)球菌屬中嗜鹽四聯(lián)球菌中的一種。B.Kimura[9]等人從魚醬中分離出能夠產(chǎn)生組胺的Tetragenococcus muriaticus，一種四聯(lián)球菌屬嗜鹽乳酸菌。Tetragenococcus muriaticus與T.halophilus有很近的親緣關(guān)系[10]，這種細(xì)菌能夠在25%的鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)下生長[11]。具有極強(qiáng)耐鹽性的其他乳酸菌種屬尚未見報(bào)道。

不同乳酸菌的耐鹽能力存在差別(見表1)，即使是同屬不同種，甚至不同亞種的乳酸菌，其耐鹽能力也有所不同[12]。

表1 部分乳酸菌的耐鹽能力[13]

1.2 耐鹽性乳酸菌的應(yīng)用

耐鹽性乳酸菌的應(yīng)用是非常廣泛的，（1）嗜鹽微生物可以改善傳統(tǒng)食品加工工藝[14]；(2)高鹽環(huán)境下嗜鹽微生物及新型嗜鹽酶發(fā)揮催化作用[8]；(3)實(shí)現(xiàn)在高鹽培養(yǎng)基中積累某些特定化合物，如四氫吡啶、甘油、組胺等[9]；(4)嗜鹽微生物應(yīng)用于高鹽環(huán)境中有機(jī)污染物降解或轉(zhuǎn)化，生產(chǎn)可替代能源等方面[15-16]。(5)嗜鹽微生物能產(chǎn)生獨(dú)特化合物，而這些化合物是非高鹽生長所必需的，如細(xì)菌視紫紅質(zhì)等，在制備細(xì)菌視紫紅質(zhì)的廢料中可以提取不飽和脂肪酸,這擴(kuò)大了嗜鹽菌的應(yīng)用范圍[17]。

1.3 耐鹽性機(jī)理

細(xì)胞能適應(yīng)鹽應(yīng)激，是乳酸菌在自然環(huán)境及工業(yè)生產(chǎn)中存活、生長的重要因素。為了維持胞內(nèi)的滲透壓，乳酸菌利用許多策略來應(yīng)對外界滲透壓的變化。目前嗜鹽微生物耐鹽機(jī)制的研究主要集中在細(xì)胞吸K+排Na+作用、胞內(nèi)積累小分子相容性溶質(zhì)及嗜鹽酶的氨基酸組成特性三個(gè)方面[14]。高效的N a+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白存在于一些嗜鹽微生物中，在微生物耐受高鹽環(huán)境脅迫的應(yīng)答中起到了不可忽視的作用[18]。在嗜鹽微生物中存在一種依賴?yán)鄯e胞內(nèi)高濃度K+/C l-來維持滲透壓平衡的機(jī)制[14]，K+有利于恢復(fù)細(xì)胞的形態(tài)和滲透壓，是酶活性和基因表達(dá)調(diào)節(jié)的細(xì)胞信使[19]。細(xì)菌中常見的K+吸收系統(tǒng)有：T rKA、K trA、Kup和Kdp[20-21]。當(dāng)細(xì)胞受到鹽脅迫時(shí)，通過外排N a+、吸收K+來恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)水和離子的平衡。積累相容性溶質(zhì)來抵抗外界高鹽環(huán)境是嗜鹽菌主要的耐鹽機(jī)制。在高滲條件下，由于分解代謝相容性溶質(zhì)的酶被抑制，因此相容性溶質(zhì)能在細(xì)胞內(nèi)高濃度積累，執(zhí)行滲透保護(hù)功能[12]。

