楊 芹,陳曉華,2,*,張 灝,陳 衛(wèi),陳永泉

(1.江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無(wú)錫 214122;2.衡陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)與環(huán)境學(xué)院,湖南衡陽(yáng) 421008)

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基于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的乳酸菌輔助發(fā)酵過(guò)程中腐乳組分變化的分析

楊 芹1,陳曉華1,2,*,張 灝1,陳 衛(wèi)1,陳永泉1

(1.江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無(wú)錫 214122;2.衡陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)與環(huán)境學(xué)院,湖南衡陽(yáng) 421008)

采用代謝組學(xué)的思路,利用GC/MS聯(lián)用方法分析了腐乳在常規(guī)毛霉菌發(fā)酵以及鼠李糖乳桿菌GG株(LactobacillusrhamnosusGG strain,LGG)輔助發(fā)酵過(guò)程下其化合物的變化。分離鑒定85個(gè)化合物,涉及到氨基酸,有機(jī)酸和糖類(lèi)等物質(zhì),其中33個(gè)化合物的定性結(jié)果得到了標(biāo)樣驗(yàn)證。通過(guò)對(duì)發(fā)酵過(guò)程中化合物種類(lèi)及其濃度變化的分析發(fā)現(xiàn)在添加乳酸菌LGG輔助發(fā)酵的腐乳中,丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸等甜味氨基酸和天冬氨酸等鮮、酸味氨基酸的含量顯著高于常規(guī)毛霉菌發(fā)酵的腐乳,這為在實(shí)際的腐乳生產(chǎn)及工藝流程優(yōu)化時(shí)考慮加入乳酸菌來(lái)改善腐乳成品的口味提供了物質(zhì)依據(jù)。但實(shí)驗(yàn)中同時(shí)也發(fā)現(xiàn),LGG輔助發(fā)酵條件不會(huì)促進(jìn)腐乳后期發(fā)酵速度的加快?；谏鲜鼋Y(jié)論,在腐乳的發(fā)酵過(guò)程中,可以通過(guò)添加乳酸菌來(lái)進(jìn)行輔助發(fā)酵,以此調(diào)控、優(yōu)化腐乳發(fā)酵的生化過(guò)程。同時(shí)該工作亦表明代謝組學(xué)的研究思路可以用于優(yōu)化腐乳發(fā)酵過(guò)程工藝設(shè)計(jì),也適用于類(lèi)似的傳統(tǒng)發(fā)酵食品發(fā)酵過(guò)程的監(jiān)控。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用,乳酸菌,腐乳發(fā)酵,代謝組學(xué),氨基酸

腐乳為常規(guī)發(fā)酵食品,它是以大豆為原料,在毛霉菌等微生物的作用下進(jìn)行發(fā)酵而成,在我國(guó)食用豆腐乳已有上千年的歷史。腐乳的發(fā)酵過(guò)程可以分為前期發(fā)酵與后期發(fā)酵兩個(gè)階段。在腐乳的發(fā)酵過(guò)程中豆腐坯中的蛋白質(zhì)在微生物的作用下會(huì)分解為游離氨基酸以及一些風(fēng)味物質(zhì);淀粉等在這個(gè)過(guò)程中轉(zhuǎn)化為酒精與有機(jī)酸。同時(shí)腐乳發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的小分子還會(huì)與輔料中的香料、酒等相互作用,生成酯類(lèi)等具有特殊風(fēng)味的腐乳成品[1]。

