賈小玥 鄭黎薇 袁泉 周學(xué)東 徐欣*

1. 四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院，口腔疾病研究國家重點實驗室，四川 成都 610041 2. 四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院牙體牙髓病科，四川 成都 610041 3. 四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院兒童口腔科，四川 成都 610041 4. 四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院牙種植科，四川 成都 610041

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松(postmenopausal osteoporosis，PMO)是一類由雌激素缺乏引起的，以骨骼強(qiáng)度減弱為特點，從而誘發(fā)骨折風(fēng)險增加的骨骼疾病[1]。PMO常隱匿發(fā)病于絕經(jīng)后的女性群體中，脆性骨折是其最常見的臨床并發(fā)癥。骨折在非外傷或輕度外傷的情況下即可發(fā)生，常累及髖骨、股骨和脊柱等部位并導(dǎo)致疼痛、畸形、功能障礙甚至死亡。調(diào)查顯示PMO最嚴(yán)重的并發(fā)癥髖部骨折在發(fā)生后第一年內(nèi)的致死率為17%[2]，在隨后兩年的死亡率達(dá)12%～20%[3]。因此，對PMO進(jìn)行早期干預(yù)性治療十分重要。目前，PMO的治療藥物主要包括雙膦酸鹽、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑、激素替代劑和降鈣素等，已取得較好的臨床療效。但部分藥物的潛在并發(fā)癥及副作用也隨之突顯。雙膦酸鹽可導(dǎo)致部分患者出現(xiàn)嚴(yán)重的骨、關(guān)節(jié)或肌肉不適[4]，少數(shù)患者在患牙科疾病或接受侵入性牙科治療時發(fā)生頜骨骨壞死的風(fēng)險升高[5]。阿侖膦酸的長期使用還與股骨粗隆下和股骨骨干骨折的發(fā)生有關(guān)[6]。選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑雷洛昔芬可增加靜脈血栓栓塞癥和中風(fēng)的風(fēng)險[7]。在激素替代治療中，雌激素可增加子宮完整患者子宮內(nèi)膜增生和患癌的風(fēng)險，且膽結(jié)石病和靜脈血栓栓塞癥的發(fā)病率也增加2～3倍[1]。由此可見，亟需尋求PMO防治新靶點，開辟一條安全有效的治療途徑。

近期研究表明，腸道菌群與機(jī)體骨代謝調(diào)控密切相關(guān)。腸道菌群是定植在人體腸道內(nèi)的微生物總集，包含了大約10萬億個細(xì)菌，其菌群的總基因數(shù)是人體細(xì)胞總基因數(shù)的150倍[8]。腸道菌群主要由專性厭氧菌構(gòu)成的優(yōu)勢菌群和需氧菌或兼性厭氧菌構(gòu)成的次要菌群組成，包含了有益菌、有害菌和中性菌3類菌群。作為人體內(nèi)最大的微生物儲存庫，腸道微生態(tài)系統(tǒng)的動態(tài)平衡和變化與機(jī)體健康息息相關(guān)。研究表明，機(jī)體內(nèi)外環(huán)境的改變可破壞腸道菌群內(nèi)部以及腸道菌群與機(jī)體間的平衡狀態(tài)，引發(fā)腸炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、脊柱關(guān)節(jié)病、骨質(zhì)疏松、肥胖癥和糖尿病等炎癥性或代謝性疾病[9-12]。腸道菌群和骨骼健康或疾病狀態(tài)之間的關(guān)系受到了諸多關(guān)注，提示腸道菌群可作為PMO防治的潛在靶點。

