馮可欣 詹昱 曲佳 巫進明 陳玲珍 楊郁青 譚明珠 陳燕梅 譚雪芳 羅英

臍帶間充質干細胞培養(yǎng)的研究進展

馮可欣 詹昱 曲佳 巫進明 陳玲珍 楊郁青 譚明珠 陳燕梅 譚雪芳 羅英

目的觀察臍帶中含有的間充質干細胞體外分離、純化及培養(yǎng), 并用流式細胞儀監(jiān)測臍帶表面抗原及細胞周期, 探討臍帶間充質干細胞在組織工程及再生醫(yī)學領域應用的優(yōu)勢。方法取正常足月新生兒臍帶近胎兒端, 剔除動靜脈, 取其中的間質成分, 雙酶法消化, 從而得到原代細胞進行培養(yǎng)和純化獲得貼壁細胞, 采用流式細胞儀檢測間充質干細胞表面抗原表達情況。結果從臍帶培養(yǎng)的間充質干細胞呈成纖維狀細胞形態(tài), 表達間充質干細胞相關抗原CD105、CD44、CD13、CD29, 但不表達造血細胞抗原CD34、CD45, 不表達內皮細胞抗原CD31, 與骨髓間充質干細胞表型一致。結論臍帶來源的間充質干細胞可在體外培養(yǎng)、擴增, 具有和骨髓來源的間充質干細胞相似的生物形態(tài)和抗原表型, 為細胞治療探索出的新的來源。

臍帶；間充質干細胞；細胞培養(yǎng)；免疫表型；多向分化免疫調節(jié)

間充質干細胞是一種起源于中胚層的成體干細胞, 其具有自我更新和多向分化能力, 近年來成為研究的熱點。既往間充質干細胞主要來源于骨髓, 但隨著年齡的老化, 間充質干細胞逐漸減少, 增殖分化能力大大減退, 取材對供者有所損傷, 限制了骨髓間充質干細胞的應用。尋找一種新的可替代來源成為迫切要解決的問題。目前, 人臍帶間充質細胞已經在癌癥［1］、心臟病、糖尿?。?］、神經疾病［3］等動物實驗中證實有良好的治療效果。從臍帶里提取出間充質干細胞并進行體外培養(yǎng)、擴增、生物學鑒定, 為間充質干細胞的應用提供新的來源。

1 材料與方法

1. 1材料來源 取健康足月新生兒臍帶組織, 在胎兒出生12～24 h內進行進一步處理。

1. 2方法 采用無菌的PBS沖洗臍帶表面, 以清除多余的血液, 將臍帶剪至3～5 cm小段, 剖開臍帶, 去除臍帶中的血管、內皮, 將臍帶組織剪碎成約1 mm2小塊, 經配制的0.2%膠原酶Ⅰ(美國Sigma公司)消化過夜, 次日再予0.25%胰蛋白酶(美國Sigma公司)消化1 h, 經離心洗滌收集細胞, 取樣做單個核細胞計數, 按1×105/cm2密度將組織接種到新的有完全培養(yǎng)基(美國Stemcell公司)的75 cm2塑料培養(yǎng)瓶(美國Corning公司)中, 置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 4～5 d后全換液去除非貼壁細胞, 此后2～3 d半量換液1次, 至貼壁細胞融合至80%, 予0.25%胰酶消化, 收集懸浮細胞后按1∶4傳代。傳代至第三代后收集貼壁細胞, 應用流式細胞術進行CD44、CD105、CD29、CD34、CD45(熒光標記鼠抗人CD44-FITC、CD105-PE、CD34-PE、CD45-FITC)表面抗原檢測。

2 結果

2. 1臍帶間充質干細胞的形態(tài) 采用本方法獲得的原代細胞多于24 h內貼壁, 倒置顯微鏡下可見貼壁細胞呈梭形, 部分聚集成簇, 7～14 d細胞達80%融合, 經胰蛋白酶消化傳代后12～24 h內貼壁, 觀察此時為呈較均一的平行排列或旋渦狀的長梭形細胞, 7～10 d細胞融合至80%～90%, 繼續(xù)傳代至第十代, 細胞形態(tài)無明顯改變。

2. 2臍帶間充質干細胞的免疫表型特征 流式細胞檢測結果表明, 貼壁細胞表達CD105、CD44、CD29, 但不表達造血細胞抗原CD34、CD45, 可從臍帶分離出來的貼壁細胞為間充質干細胞。

3 討論

目前, 間充質干細胞已成為近年來干細胞生物學領域中重要的研究方向。隨著研究的深入, 發(fā)現(xiàn)間充質干細胞具有自我更新和多向分化能力, 同時產生的微環(huán)境對造血干細胞的歸巢和細胞增殖分化均具有重要意義。2000年, Rrices等［4］首次報道了臍帶血中可以分離培養(yǎng)出間充質干細胞, 隨后Ro.nlanov等又分別從臍靜脈內皮和內皮下、臍帶Whartong膠質和血管周圍組織中分離培養(yǎng)出了間充質干細胞, 并建立了臍帶間充質干細胞的分離培養(yǎng)方法。許多研究表明不同組織來源的間充質干細胞同時又具有相似的免疫表型特征［5］, 表現(xiàn)為SH2(CD105)、SH3(CD73)、SH4、CD166、CD13、CD29、CD44等粘附分子陽性, 不表達造血和內皮標記, 如CD34、CD31和CD45等。表達HLA-I, 不表達HIA-DR, 不表達協(xié)同刺激分子CD80、CD86和CD40。