腐乳的發(fā)酵過(guò)程實(shí)際上是一個(gè)多酶系協(xié)同作用下的一個(gè)復(fù)雜的生物化學(xué)過(guò)程,其發(fā)酵過(guò)程的變化及終點(diǎn)時(shí)的營(yíng)養(yǎng)組成與參與腐乳發(fā)酵的微生物的種類(lèi)息息相關(guān)[2]。目前用于腐乳生產(chǎn)及使用在腐乳發(fā)酵前期的微生物主要是毛霉屬、根霉屬、細(xì)菌中芽孢桿菌屬和微球菌屬等,以霉菌為主[3]?？紤]到毛霉耐溫范圍窄、根霉菌絲稀疏以及其蛋白酶和肽酶活性低而細(xì)菌中芽孢菌的含量較少等原因,有必要開(kāi)發(fā)具有很好抗雜菌能力和優(yōu)良發(fā)酵性能的菌種,擴(kuò)展用以腐乳生產(chǎn)的菌種類(lèi)型。另一方面,亦可以通過(guò)在后發(fā)酵開(kāi)始時(shí)添加合適的微生物來(lái)達(dá)到縮短腐乳的發(fā)酵周期、改善其口味、品質(zhì)等目的。此類(lèi)微生物的篩選可以通過(guò)追蹤腐乳生產(chǎn)過(guò)程中酶活力及化學(xué)組分的變化,考察實(shí)際生產(chǎn)中微生物對(duì)腐乳發(fā)酵成熟、縮短生產(chǎn)周期和提高腐乳品質(zhì)等因素的影響來(lái)實(shí)現(xiàn)。周熒等[4]分析了腐乳發(fā)酵過(guò)程中化學(xué)組分含量和質(zhì)構(gòu)參數(shù)的變化,發(fā)現(xiàn)低鹽含量下腐乳游離氨基酸和游離脂肪酸的含量較高,且腐乳成熟時(shí)間較短。Serrazanetti等[5]將乳酸菌(Lactobacilluscasei和Lactobacillusacidophilus)應(yīng)用于豆腐發(fā)酵,并分析了發(fā)酵后豆腐中的抗菌化合物。他們發(fā)現(xiàn)L.casei和L.acidophilus的聯(lián)合使用可以延長(zhǎng)豆腐的貨架期,而且發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的化合物及其感官特性與使用的發(fā)酵菌株息息相關(guān)。他們還指出,乳酸菌用做發(fā)酵菌株可以抑制豆腐中多不飽和脂肪酸的過(guò)氧化,降低其中醇類(lèi)化合物的氧化。

本文采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(GC/MS)技術(shù)分析腐乳在不同發(fā)酵條件下不同時(shí)間點(diǎn)的小分子變化,討論鼠李糖乳桿菌GG株(LactobacillusrhamnosusGG strain,LGG,ATCC53103)輔助發(fā)酵條件對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響,為腐乳品質(zhì)的改善及工藝的改進(jìn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

正己烷與甲醇 購(gòu)于天地公司(色譜純,Tedia Company Inc.,USA);鹽酸甲氧胺和無(wú)水吡啶 購(gòu)自百靈威公司(J&K Chemical Ltd.,China);硅烷化試劑N-甲基-N-三甲基硅三氟乙酰胺(MSTFA) 購(gòu)于西格瑪公司(Sigma-Aldrich Co.,USA);十五碳酸甲酯(FAME C15∶0) 購(gòu)于Nu-Chek公司(Nu-Chek Prep,Inc.,USA);實(shí)驗(yàn)用水 由Milli-Q8超純水發(fā)生器(Millipore Co.,USA)制備;豆腐白坯 購(gòu)于當(dāng)?shù)爻?鼠李糖乳桿菌GG株(LactobacillusrhamnosusGG strain,LGG,ATCC53103) 購(gòu)于中國(guó)普通微生物菌種管理中心，保存在江南大學(xué)食品生物技術(shù)中心菌種保藏中心。

Trace1310-TSQ 8000 Evo氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)賽默飛公司;Rtx-5 MS毛細(xì)管色譜柱(0.25 mm×30 m,0.25 μm) 美國(guó)Restek公司;Milli-Q8超純水發(fā)生器 美國(guó)密理博公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備 實(shí)驗(yàn)室使用的豆腐乳樣本,由豆腐白坯開(kāi)始,將豆腐坯側(cè)面放入蒸籠,行間留約1 cm左右空間,以通氣散熱,促進(jìn)毛霉菌生長(zhǎng)。采用自然接種法接種毛霉菌,溫度控制在20～24 ℃,接種22 h開(kāi)始第一次翻格,以調(diào)節(jié)上下溫差和補(bǔ)充空氣;培養(yǎng)到28 h進(jìn)行第二次翻格,36 h時(shí)菌絲生長(zhǎng)成熟。45 h時(shí)毛霉呈現(xiàn)淺黃色,此時(shí)通風(fēng)降溫,搭蒸籠涼花,促進(jìn)毛霉散熱和水分散發(fā)。毛霉涼透之后,將相互依連的毛霉菌絲分開(kāi),搓毛,使其包住豆腐坯。同時(shí),在拌料盆內(nèi)依次加入食鹽、辣椒粉、五香粉用勺拌勻,將搓毛后的豆腐坯裹滿配料依次排列、壓平置消毒好的瓶子,分層加料。其中LGG輔助發(fā)酵組在拌料時(shí)將LGG菌加入配料。豆腐坯裝瓶后灌入茶油,茶油淹過(guò)坯面2 cm。此時(shí)要注意茶油不宜過(guò)滿以防止發(fā)酵時(shí)涌出瓶外,之后加蓋封嚴(yán)進(jìn)行后發(fā)酵。腐乳的后發(fā)酵在貯藏過(guò)程中完成,在常溫條件下,一般經(jīng)過(guò)1～3個(gè)月左右腐乳可發(fā)酵成熟。