2 耐酸堿性

2.1 耐酸堿性菌株的篩選

乳酸菌不但包括在食品發(fā)酵中使用的一般認(rèn)為安全(GRAS)的微生物,而且還包括胃腸道中普遍存在的共生體和具有潛在益生作用的益生菌。對這些微生物來說,食品和胃腸道中的酸性環(huán)境對它們的生存是一個(gè)很大的挑戰(zhàn)[22]。pH值的測定范圍一般為2～10，多數(shù)研究表明大多數(shù)菌群的生長都會(huì)受到影響在pH值為2的情況下。針對乳酸菌耐酸堿性的實(shí)驗(yàn)有人工模擬胃液、耐膽鹽、胰液實(shí)驗(yàn)等。J.Bautista-Gallego[23]等從食用橄欖中分離乳酸菌進(jìn)行人工模擬胃液、胰液實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)乳酸菌在胰液中的生存率要比在胃液中的生存率高。這或許說明乳酸菌的耐酸性要比耐堿性普遍要弱。有關(guān)耐酸性乳酸菌的分離與篩選研究非常多，柏建玲[24]等對17株乳酸菌進(jìn)行耐胃液實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)4株生長狀況比較好的乳酸菌菌株，對其馴化，使菌株的胃液耐受性得到了不同程度的提高。

2.2 常見耐酸堿性菌株

嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)是人和動(dòng)物腸道中的重要微生物,對人和動(dòng)物具有益生作用,被廣泛用于發(fā)酵食品與微生態(tài)制劑[25-27]。研究表明不是所有的嗜酸乳桿菌都能耐受低pH和高濃度膽鹽環(huán)境,僅有少數(shù)嗜酸乳桿菌(L.aci-dophilus)具有這種能力[28]。耐酸性較好的菌株大多都為桿菌屬，球菌數(shù)比較少見，但也有相關(guān)報(bào)道。如Lactobacillus coryniformis subsp.Torquens、Lb. bifermentans、Lb.amylophilus、Lb.helueticus和Lb.delbrueckii subsp.Bulgarcus[29]，Lactobacillus plantarum、Lactococcus lactis[4]。云月英[30]等從酸菜汁中分離出6株耐酸性比較強(qiáng)的菌株，在pH值為3的情況下生長良好。采用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)、生理生化特性分析對這F株菌進(jìn)行鑒定。鑒定結(jié)果:3株桿菌中植物乳桿菌、彎曲乳桿菌、干酪乳桿菌各1株；3株球菌中屎鏈球菌2株，鳥腸球菌1株。黃文強(qiáng)[31]等利用厭氧菌分離技術(shù)，從狼山雞腸道中分離乳酸菌，通過形態(tài)、生理生化特性、16SrRNA基因序列測定以及同源性分析對其進(jìn)行鑒定，并對菌株進(jìn)行耐酸性、抗菌活性等篩選，耐酸性菌株為植物乳桿菌、卷曲乳桿菌、德氏乳桿菌以及嗜酸乳桿菌。段云浩[32]等從14株乳酸菌分離菌中篩選出2株具有低pH值耐受性的菌株，在pH 3.0的環(huán)境中能夠正常生殖，經(jīng)鑒定這兩株菌為植物乳桿菌。研究表明，大多數(shù)桿菌屬的耐酸性要比球菌屬好。

2.3 耐酸性乳酸菌的應(yīng)用

大部分乳酸菌在通過消化道到達(dá)腸道之前,因不能耐受胃液酸度而死亡,而少數(shù)菌能耐酸,此類耐酸性乳酸菌能在人體中更有效地發(fā)揮保健作用,因此具有很大的開發(fā)價(jià)值[4]。（1）降膽固醇、降血壓和調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)等多種保健作用；（2）運(yùn)用于發(fā)酵食品業(yè)；（3）在畜牧業(yè)中的應(yīng)用；（4）抑菌作用，可用作生物保護(hù)劑。

2.4 乳酸菌耐酸性機(jī)理

目前酸對微生物菌體的影響還未完全清楚，其耐酸性機(jī)制有很多種，大量的研究表明,H+-ATPase和谷氨酸脫羧酶(GAD)體系是乳酸菌維持胞內(nèi)pH值穩(wěn)定所使用的主要機(jī)制[22]。H+-ATPase在細(xì)菌中普遍存在，但還并不清楚它的分子結(jié)構(gòu)和操縱子。該多聚體酶既能夠利用質(zhì)子合成ATP，又能利用ATP水解提供的能量將質(zhì)子運(yùn)送出細(xì)胞。在LAB中，后者活性在低pH值環(huán)境中會(huì)升高，這對于維持△pH是至關(guān)重要的[33]。