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)可在胎兒血液、肝臟、骨髓、脂肪獲得間充質干細胞且各種來源的細胞之間無明顯差異, 都具有向多種中胚層和神經外胚層組織細胞分化的能力, 在一定條件下, 可被誘導分化成軟骨細胞、骨細胞、脂肪細胞、肌細胞、神經細胞和內皮細胞［6,7］。其次, 間充質干細胞獨特的細胞增殖分裂模式使外源基因易于導入和表達, 因此, 間充質干細胞是潛在的基因治療靶細胞。早期主要使用骨髓來源的間充質干細胞, 但存在以下的缺點：細胞增殖能力隨供者年齡增加而減弱；骨髓采集對供者而言為有創(chuàng)性的操作, 難以進行大規(guī)模的推廣。為此尋找新的可替代間充質干細胞供源顯得十分迫切。采用本實驗方法得到的間充質干細胞經鑒定具有與骨髓來源的間充質干細胞相似形態(tài)特點與免疫表型標記。本實驗發(fā)現(xiàn)的貼壁細胞呈長梭形, 較均一的平行排列或旋渦狀,均表達CD105、CD44、CD29, 但不表達造血細胞抗原CD34、CD45。相比于骨髓, 臍帶間充質干細胞具有以下優(yōu)勢：臍帶的獲得更容易, 對供者無創(chuàng)傷；臍帶中間充質干細胞免疫原性更低, 不表達與移植排斥相關的HLAⅡ類抗原, 也不表達由效應T細胞誘導的共刺激分子, 混合淋巴細胞檢測中呈免疫抑制, 異體移植該細胞不會發(fā)生免疫排斥反應［8-10］, 受者排斥可能性??；人臍帶中分離出的間充質干細胞在細胞含量、增殖能力上均優(yōu)于骨髓間充質干細胞, 可在體外大量擴增［11,12］；④在胎盤屏障保護下, 臍帶病毒或細菌感染機會更小；⑤不牽涉?zhèn)惱淼赖碌葐栴}。在組織工程及再生醫(yī)學領域, 問充質干細胞作為種子細胞可應用于修復替代受傷或病變的多種組織器官, 從而為目前一些無法有效治愈的重大疾病如脊髓受傷、多發(fā)性硬化(MS)、老年性癡呆、帕金森氏癥等提供了嶄新的治療方案。此外, 間充質干細胞的免疫調節(jié)、免疫抑制功能尤其值得關注。

［1］ Ben-Ami E, Berrih-Aknin S, Miller A. Mesenchymal stem cells as an immunomodulatory therapeutic strategy for autoimmune diseases. Autoimmun Rev, 2011, 10(7):410-415.

［2］ Kadam SS, Tiwari S, Bhonde RR. Simultaneous isolation of vascular endothelial cells and mesenchymal stem cells from the human umbilical cord. In Vitro Cellular & Developmental Biology- Animal, 2009, 45(1):23-27.

［3］ Harichandan A, B ü hring HJ. Prospective isolation of human MSC. Best Practice & Research Clinical Haematology, 2011, 24(1):25.

［4］ Rrices A, Conget P, Minguell JJ. Mesenchymal progenitic or cells in human umbilical cord b1ood. Br J Haematol, 2000, 109(1):235-242.

［5］ Minguelle JJ, Erices A, Conget P. Mesenchymal stem cells. BiolMed, 2001, 226(4):507-520.

［6］ 王菲, 周洪, 郭昱成, 等. 原代人臍帶間充質干細胞培養(yǎng)方法的研究. 中國組織工程研究, 2014, 18(19):3042-3047.

［7］ 范存剛, 張慶俊, 韓忠朝. 人臍帶間充質干細胞向神經細胞分化的研究. 中華神經外科雜志, 2005, 21(7):388-392.

［8］ 薛美思, 劉毅. 臍帶間充質干細胞在細胞治療中的研究進展.中國美容醫(yī)學雜志, 2008, 17(9):1405-1407.

［9］ 鄭志娟, 莊文欣, 付文玉. 人臍帶間充質干細胞的研究進展.解剖科學進展, 2008, 14(1):100-104.

［10］ 遲作華, 張洹. 臍帶血間充質干細胞的研究進展. 國際生物醫(yī)學工程雜志, 2006, 29(1):29-34.

［11］ 馬錫慧, 馮凱, 石炳毅. 人臍帶間充質干細胞生物學特性及其研究進展. 中國組織工程研究, 2011, 15(32):6064-6067.

［12］ 楊文成, 董有海. 人臍帶間充質干細胞的研究進展. 組織工程與重建外科雜志, 2010, 6(5):292-294.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2017.13.114

2017-04-11］

510620 廣東省廣州市第十二人民醫(yī)院血液內科