將保存在-80 ℃的LGG接入液體MRS培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)18 h,活化三代。LGG培養(yǎng)液離心,菌體用PBS清洗2次,調(diào)濃度為109cfu/mL,以5%(v/g)的含量采用噴灑方式攪拌到配料中,大概配料中含有5×107CFU/g LGG。

1.2.2 樣品處理 腐乳凍干研磨成粉,稱(chēng)取5 mg,加入0.5 mL正己烷,超聲1 min,置振蕩器上(轉(zhuǎn)速:60 r/min)振蕩30 min后,3600 r/min離心10 min傾去上清。殘?jiān)偌尤?.5 mL正己烷,按上述條件超聲,振蕩,離心,再次棄去上清,留殘?jiān)?。所得殘?jiān)尤?.5 mL 80%甲醇水溶液,超聲1 min,置振蕩器上(轉(zhuǎn)速:60 r/min)振蕩30 min后,3600 r/min離心10 min,取上清,冷凍離心機(jī)凍干,即為樣品中的極性組分。

樣品極性組分溶于40 μL 20 mg/mL的鹽酸羥甲胺吡啶溶液,37 ℃水浴加熱肟化90 min,然后加入40 μL MSTFA在37 ℃下硅烷化60 min。反應(yīng)完畢,添加40 μL FAME(C15∶0,1 mg/mL)作為內(nèi)標(biāo),渦旋,13000 r/min離心15 min,取上清進(jìn)樣分析。

另取各腐乳凍干粉5 mg混勻,稱(chēng)取混勻樣5 mg共6份,按上述方法提取,作為質(zhì)控(quality control,QC)樣品,監(jiān)控處理方法的重復(fù)性及分析過(guò)程中儀器的穩(wěn)定性。

1.2.3 樣品分析條件 衍生后樣品在Trace1310氣相色譜儀上分析,進(jìn)樣口溫度為240 ℃,載氣為高純氦氣,采用恒流模式,流速為1.5 mL/min;進(jìn)樣體積為1 μL,分流比10∶1。色譜柱為Rtx-5MS,柱溫箱的初始溫度為70 ℃,5 ℃/min升至230 ℃后以90 ℃/min升溫至320 ℃,保持5 min。

TSQ 8000 Evo質(zhì)譜儀配備EI源,采集數(shù)據(jù):離子源及接口溫度分別為250和280 ℃,掃描方式為全掃,質(zhì)量數(shù)范圍為33～600。

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過(guò)與NIST庫(kù),Fiehn的數(shù)據(jù)庫(kù)以及標(biāo)樣驗(yàn)證等方法對(duì)腐乳發(fā)酵GC/MS分析譜中的化合物。通過(guò)TraceFinder軟件提取定性的化合物,采用各自樣品(腐乳干粉)的重量以及內(nèi)標(biāo)(C15∶0 FAME)進(jìn)行歸一化校正。所得數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA P,進(jìn)行多變量統(tǒng)計(jì)分析,尋找腐乳在發(fā)酵過(guò)程中以及在不同的微生物環(huán)境下變化顯著的化合物。

此外,數(shù)據(jù)采用SPSS進(jìn)行t檢驗(yàn),認(rèn)為p<0.05的變量在兩組間有顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 基于GC/MS的代謝組學(xué)分析