腸道菌群的組成和結(jié)構(gòu)可通過飲食、抗生素或益生菌的使用來改變或修飾[13-17]。益生菌是一類由人體有益腸道菌組成的膳食或藥物補(bǔ)劑，可通過抑制腸道內(nèi)有害菌生長、促進(jìn)有益菌增殖來改善或維持腸道菌群的平衡，促進(jìn)宿主機(jī)體健康[18-20]。目前已知的近20種益生菌大致可分為以下5類：乳桿菌(如干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、拉曼乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌和植物乳桿菌等)、雙歧桿菌(如長雙歧桿菌、短雙歧桿菌和嬰兒雙歧桿菌等)、酵母菌、鏈球菌(如嗜熱鏈球菌等)以及其他細(xì)菌(如丙酸桿菌、糞鏈球菌、大腸桿菌等)[21]。目前關(guān)于益生菌對人體健康及疾病影響的研究主要集中在乳桿菌和雙歧桿菌。益生菌可有效改善小兒腹瀉、壞死性小腸結(jié)腸炎、抗生素相關(guān)性腹瀉、女性泌尿生殖器感染、呼吸道感染、過敏反應(yīng)、II型糖尿病和骨質(zhì)疏松等炎癥性和代謝性疾病[14,21-23]，其中益生菌與骨質(zhì)疏松的相關(guān)研究為PMO的致病機(jī)制與新治療方法的探索提供了有力的依據(jù)。本文旨在對腸道菌群在PMO致病機(jī)制中的作用、益生菌在PMO治療中的應(yīng)用以及相關(guān)作用機(jī)制的研究進(jìn)行綜述。

1 腸道菌群與PMO的相關(guān)性研究

1.1 PMO動物模型

PMO動物模型可通過手術(shù)法或化學(xué)法建立。卵巢切除術(shù)(ovariectomy，OVX)是最常見的PMO動物模型。美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)關(guān)于PMO治療用藥的臨床前與臨床評估指南表明，OVX大鼠模型中脛骨近端、股骨遠(yuǎn)端和腰椎的情況可以模擬絕經(jīng)后婦女相應(yīng)的骨質(zhì)疏松疾病狀態(tài)，且適用于骨質(zhì)疏松治療用藥療效的評估[24]?；瘜W(xué)法通過使用外源性促性腺激素釋放激素激動劑(gonadotropin releasing hormone agonists，GnRHa)抑制內(nèi)源性GnRH分泌，進(jìn)而抑制各種相關(guān)激素分泌，建立雌激素缺乏動物模型[25-26]。Kurabayashi等[25]研究發(fā)現(xiàn)，GnRHa處理時間為6個月的SD大鼠(sprague-dawley rat)在實驗第360天的骨量明顯低于用GnRHa處理3個月的SD大鼠，并且在GnRHa處理中斷后，骨密度和骨轉(zhuǎn)換率可有一定程度地恢復(fù)。因此，使用化學(xué)法建立動物模型是否能可靠地模擬PMO仍需要進(jìn)一步實驗研究驗證。目前已報道的PMO動物模型建立時間差異較大，包括8w[27]、10w[28-29]、12w[30-31]、14w[32]和16w[33-36]齡小鼠和10w[29]、13w[25]和20w[37]齡大鼠進(jìn)行OVX或GnRHa處理。動物模型建立時的鼠年齡大小可能會影響到最終的實驗結(jié)果。如果選用青春期前的鼠建立PMO模型，可因其快速的骨生長和骨改建而更易顯示出骨的變化[30]，且不能排除生長激素的干擾。而小鼠在5～6個月齡時開始出現(xiàn)不可逆的衰老癥狀[38]，可能出現(xiàn)老年性骨吸收或老年性骨質(zhì)疏松癥而對實驗形成干擾。因此，選擇成年鼠建立PMO動物模型最為適宜。

1.2 腸道菌群對PMO的影響

Li等[28]將10周齡的雌性C57BL/6L小鼠分為無菌組、無特定病原體(specific pathogen free，SPF)組和無菌鼠定植常規(guī)腸道菌群組，并對以上3組小鼠均進(jìn)行為期10 w的GnRHa亮丙瑞林藥物誘導(dǎo)雌激素缺乏和對照處理。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照處理的無菌小鼠相比，亮丙瑞林處理的無菌小鼠腸道與骨髓中促破骨細(xì)胞形成因子腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、核因子κ B受體活化因子配體(receptor activator for nuclear factor-κ B ligand，RANKL)和白細(xì)胞介素17(interleukin-17，IL-17)的量無顯著增加，同時兩者骨小梁體積分?jǐn)?shù)(bone volume/trabecular volume，BV/TV)的差異也無統(tǒng)計學(xué)意義，而SPF和腸道菌定植小鼠中，亮丙瑞林處理組的促破骨細(xì)胞形成因子明顯高于對照組，且BV/TV值明顯低于對照組。該研究提示在無菌小鼠中，雌激素缺乏不會誘發(fā)骨小梁吸收，腸道細(xì)菌在雌激素缺乏所誘導(dǎo)的松質(zhì)骨吸收中必不可少。此外，PMO骨吸收與基因背景密切相關(guān)。宿主的基因背景一方面可通過基礎(chǔ)骨量的差異影響骨吸收率[31]，另一方面依賴于各種腸道抗原呈遞細(xì)胞(antigen presenting cell，APC)的特異性分布[39]。腸道菌群則可能通過生成不同的致病產(chǎn)物作用于腸道APC，進(jìn)而影響骨吸收。