谷氨酸脫羧酶體系(GAD)是由Small和Waterman描述的一個(gè)簡單的調(diào)控機(jī)制模型。它由一個(gè)谷氨酸脫羧酶、一個(gè)氨基酸通透酶和一個(gè)谷氨酸γ-氨基丁酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)體組成。乳酸菌細(xì)胞通過特異的轉(zhuǎn)運(yùn)體攝入谷氨酸之后,在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過谷氨酸脫羧酶脫羧消耗一分子的胞內(nèi)質(zhì)子,反應(yīng)的產(chǎn)物γ-氨基丁酸(GA-BA),通過反向轉(zhuǎn)運(yùn)體被排到胞外。最終結(jié)果是胞內(nèi)氫離子的消耗導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的pH值升高,胞外的谷氨酸被轉(zhuǎn)變成堿性略強(qiáng)的GABA而導(dǎo)致胞外pH值的略微升高[22]。

還有研究表明，耐酸性乳酸菌可以在強(qiáng)酸性條件下利用碳源(如葡萄糖)進(jìn)行代謝的耐酸機(jī)理,而ATP酶活性不是影響耐酸性的主要因素[34]。此外，乳酸菌耐酸特性是多種機(jī)制共同作用的結(jié)果，如雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，維持胞內(nèi)外pH平衡，細(xì)胞膜組成變化，蛋白質(zhì)、損傷修復(fù)等[35]。

3 極限溫度耐受性

3.1 極高溫耐受性乳酸菌的篩選

對于乳酸菌溫度的耐受性的研究相對來說比較少，乳酸菌的最適溫度一般在30～40℃，10℃及以下乳酸菌生長微弱甚至不生長[36]。乳酸菌溫度測試范圍大都在4～70℃之間。崔國艷等[37]從不同地方采集青貯玉米飼料、果渣、牛奶、新鮮的泡菜汁等樣品中篩選耐高溫乳酸菌，篩選出的六株乳酸菌在70℃條件下仍能生長。李檢秀[38]等通過鼠李糖乳桿菌Lactobacillus rhamnosus JCM 1553進(jìn)行紫外誘變，選育得到一株遺傳性能穩(wěn)定、耐47℃高溫的L乳酸高產(chǎn)突變菌株，為工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)L乳酸提供了新的備選菌種。

3.1.1 常見耐高溫乳酸菌菌株

楚德強(qiáng)[39]從高溫纖維乙醇發(fā)酵介質(zhì)中分離到一株高耐受性乳酸菌,經(jīng)16S rDNA分子生物學(xué)鑒定為乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)。另外，凝結(jié)芽孢桿菌屬[40]、德氏乳桿菌[37]等都有耐高溫特性相關(guān)報(bào)道。

3.2 極低溫耐受性乳酸菌的篩選

來源不同、種類不同的乳酸菌溫度生長范圍及最適生長溫度是不同的。來源于低溫環(huán)境中的乳酸菌由于相對生長溫度范圍較低，被稱之為低溫乳酸菌[41]。其在生物保鮮方面的應(yīng)用價(jià)值具有很大的潛力，也是現(xiàn)代研究乳酸菌的一個(gè)熱點(diǎn)問題。鄧梅[42]等從新疆冷水魚腸道中分理出一株耐低溫乳酸菌，其生長溫度范圍在4～37℃。