本文采用常規(guī)提取極性小分子使用的溶劑80% MeOH[6]來(lái)最大化的獲得樣品中的化合物信息。鑒于在腐乳制備過(guò)程中為了提升其風(fēng)味及營(yíng)養(yǎng)添加了茶油,在進(jìn)行極性化合物提取前,我們使用正己烷溶劑對(duì)腐乳干粉進(jìn)行了脫脂處理。在比較了采用80% MeOH 兩次重復(fù)提取與單次提取的GC/MS分析結(jié)果后,基于二者差異僅限于化合物的濃度,對(duì)所得化合物的種類(lèi)并無(wú)影響的事實(shí),為提高樣品分析的通量,我們選取了單次提取樣品的方法。

表1 腐乳提取物的GC/MS分析結(jié)果所鑒定的化合物列表

本工作采用GC/MS分析了腐乳在常規(guī)發(fā)酵及添加乳酸菌LGG后發(fā)酵過(guò)程中的化合物變化。QC樣品的GC/MS總離子流色譜圖見(jiàn)圖1。圖2顯示的是采用QC樣品來(lái)評(píng)價(jià)方法重復(fù)性的結(jié)果:在所有的特征化合物中,RSD<15%的化合物占總化合物的73.8%,RSD<30%的化合物占總化合物的84.5%。表明了該分析方法重復(fù)性良好,所得數(shù)據(jù)可以用來(lái)反應(yīng)、表征腐乳發(fā)酵過(guò)程中化合物的變化。

圖1 GC/MS分析乳腐的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of GC/MS based metabolic profiling of sufu extracts

圖2 質(zhì)控樣品中不同化合物的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD,%)分布Fig.2 RSD(%)of metabolites in quality control samples注:柱狀圖:目標(biāo)化合物占總化合物的個(gè)數(shù)百分比,折線圖:目標(biāo)化合物占總化合物的累計(jì)個(gè)數(shù)百分比。

使用上述表征的方法采集腐乳在常規(guī)發(fā)酵(Control)和添加乳酸菌LGG輔助發(fā)酵(LGG)0、1、2、3、4、5、6周的數(shù)據(jù)。首先將腐乳的提取物進(jìn)行肟化反應(yīng),降低還原糖的色譜圖的復(fù)雜性[7],同時(shí)亦減小隨后定性工作的難度,隨后進(jìn)行硅烷化衍生,用于GC/MS分析。所得結(jié)果通過(guò)與文獻(xiàn)對(duì)比以及NIST/Fiehn數(shù)據(jù)庫(kù)檢索,鑒定得到85個(gè)化合物,其中33個(gè)化合物的定性結(jié)果得到了標(biāo)樣驗(yàn)證,所得的化合物涉及到20余種氨基酸,10余種有機(jī)酸和多種糖及糖醇、糖酸類(lèi)物質(zhì),鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。

續(xù)表

續(xù)表

注：*定性結(jié)果已經(jīng)標(biāo)樣驗(yàn)證。此前,Ma等[8]采用HPLC-UV方法分析了臭腐乳(grey sufu)在發(fā)酵過(guò)程中的化合物變化,檢測(cè)到15種游離氨基酸和乳酸、丁酸、琥珀酸等揮發(fā)性有機(jī)酸酸。Han[9]等分析了固態(tài)發(fā)酵的腐乳,檢測(cè)到18種游離氨基酸。相對(duì)于文獻(xiàn)報(bào)道,我們當(dāng)前的方法檢測(cè)到了較豐富的化合物種類(lèi),為從腐乳化學(xué)組成的角度表征腐乳發(fā)酵的過(guò)程與特征提供了充分依據(jù)。此外,本實(shí)驗(yàn)中還檢測(cè)到一個(gè)黃酮類(lèi)化合物,經(jīng)與數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)照,為染料木素(Genistein)。