1.3 益生菌在PMO治療中的作用

益生菌可顯著抑制雌激素缺乏所誘導(dǎo)的骨吸收。Britton等[30]將12周齡Balb/c小鼠分為OVX處理組和對照處理組，并在手術(shù)1w后均給予為期4w的羅伊氏乳桿菌ATCC PTA 6475治療，實驗結(jié)果表明該益生菌可完全阻止OVX小鼠股骨和椎骨骨松質(zhì)的吸收，其BV/TV值和非OVX組小鼠相近，其他相應(yīng)的參數(shù)(如骨小梁厚度、骨小梁數(shù)量和骨小梁間隙)亦有改善。Li等[28]分別用益生菌鼠李糖乳桿菌GG(lactobacillus rhamnosus GG，LGG)、鼠李糖乳桿菌菌毛突變株(LGG pili mutant LGG，LGGM)、大腸桿菌和市售VSL#3益生菌混合制劑(包含短雙歧桿菌、長雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、乳桿菌嗜酸、植物乳桿菌、干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌等8種益生菌)對OVX術(shù)后的C57BL/6L小鼠灌胃4w，結(jié)果顯示在OVX術(shù)后2w和4w，僅LGG組和VSL#3組的小鼠脊柱的BV/TV值均與基線一致，提示益生菌LGG和VSL#3可完全抑制OVX誘導(dǎo)的脊柱骨小梁的吸收，而大腸桿菌處理組與對照組小鼠BV/TV值顯著降低，LGGM處理組小鼠BV/TV值亦有一定減少。Ohlsson等[27]研究表明副干酪乳酸桿菌DSM 13434和3種益生菌混合物(副干酪乳酸桿菌DSM 13434、植物乳桿菌DSM 15312和DSM 15313)均能完全抑制OVX小鼠的骨皮質(zhì)吸收。

益生菌對骨組織的作用受機(jī)體全身狀況影響。McCabe等[32]用羅伊氏乳桿菌ATCC PTA 6475對15周齡C57BL/6L小鼠灌胃4w，發(fā)現(xiàn)該益生菌可改善健康雄鼠股骨遠(yuǎn)端干骺區(qū)和腰椎的骨小梁參數(shù)，而對健康雌鼠無明顯影響，提示羅伊氏乳桿菌對骨的影響與宿主雌激素水平相關(guān)。該益生菌可能通過激活雄性小鼠體內(nèi)的雌激素途徑影響骨代謝，而成年雌性小鼠體內(nèi)的雌激素充足，因此成年雌鼠對羅伊氏乳桿菌的作用不敏感。Collins等[40]對行背部切口和未做背部切口的雌激素充足的12周齡雌性Balb/c小鼠予以羅伊氏乳桿菌 ATCC PTA 6475治療8w，結(jié)果顯示該菌株只能顯著增加背部切口處理組雌鼠股骨遠(yuǎn)端的BV/TV值和骨小梁數(shù)量并降低其骨小梁間隙，而骨皮質(zhì)的結(jié)構(gòu)和強(qiáng)度無明顯改變。同樣，Li等[28]對雌性C57BL/6L小鼠進(jìn)行OVX和假手術(shù)對照處理，隨后予以4w的益生菌LGG或混合益生菌制劑VSL#3治療，結(jié)果顯示益生菌治療的假手術(shù)組雌鼠的脊柱BV/TV值相對于基線時有明顯增加。由此可見，宿主的炎癥免疫狀態(tài)可能是驅(qū)動益生菌對骨組織的作用的一條途徑。