3.2.1 常見耐低溫乳酸菌菌株

耐低溫乳酸菌所屬種類比較廣泛，高陽[43]等從新疆阿勒泰地區(qū)額爾齊斯河流域冷水魚腸道中分離耐低溫的乳酸菌，24株菌其中有8株菌為嗜冷菌，最適生長溫度在20℃以下，16為耐冷菌，通過生理生化和16SrDNA序列同源性分析顯示24株耐低溫乳酸菌隸屬于6個(gè)屬，其中肉桿菌屬（Carnobacterium）3株，乳球菌屬（Lactococcus）9株，腸球菌屬（Enterococcus）7株，環(huán)絲菌屬（Brochothrix）1株，魏斯氏菌屬（W eissella）2株，鏈球菌屬（Streptococcus）2株。李小艷[44]等于10℃條件從四川泡菜中分離獲得乳酸菌36株,經(jīng)過產(chǎn)酸能力初篩、低溫測試復(fù)篩以及低溫乳酸菌界定后,得到2株耐冷性強(qiáng)、溫度生長范圍為2～40℃的菌株，經(jīng)鑒定菌株3m-1為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum),菌株8m-9為腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)。

3.3 極限溫度條件下乳酸菌的應(yīng)用

工業(yè)中，利用高溫乳酸菌可以縮短生產(chǎn)周期，節(jié)約冷卻用水，減少污染的可能性。在眾多固態(tài)發(fā)酵領(lǐng)域中一個(gè)難以解決的問題是固態(tài)發(fā)酵中迅速產(chǎn)生的高溫對乳酸菌有殺滅作用，因而選育耐高溫菌株具有極為重要的理論意義和廣闊的應(yīng)用前景[45]。耐低溫乳酸菌常用于腌漬發(fā)酵青菜、低溫青貯飼料、低溫冷藏肉、泡菜中等，在青藏高原地區(qū)多在低溫條件下進(jìn)行青貯飼料，但是市售乳酸菌添加劑達(dá)不到低溫儲(chǔ)藏的目的，因此篩選低溫條件下能夠生存的乳酸菌對于青藏高原地區(qū)青貯飼料行業(yè)來說非常重要。

4 展 望

有關(guān)乳酸菌溫度耐受性機(jī)理的研究還未見報(bào)道。乳酸菌在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、養(yǎng)殖業(yè)、食品業(yè)等方面都具有重要的作用，隨著技術(shù)的發(fā)展，它的諸多用途將會(huì)被人們發(fā)現(xiàn)。其實(shí)普通的乳酸菌，活力極弱，它們只能在相對受限制的環(huán)境中存活，一旦脫離開這些環(huán)境，其自身也會(huì)遭到滅亡。篩選出一些強(qiáng)有力的、能夠抵御各種不良環(huán)境的優(yōu)良種質(zhì)資源，才能發(fā)揮乳酸菌的生物學(xué)功效。在各種極端條件下，對乳酸菌生長狀況進(jìn)行研究是未來乳酸菌研究的一個(gè)熱點(diǎn)。優(yōu)良乳酸菌菌種資源的篩選將會(huì)極大地拓展乳酸菌的應(yīng)用范圍，并且提升其應(yīng)用價(jià)值。

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Research progress o f Lacticacid bacteria resistance under extrem e conditions

CUIMei-yan,ZHANGM iao,XU Zong-wei,WANG Jia-rui,WANG Dong,ZHANG Zhi-xia, CHEN Jun,TAN Zhong-fang

（Zhengzhou U niversity Henan Key Laboratory o f Ion Beam Bioengineering，Zhengzhou 450000，China）

Distribution of Lacticacid bacteria isvery broad in nature,among them，some specialkindsof lactic acid bacteria stillhasgood viability in extreme conditions.Screening lactic acid bacteriaw ith a strong salt tolerance,pH tolerance and aw idely growth temperature range can greatly broaden its range of applications,its resistancemechanism isahot research form icrobiologist.Wemake a review about the screening and identification of lactic acid bacteria at high concentrationsof salt,low pH,very high temperature,very low temperature and other extreme conditions,Containing its tolerancemechanism and application.

salt tolerance;pH;temperature;Lacticacid bacteria

Q935

B

1001-2230（2016）05-0028-04

2015-10-20

國家自然科學(xué)基金（41101244）；河南省基礎(chǔ)與前沿研究（1523 00410037,132300413205）；鄭州大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃。

崔美巖（1990-)，女，碩士，從事乳酸菌的分離鑒定研究。

談重芳