2.2 腐乳發(fā)酵過(guò)程中化學(xué)組分的變化

常規(guī)用于腐乳發(fā)酵的微生物主要為毛霉屬、根霉屬、細(xì)菌中的芽孢桿菌屬和微球菌屬菌株,較少使用其它菌類(lèi)。然而,魯緋等[10]報(bào)道從青方腐乳中分離得到了三株對(duì)腐乳風(fēng)味有促進(jìn)作用的植物乳桿菌。Serrazanetti等[5]比較了兩株乳酸菌Lactobacilluscasei和Lactobacillusacidophilus共同以及單獨(dú)作用于豆腐生產(chǎn)及腐乳發(fā)酵的結(jié)果,發(fā)現(xiàn),乳酸菌的加入可以降低豆腐發(fā)酵過(guò)程中多不飽和脂肪酸的過(guò)氧化和醛類(lèi)化合物的還原。同時(shí)考慮到乳酸菌在食品方面利用的各種優(yōu)勢(shì),在本實(shí)驗(yàn)中我們選擇在常規(guī)腐乳發(fā)酵方法的基礎(chǔ)上添加LGG來(lái)進(jìn)行輔助發(fā)酵,考查添加乳酸菌后腐乳發(fā)酵小分子的變化以及對(duì)發(fā)酵整個(gè)過(guò)程進(jìn)程的影響。

圖3 不同發(fā)酵條件(常規(guī)毛霉菌發(fā)酵(對(duì)照組)和鼠李糖乳桿菌GG株輔助發(fā)酵(LGG組))的腐乳的主成分分析得分圖(A)和PLS-DA得分圖(B)Fig.3 PCA(A)and PLS-DA(B)score plots of sufu fermented by Mucor only(Control) and Mucor-Lactobacillus rhamnosus GG strain(LGG)

首先采用主成分分析(PCA)不同的發(fā)酵過(guò)程中小分子的變化趨勢(shì)。在PCA得分圖(圖3 A)上,可以看到添加乳酸菌LGG后,發(fā)酵過(guò)程中的腐乳的小分子組分發(fā)生了明顯變化:在第一和第二個(gè)主成分對(duì)角線方向上,常規(guī)發(fā)酵(Control)及添加乳酸菌LGG輔助發(fā)酵(LGG)樣品呈現(xiàn)出由于發(fā)酵條件不同而帶來(lái)的差異性,第二個(gè)主成分則更多地反映了發(fā)酵時(shí)間對(duì)腐乳發(fā)酵過(guò)程的影響。

為了進(jìn)一步比較添加LGG進(jìn)行輔助發(fā)酵后對(duì)腐乳發(fā)酵過(guò)程的影響,以前期數(shù)據(jù)分析所得到的87個(gè)化合物為變量,對(duì)常規(guī)發(fā)酵條件下的21個(gè)腐乳樣本與LGG輔助發(fā)酵下的21個(gè)樣本進(jìn)行偏最小二乘判別分析(PLS-DA)分析,以尋找在兩種發(fā)酵條件下變化較大的物質(zhì),進(jìn)一步評(píng)價(jià)乳酸菌LGG輔助發(fā)酵的效果。其得分圖如圖3(B)所示,可以看到在第一個(gè)主成分上,兩類(lèi)樣品按發(fā)酵條件的不同,常規(guī)發(fā)酵的腐乳與乳酸菌LGG輔助發(fā)酵的樣品得到了完全分離。該模型的參數(shù)R2Y=0.90,說(shuō)明了所建模型可以很好地解釋建模數(shù)據(jù),同時(shí)參數(shù)Q2=0.86,則表明該模型具有良好的對(duì)未知數(shù)據(jù)的預(yù)測(cè)能力。鑒于PLS-DA為有師監(jiān)督的模式識(shí)別方法,為了確保所得模型的可靠性,對(duì)該模型進(jìn)行交叉驗(yàn)證,數(shù)據(jù)交互計(jì)算(permutation)999次,其R2和Q2的截距分別為0.347和-0.271,說(shuō)明模型沒(méi)有過(guò)擬合,所得的PLS-DA的分析結(jié)果是可靠的。