2 腸道菌群、雌激素和益生菌在PMO致病與治療過程中的交互作用機(jī)制

由腸道菌群介導(dǎo)、雌激素缺乏所誘發(fā)的骨吸收本質(zhì)是由抗原導(dǎo)致的免疫反應(yīng)過程。腸道菌群、腸道上皮屏障和宿主免疫系統(tǒng)的動態(tài)平衡與交互作用維持并促進(jìn)宿主機(jī)體健康。當(dāng)各種內(nèi)外因素破壞腸道微生態(tài)系統(tǒng)與宿主的平衡狀態(tài)時，腸道菌群作為抗原侵入宿主體內(nèi)，引發(fā)一系列免疫反應(yīng)，導(dǎo)致骨量與骨結(jié)構(gòu)的改變。益生菌可通過作用于腸道菌群、宿主上皮屏障和免疫系統(tǒng)，恢復(fù)腸道微生態(tài)系統(tǒng)與宿主之間的穩(wěn)態(tài)，抑制免疫反應(yīng)，阻止骨的吸收和破壞。

2.1 腸道菌群生物多樣性

宿主絕經(jīng)期前，雌激素充足且機(jī)體處于健康狀態(tài)，腸道菌群呈現(xiàn)生物多樣性。有益菌為優(yōu)勢菌群，可抑制有害菌的生長和有害物質(zhì)的產(chǎn)生，維持腸道菌群的穩(wěn)定性。絕經(jīng)后機(jī)體雌激素缺乏，當(dāng)腸道菌群受到外部或內(nèi)部因素作用時，其組成和結(jié)構(gòu)可發(fā)生變化，導(dǎo)致其生物多樣性降低。Flores等[41]通過對25名男性、7名絕經(jīng)后女性和19名未絕經(jīng)女性的臨床研究發(fā)現(xiàn)，在男性和絕經(jīng)后女性中，尿總雌激素和雌激素代謝物的水平不但與糞便中微生物豐富程度和α多樣性密切相關(guān)，且與糞便中梭菌類的豐度顯著相關(guān)。Fuhrman等[42]對60名隨機(jī)挑選的健康絕經(jīng)后女性進(jìn)行檢查，結(jié)果顯示糞便中微生物的多樣性、梭菌屬和桿菌屬的相對豐度與尿雌激素代謝產(chǎn)物正相關(guān)，且腸道微生物多樣性隨著尿中羥基化雌激素代謝產(chǎn)物比例的增高而增加。雌激素水平降低致使腸道菌群的多樣性減少，包括梭菌屬在內(nèi)的厚壁菌門細(xì)菌豐度降低[12, 41-42]。厚壁菌門細(xì)菌具有免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)作用，其中梭菌屬可以上調(diào)免疫調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory cells，Tregs)的形成和功能，后者在維持宿主免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)方面有重要作用[43-44]。因此，雌激素缺乏可導(dǎo)致腸道菌群生物多樣性破壞，具有免疫調(diào)節(jié)的有益菌群數(shù)量減少，條件致病菌數(shù)量增加，從而啟動一系列炎癥免疫反應(yīng)，導(dǎo)致疾病。

在PMO治療中，益生菌可通過改變宿主腸道菌群組成、恢復(fù)其多樣性和穩(wěn)態(tài)來抑制骨吸收。Preidis等[45]分別用單一益生菌羅伊氏乳桿菌DSM 17938和羅伊氏乳桿菌ATCC PTA 6457對遠(yuǎn)交系CD1新生小鼠進(jìn)行灌胃，24h后發(fā)現(xiàn)兩組小鼠糞便微生物組群的多樣性和均勻度均有增加。羅伊氏乳桿菌可產(chǎn)生具有抗菌作用的羅伊氏菌素，后者通過對蛋白質(zhì)和小分子進(jìn)行巰基化修飾來誘導(dǎo)細(xì)胞中的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而抑制擬桿菌屬等有害菌，增加具有免疫調(diào)節(jié)作用的梭菌數(shù)量[30, 46]。乳酸乳球菌G50可抑制產(chǎn)H2S的有害菌，增強(qiáng)小鼠腸道菌群的穩(wěn)定性[38]。Kimoto-Nira等[47]通過用SAMP6小鼠建立老年性骨質(zhì)疏松模型，研究發(fā)現(xiàn)益生菌乳酸乳球菌H61可抑制腸道內(nèi)葡萄球菌屬的數(shù)量，并改善部分老年性骨質(zhì)疏松的臨床癥狀(如皮膚潰瘍和脫發(fā))，但該益生菌是否在PMO治療中起到相同的作用尚未見相關(guān)報道。因此，益生菌可通過合成胞外物質(zhì)等途徑抑制有害菌的生長和有害代謝物的產(chǎn)生，改變腸道菌群的組成和結(jié)構(gòu)，從而增加腸道菌群生物多樣性并抑制骨吸收。