表2 腐乳不同發(fā)酵條件下的差異性化合物

選取PLS-DA分析結(jié)果中VIP(variable importance in projection)值大于1的所有變量,發(fā)現(xiàn)在腐乳的發(fā)酵過(guò)程中,變化比較大的化合物主要涉及氨基酸,小分子酸和部分糖類(lèi)(表2)。在LGG組呈上升趨勢(shì)的化合物以氨基酸為主,主要包括丙氨酸(1.40),甘氨酸(2.62),絲氨酸(1.67),蘇氨酸(1.47),高絲氨酸(1.78),天冬氨酸(1.85),鳥(niǎo)氨酸(1.44)和天冬酰胺(2.43)。小分子酸為乳酸(1.31)和甘油酸(1.77)(括號(hào)內(nèi)數(shù)字為L(zhǎng)GG輔助發(fā)酵組樣本相對(duì)對(duì)照組的變化倍數(shù),詳見(jiàn)表2)。乳酸菌用于發(fā)酵腐乳的一個(gè)最大顧慮是其產(chǎn)乳酸的能力較強(qiáng),可能在腐乳成品中引入較重的酸味。然而實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,LGG組與Control組的乳酸含量雖然存在顯著性差異(p<0.01),但其絕對(duì)量的變化相對(duì)較小,而且相對(duì)于氨基酸在乳酸菌發(fā)酵下含量的提高,大部分有機(jī)酸小分子則呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(表2),該結(jié)果可以部分地緩解我們對(duì)在腐乳發(fā)酵過(guò)程中引入乳酸菌后可能帶來(lái)的產(chǎn)品酸度升高的顧慮。油酸(0.75),11-反-十八烯酸(0.81)和單油酸甘油酯(0.63)是在腐乳進(jìn)行脫脂后得到的三個(gè)長(zhǎng)鏈脂肪酸相關(guān)的化合物,其含量在LGG輔助發(fā)酵組呈現(xiàn)下降趨勢(shì),根據(jù)余若黔等[11]在解釋腐乳中游離脂肪酸變化時(shí)將脂肪酸的含量與催化其與乙醇進(jìn)行酯化反應(yīng)的脂肪酶的活性相聯(lián)系,本實(shí)驗(yàn)中可能是由于乳酸菌LGG輔助發(fā)酵與常規(guī)發(fā)酵條件下對(duì)脂肪酶的活性影響不一致,乳酸菌環(huán)境導(dǎo)致了酶活的增強(qiáng)或是隨發(fā)酵的進(jìn)行保持酶活力仍能保持而引起的。

縱觀上述所有化合物的變化,其倍數(shù)主要處在0.5～2.5倍左右,主要為氨基酸且含量升高的氨基酸中大部分是具有增加甜味、鮮味或酸味的功能,這表明加入乳酸菌可以改善腐乳的發(fā)酵過(guò)程。

2.3 發(fā)酵過(guò)程氨基酸的變化

對(duì)于大豆產(chǎn)品來(lái)說(shuō),一旦發(fā)酵過(guò)程開(kāi)始,主要的一個(gè)變化即為蛋白質(zhì)的解離[12]。GC/MS的分析結(jié)果也表明在腐乳發(fā)酵過(guò)程中,添加乳酸菌后變化較大的化合物主要是氨基酸。因此,腐乳在發(fā)酵過(guò)程中的游離氨基酸,可以看作是監(jiān)測(cè)腐乳發(fā)酵工藝、流程的一個(gè)重要指標(biāo)。Dajanta等[12]分析了大豆發(fā)酵前后游離氨基酸的變化,發(fā)現(xiàn)發(fā)酵過(guò)程大大增加了Thua nao中游離氨基酸的含量。本工作中同樣檢測(cè)到大量氨基酸,由表1可知腐乳提取物發(fā)現(xiàn)了除了組氨酸、賴(lài)氨酸和精氨酸之外的其它17種蛋白質(zhì)氨基酸以及多種必需氨基酸,這說(shuō)明,腐乳可以提供相對(duì)豐富的氨基酸種類(lèi),與其它豆制品一樣也是優(yōu)質(zhì)的食物蛋白質(zhì)來(lái)源[9]。同時(shí),部分呈味氨基酸的存在也為腐乳提供了豐富的口感。

圖4 差異性氨基酸(p<0.05)在兩種發(fā)酵過(guò)程中含量的變化Fig.4 Changes of differential amino acids(p<0.05)along the fermentation