2.2 腸道上皮屏障

腸道上皮是宿主抵抗腸道致病菌的物理屏障和第一道防線，不僅可選擇性吸收水和營養(yǎng)物質(zhì)，還能限制外源性有害抗原物質(zhì)入侵宿主體內(nèi)。腸道上皮屏障功能主要依賴跨細(xì)胞途徑和細(xì)胞旁途徑。其中細(xì)胞旁途徑的基本結(jié)構(gòu)為緊密連接(tight junction，TJ)，其滲透性可由跨上皮電阻(transepithelial electrical resistance，TEER)來反映，TER增加，細(xì)胞旁途徑的滲透性降低[48-49]。TJ是一個由Claudins蛋白、Occludin蛋白和Zo蛋白組成的蛋白復(fù)合體結(jié)構(gòu)。生理或病理因素均可影響TJ蛋白的合成與分布，改變TJ的滲透性和完整性。各種刺激因素主要通過蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、蛋白激酶G(protein kinase G，PKG)、絲氨酸/蘇氨酸(serine/threonine，Ser/Thr)、Rho、促分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)、磷脂酰肌醇3激酶/Akt(phosphatidylinositol 3-kinase/Akt，PI3k/Akt)以及肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase，MLCK)等途徑對TJ蛋白磷酸化來調(diào)控[50-51]。因此，TJ的完整性和對離子、小分子的選擇性滲透特性對腸道上皮的屏障功能具有重要影響。

機(jī)體雌激素水平較高時，雌激素與腸道上皮的雌激素受體作用，激活三磷酸鳥苷結(jié)合蛋白Ras和一系列胞質(zhì)激酶(Raf、MEK1/2和Erk1/2)，誘導(dǎo)胞質(zhì)蛋白以及胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化，上調(diào)TJ跨膜蛋白Occludin的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)腸道上皮屏障的功能，抵抗腸道細(xì)菌及相關(guān)代謝產(chǎn)物侵入[50, 52-54]。絕經(jīng)后，雌激素缺失導(dǎo)致以上效應(yīng)減弱，腸道上皮細(xì)胞旁途徑的滲透性增加，腸道菌的有害代謝產(chǎn)物作為抗原進(jìn)入上皮下組織引發(fā)免疫反應(yīng)。同時，免疫反應(yīng)中生成的大量TNF-α和干擾素γ(interferon-γ，IFN-γ)可激活MAPK通路中的Ras-Raf-MEK1/2-Erk1/2與MLKs- MKK3/6-p38途徑，下調(diào)TJ蛋白Occludin和Zo-1并增加TJ陽離子通道組成蛋白Claudin-2的合成，導(dǎo)致細(xì)胞旁途徑的滲透性增加[55]。此外，促炎因子IL-17可以通過激活MAPK通路中的Ras-Raf-MEK1/2-Erk1/2途徑來上調(diào)TJ蛋白Claudin-1的表達(dá)，增強(qiáng)腸道上皮功能[56]。然而IL-17對腸道上皮屏障功能的正向作用不能完全抵消TNF-α和IFN-γ對上皮屏障功能的減損，可能與TNF-α和IFN-γ是腸道菌誘發(fā)的機(jī)體免疫反應(yīng)中最主要的促炎因子有關(guān)。

在PMO治療中，益生菌可增強(qiáng)腸道上皮屏障的功能，減少腸道致病菌及其有害代謝產(chǎn)物侵入宿主。益生菌可通過改變與TJ相關(guān)的蛋白表達(dá)，調(diào)節(jié)TJ蛋白的合成與分布，降低腸道上皮屏障的滲透性。Anderson等[57]通過測量單層人克隆結(jié)腸腺癌細(xì)胞(the human colon carcinoma cell line，Caco-2)層的TEER值來評估植物乳桿菌MB452對TJ完整性的影響，發(fā)現(xiàn)該益生菌可增加單層結(jié)腸癌細(xì)胞間的TEER且該效應(yīng)和益生菌的使用劑量有關(guān)；植物乳桿菌MB452可誘導(dǎo)與TJ相關(guān)的19個基因的表達(dá)改變，其中包括跨膜蛋白Occludin和附著斑蛋白Zo的基因表達(dá)上調(diào)，同時還通過影響微管蛋白和蛋白酶的基因表達(dá)來增強(qiáng)腸道上皮屏障功能。Qin等[58]亦通過建立Caco-2模型，證實植物乳桿菌可以通過增加Claudin-1、Occludin和Zo-1等TJ蛋白的表達(dá)并重排TJ蛋白，改善由腸侵襲性大腸桿菌誘導(dǎo)的Caco-2單層細(xì)胞完整性破壞和滲透性增高。Ewaschuk等[59]分別在存在或缺失TNF-α和IFN-γ因子的情況下，應(yīng)用嬰兒雙歧桿菌培養(yǎng)基培養(yǎng)T84人上皮細(xì)胞，并且對IL-10缺乏的小鼠分別予以嬰兒雙歧桿菌Ussing灌流室短時處理或為期4w的嬰兒雙歧桿菌治療，以觀察該益生菌對結(jié)腸上皮滲透性的急速效應(yīng)或長期影響。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)嬰兒雙歧桿菌可通過分泌多肽生物活性因子來提高磷酸化ERK水平并降低磷酸化p38水平，上調(diào)TJ蛋白Zo-1和Occludin表達(dá)，并減少Claudin-2生成，增加上皮細(xì)胞的TER，最終增強(qiáng)上皮屏障功能。此外，嬰兒雙歧桿菌可抑制由炎癥因子TNF-α和IFN-γ誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞TER降低，同時重排TJ蛋白。Mennigen等[60]對由葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium，DSS)誘發(fā)急性結(jié)腸炎的小鼠給予益生菌混合物VSL#3處理，發(fā)現(xiàn)VSL#3可顯著增加Occludin、Zo-1和Claudin-1等蛋白表達(dá)和重新分布，最終降低腸道上皮的滲透性。

益生菌還可通過影響腸道上皮細(xì)胞的生長和運動來調(diào)節(jié)上皮屏障功能。Panigrahi等[61]研究表明益生菌可改變與腸道上皮轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白質(zhì)合成、代謝、細(xì)胞粘附、泛素化和細(xì)胞凋亡等過程相關(guān)的基因表達(dá)，影響宿主各種生理和病理過程。益生菌對腸道上皮細(xì)胞凋亡的抑制作用在Mennigen[60]的研究中也得到證實。Preidis等[45]通過向遠(yuǎn)交系CD1新生小鼠分別灌食羅伊氏乳桿菌菌株DSM17938和羅伊氏乳桿菌菌株ATCC PTA 6475，結(jié)果顯示羅伊氏乳桿菌DSM 17938可大幅增加小鼠腸上皮細(xì)胞的遷移、增殖和腸道上皮隱窩深度，而菌株ATCC PTA 6475只增加細(xì)胞遷移而不影響隱窩細(xì)胞增殖活性，進(jìn)而改善腸道上皮的屏障功能和吸收功能。Ardita等[62]進(jìn)一步揭示了益生菌影響腸道上皮增殖的作用機(jī)制。LGG通過SPAC菌毛蛋白亞基促進(jìn)LGG對腸道上皮的直接黏附、誘導(dǎo)腸道上皮表達(dá)生理水平的ROS，后者可作為第二信使激活細(xì)胞外信號并調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)ERK/MAPK信號通路，最終誘導(dǎo)腸道上皮細(xì)胞的增殖。Jones等[63]研究發(fā)現(xiàn)鼠或果蠅腸內(nèi)植物乳桿菌的定植可誘導(dǎo)NADPH氧化酶1(NADPH oxidase 1，NOX1)依賴性的ROS生成和腸道上皮細(xì)胞增殖，對維持腸穩(wěn)態(tài)過程起著關(guān)鍵作用。此外，益生菌可阻止腸道致病菌及相關(guān)產(chǎn)物對腸道上皮的毒性作用。Han等[64]發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌能減少腸道上皮細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白的水平和分布，進(jìn)而有效抑制革蘭氏陰性菌內(nèi)毒素(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的腸道上皮細(xì)胞的自噬，改善和維持腸道上皮的屏障功能。