此外,在比較LGG輔助發(fā)酵及常規(guī)毛霉菌發(fā)酵條件下的氨基酸變化情況時(shí)亦發(fā)現(xiàn):大多數(shù)的氨基酸在乳酸菌LGG輔助發(fā)酵條件下的含量比單純毛霉菌發(fā)酵條件下的含量高。這說(shuō)明乳酸菌LGG的加入可以顯著促進(jìn)腐乳的發(fā)酵程度。圖4所示為部分在兩組之間存在顯著差異(p<0.05)的氨基酸及其在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中含量的變化情況。這些氨基酸有多種為呈味氨基酸,這是氨基酸在食品中的另一重要作用[8,13]。天然蛋白質(zhì)中的氨基酸都屬于L型,大多具有甜味或是苦味,有少數(shù)具有鮮味或是酸味[8]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)腐乳發(fā)酵過(guò)程中氨基酸化合物的分析結(jié)果表明,添加乳酸菌LGG輔助發(fā)酵的腐乳中丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸等甜味氨基酸和天冬氨酸等鮮、酸味氨基酸的含量顯著高于常規(guī)毛霉菌發(fā)酵的腐乳。這為在實(shí)際的腐乳生產(chǎn)及工藝流程優(yōu)化時(shí)考慮加入乳酸菌來(lái)改善腐乳成品的口味提供了物質(zhì)依據(jù)。

然而另一方面,由圖4我們可以發(fā)現(xiàn)雖然隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),腐乳中的氨基酸含量呈上升趨勢(shì),但對(duì)比各氨基酸在發(fā)酵過(guò)程中含量的變化情況,則發(fā)現(xiàn)兩種不同發(fā)酵條件下腐乳中氨基酸含量達(dá)到最高值的時(shí)間點(diǎn)基本是一致的。若以腐乳中大部分氨基酸的含量達(dá)最高值為后發(fā)酵階段基本完成的標(biāo)志[4],本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明乳酸菌LGG的加入對(duì)促進(jìn)腐乳后發(fā)酵過(guò)程的速度并無(wú)明顯優(yōu)勢(shì)。

3 結(jié)論

基于GC/MS技術(shù)采集了不同發(fā)酵條件下腐乳在發(fā)酵過(guò)程中的化合物信息,利用代謝組學(xué)的思路考察了發(fā)酵過(guò)程中化合物的變化并在此基礎(chǔ)上評(píng)估了乳酸菌輔助發(fā)酵對(duì)腐乳發(fā)酵的影響。添加乳酸菌后,雖然其乳酸的含量相對(duì)常規(guī)發(fā)酵過(guò)程會(huì)升高,但就其物質(zhì)的絕對(duì)量來(lái)看,乳酸菌的添加不會(huì)導(dǎo)致腐乳最終口味的酸化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,乳酸菌輔助發(fā)酵條件下,一些具有甜味的氨基酸如丙氨酸、甘氨酸等以及呈現(xiàn)鮮味的天冬氨酸等含量升高,此類(lèi)化合物作為形成食物風(fēng)味的物質(zhì)基礎(chǔ),也說(shuō)明鼠李糖乳桿菌GG株的添加能夠提升腐乳的口味。

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A gas chromatography/mass spectrometry based metabolomics study of the fermentation of sufu

YANG Qin1,CHEN Xiao-hua1,2,*,ZHANG Hao1,CHEN Wei1,CHEN Yong-quan1

(1.School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China; 2.College of Life Science and Environment,Hengyang Normal University,Hengyang 421008,China)

Metabolonic study of sufu fermented byMucorand Mucor-LactobacillusrhamnosusGG strain(LGG)was conducted,using gas chromatography/mass spectrometry(GC/MS)to acquire the changes of the chemical components of sufu during the fermentation. 85 compounds including amino acids,organic acids and sugars were identified and 33 of them were validated by authentic standards. The analysis revealed that sufu fermented with the assistance of LGG could produce higher content of amino acids such as alanine,glycine,serine,threonine and aspartate,thus enhance its taste of sweetness or palatable. Though profiles of compounds at different time under different fermentation indicated that the addition of lactobacillus could not accelerate fermentation of sufu,this work indicated that lactobacillus could be use to improve and optimize the fermentation of sufu. Besides,the study has demonstrated that metabolomic strategies could apply to optimize the fermentation process of sufu,as well as other traditional fermented foods.

gas chromatography/mass spectrometry; lactic acid bacteria; fermentation of sufu; metabolomics; amino acid

2016-06-17

楊芹(1981- )，女，博士，講師，研究方向：食品分析,E-mail:qyang@jiangnan.edu.cn。

*通訊作者:陳曉華(1981-)，女，講師，主要從事食品微生物和功能食品開(kāi)發(fā)方面的研究，E-mail:chxh0217@163.com。

湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2015JJ6012)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)22-0178-08

10.13386/j.issn1002-0306.2016.22.027