2.3 宿主免疫反應(yīng)

免疫系統(tǒng)是宿主抵抗腸道致病菌的最后一道防線，也是PMO病理過程和治療干預(yù)的最后環(huán)節(jié)。腸道上皮下固有層的APC可分為樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)和巨噬細(xì)胞[39]。所有巨噬細(xì)胞和DC均能夠誘導(dǎo)Foxp3+Tregs的分化，且巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)更高效[39]。相比之下，只有部分DC能有效誘導(dǎo)Th17細(xì)胞的分化[39]。Treg細(xì)胞是一組能抑制Th1、Th2和Th17分化和功能的CD4+T細(xì)胞[65]，可分泌抗炎因子IL-4、IL-10和轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)，抑制單核細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞[66-69]。因此，Treg細(xì)胞在維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)和避免骨吸收中起著重要作用。Th17細(xì)胞具有顯著的促破骨細(xì)胞分化能力，可分泌高水平的IL-17、RANKL和TNF-α[70]，參與PMO骨吸收。

腸道菌群多樣性與較高的雌激素水平均有助于維持機(jī)體免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)。Atarashi等[43]在小鼠腸道菌群中進(jìn)行梭菌菌株的定植，發(fā)現(xiàn)梭菌屬能促進(jìn)Treg細(xì)胞的聚集、增加Treg細(xì)胞的數(shù)量并增強(qiáng)其功能，形成一個富含TGF-β的環(huán)境，進(jìn)而抑制破骨細(xì)胞的形成。雌激素則主要通過下調(diào)機(jī)體炎癥免疫應(yīng)答，影響破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞兩條途徑來抑制骨吸收[71]。雌激素可直接作用于破骨細(xì)胞表面的雌激素受體(estrogen receptor，ER)并激活促凋亡的Fas/FasL系統(tǒng)，誘導(dǎo)成熟破骨細(xì)胞凋亡[72-75]；雌激素還可激活Treg細(xì)胞并增加TGF-β1的生成，或通過ER抑制Th17細(xì)胞的分化并減少TNF-α和RANKL的生成，間接抑制破骨細(xì)胞的形成[66-67,69,76-78]。此外，雌激素可通過激活胞外信號調(diào)節(jié)激酶轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，阻止成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞凋亡[75,79]。

絕經(jīng)后雌激素缺失和腸道有益菌減少可導(dǎo)致以上骨保護(hù)效應(yīng)減弱。有害抗原經(jīng)腸道上皮進(jìn)入宿主體內(nèi)并引發(fā)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。首先，雌激素缺乏可增強(qiáng)DC和巨噬細(xì)胞的抗原呈遞功能。雌激素缺失誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)堆積[80-81]，后者增強(qiáng)DC的功能并激活CD4+T細(xì)胞，隨即增加的IFN-γ通過上調(diào)MHCII的生成增強(qiáng)骨髓巨噬細(xì)胞(bone marrow macrophage，BMM)功能[82-86]。雌激素缺乏還可通過上調(diào)CD80的表達(dá)增加骨髓中DC數(shù)量并增強(qiáng)其功能[83]。骨髓DC和BMM功能的增強(qiáng)可直接上調(diào)包括Th17在內(nèi)的CD4+T細(xì)胞的數(shù)量和活性[65,87]。除抗原呈遞的直接激活作用外，雌激素缺乏誘導(dǎo)的IFN-γ、IL-7增加和TGF-β降低也可間接導(dǎo)致部分骨髓T細(xì)胞的活化與增殖[65, 87-88]，產(chǎn)生大量TNF-α，誘導(dǎo)PMO骨吸收[78,89-92]。TNF-α在誘導(dǎo)PMO骨吸收過程中具有重要地位，其可通過CD40L和DLK1/FA-1誘導(dǎo)RANKL和巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor，M-CSF)的生成，并下調(diào)骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)[65, 83, 93]。TNF-α還可直接作用于破骨細(xì)胞前體細(xì)胞并促進(jìn)其分化成熟[94]，并可通過受體p55來增強(qiáng)BMM對M-CSF和RANKL誘導(dǎo)的反應(yīng)，間接促進(jìn)BMM分化形成破骨細(xì)胞[78]。雌激素缺失還可上調(diào)成骨細(xì)胞表面Act1適配蛋白的表達(dá)并激活I(lǐng)L-17信號通路，最終誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的形成[95- 96]。因此，包括Th17細(xì)胞在內(nèi)的CD4+T細(xì)胞和TNF-α等促破骨細(xì)胞生成因子是腸道菌介導(dǎo)的PMO骨吸收的關(guān)鍵因素。

在PMO治療中，益生菌可通過調(diào)節(jié)機(jī)體對腸道菌群的免疫反應(yīng)，抑制骨吸收。益生菌可通過分泌小分子物質(zhì)調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)過程。益生菌可通過發(fā)酵底物合成短鏈脂肪酸(short chain fatty acids，SCFAs)。GPR41和GPR43是SCFAs的受體，其中GPR43主要分布在中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞等免疫細(xì)胞中[97]。SCFAs特別是丁酸可通過與GPR43受體結(jié)合，特異性抑制單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)生成，抑制由LPS誘導(dǎo)的TNF-α、INF-γ和IL-12等細(xì)胞因子合成，同時上調(diào)抗炎因子TGF-β1、IL-4和IL-10的表達(dá)，最終激活CD4+Treg，下調(diào)炎癥免疫反應(yīng)[27, 97-101]。此外，羅伊氏乳桿菌6475可轉(zhuǎn)化膳食中L-組氨酸生成組胺，通過H2受體阻止MEK1/2和下游ERK1/2通路的激活，進(jìn)一步抑制單核細(xì)胞生成TNF-α[102]。乳桿菌屬還可通過表達(dá)具有相關(guān)DNA基序抑制作用的分子配體，阻止炎癥過程中DC的功能，并促進(jìn)Treg細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[103]。

3 展望

PMO骨吸收是雌激素、腸道菌群和機(jī)體免疫系統(tǒng)相互作用的結(jié)果。雌激素缺失誘導(dǎo)腸道菌群失調(diào)、腸道上皮屏障功能減弱和免疫系統(tǒng)反應(yīng)性增強(qiáng)，導(dǎo)致腸道致病菌有害代謝物可以通過腸道上皮屏障進(jìn)入機(jī)體，進(jìn)一步引發(fā)CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，生成大量以TNF-α為主的促破骨細(xì)胞生成因子，最終促進(jìn)破骨細(xì)胞的激活和骨吸收。其中，腸道菌群是PMO致病過程中的始發(fā)因素。而益生菌可從調(diào)節(jié)腸道菌群、恢復(fù)腸道上皮屏障功能和穩(wěn)定機(jī)體免疫系統(tǒng)等途徑來抑制骨吸收和避免骨組織結(jié)構(gòu)的破壞。

盡管目前已有部分研究深入探討了PMO致病過程中的免疫應(yīng)答機(jī)制，有關(guān)腸道菌群介導(dǎo)的免疫反應(yīng)上游調(diào)控過程和相關(guān)的基因仍不清楚，雌激素缺失誘導(dǎo)腸道菌生物多樣性改變的分子機(jī)制亟待深入研究。IFN-γ和IL-7在促進(jìn)骨髓DC和BMM抗原呈遞功能增強(qiáng)方面的作用正逐漸受到關(guān)注，其直接影響了隨后的T細(xì)胞的激活與破骨細(xì)胞的分化。此外，盡管現(xiàn)有研究顯示益生菌具有眾多調(diào)節(jié)功能，不同益生菌對宿主的影響是否具有個體差異性或種屬特異性仍待進(jìn)一步研究。同時，益生菌在PMO治療中的生物安全性、安全劑量、最適劑量和劑型的確定也亟需相應(yīng)的動物實驗和臨床試驗中研究驗證。將腸道菌群作為PMO致病過程中的關(guān)鍵因素有望全面揭示PMO骨吸收的分子機(jī)制，為PMO的臨床治療提供新的靶點與模式。