張新欣，敖天杰,張成程，江 念，鄭小江,*

(1.湖北民族學(xué)院 林學(xué)園藝學(xué)院，湖北 恩施 445000；2.湖北民族學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000)

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一種血紅密孔菌色素提取工藝優(yōu)化及穩(wěn)定性研究

張新欣1，敖天杰2,張成程2，江 念2，鄭小江1,2*

(1.湖北民族學(xué)院 林學(xué)園藝學(xué)院，湖北 恩施 445000；2.湖北民族學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000)

以一株含有大量紅色色素的野生血紅密孔菌子實(shí)體為試驗(yàn)材料，以提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間3個(gè)因素為指標(biāo)對(duì)其進(jìn)行了色素提取工藝優(yōu)化，并對(duì)該子實(shí)體色素的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究.其結(jié)果表明：血紅密孔菌子實(shí)體色素的最佳提取工藝條件為：提取溫度為85℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，提取時(shí)間為80 min，色素含量3.84 mg/g.色素穩(wěn)定性研究表明，該色素對(duì)溫度、氧化劑、還原劑、金屬離子等的穩(wěn)定性較好，在食品、工業(yè)中具有較大的開發(fā)利用價(jià)值，值得更加深入的研究.

血紅密孔菌;色素;提取工藝;穩(wěn)定性;抗氧化

目前，天然色素的開發(fā)與利用已受到廣泛的關(guān)注和重視.近年來(lái)很多學(xué)者對(duì)天然色素進(jìn)行研究得到了豐富的成果.絕大部分的天然色素都是從植物中提取得到的，還不能滿足現(xiàn)實(shí)的需求，開發(fā)新型色素資源可為解決這一問(wèn)題提供一個(gè)途徑.我國(guó)大型真菌資源豐富，如果從中篩選出一些色素含量高，又具有一定的食用及保健價(jià)值的色素種類，則非常具有開發(fā)利用潛力[1-4].多孔菌是人類開發(fā)利用比較多的一類大型真菌，具有許多重要的用途和價(jià)值.多孔菌中的牛肝菌、地花菌、硫磺菌、灰樹花等味道鮮美可以食用，茯苓、雷丸、豬苓、云芝等是名貴和常見的中藥材，并且多孔菌科中尚未發(fā)現(xiàn)有毒的種類[5]；多孔菌產(chǎn)生的木質(zhì)素分解酶可應(yīng)用在染料降解、紙漿漂白、動(dòng)物飼料生產(chǎn)等許多方面[6].

于萍[7]從鳳眼蓮中提取的色素主要成分為脫鎂葉綠素a、β-類胡蘿卜素和葉綠素衍生物，可上染錦綸織物和羊毛織物.張梁等[8]從土壤中分離到一株產(chǎn)紅色素細(xì)菌，對(duì)其色素結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果為靈菌紅素.印度科研人員Bhuyan等[9]從巴戟、柚木、茜草等五種印度本地植物中提取色素.肖浩等[10]從千里光花中提取到一種脂溶性黃色色素并對(duì)其提取方法進(jìn)行優(yōu)化，得出運(yùn)用水提法為較為經(jīng)濟(jì)的提取方式.趙珍珍[11]研究了紅肉火龍果果皮、果肉紅色素的提取工藝及穩(wěn)定性，得出溫度、氧化劑、還原劑、金屬離子為影響色素穩(wěn)定性的主要因素.目前，對(duì)于色素的提取研究主要集中在植物中，以為微生物為材料提取色素的研究較少.但微生物的繁殖以及培養(yǎng)更為簡(jiǎn)易，大力發(fā)展微生物色素在食品和工業(yè)中的潛力巨大.

本試驗(yàn)以血紅密孔菌實(shí)體為試驗(yàn)材料研究其色素的提取工藝及穩(wěn)定性，旨在為篩選具有開發(fā)潛力的天然色素提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試材料

2014年初冬，從武漢東湖附近的一棵刺槐樹上采集的橙紅色野生菌子實(shí)體.分子生物學(xué)鑒定采用ITS序列分析方法，通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)該野生菌與菌株P(guān)ycnoporussanguineus聚在同一分支上，它們的相似度為99%.最終鑒定該野生菌為擔(dān)子菌綱、多孔菌科、密孔菌屬、血紅密孔菌，命名為PycnoporussanguineusZXJ.ZCC(該命名過(guò)程另撰文發(fā)表).

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

FA1204N電子天平(上海丙林電子科技有限公司)；TissueLyserⅡ高通量組織研磨儀(上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)發(fā)展有限公司)；TDL-40BD離心機(jī)(上海安亭有限公司)；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；HWS24電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限責(zé)任公司)；PHS-3C pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司).

表1 因素水平表Tab.1 Factors level table

1.3 藥品和試劑

石油醚、乙酸乙酯、氯仿、甲醇、乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、雙氧水、硫酸氫鈉、維生素C、氯化鈣、硫酸鋅、硫酸銅、硫酸鎂、氯化鋁、硫酸鐵、硫酸亞鐵、β-胡蘿卜素.

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 色素提取工藝流程 提取路線：烘干→粉碎→過(guò)篩(80目)→加入提取溶劑→水浴→離心→過(guò)濾→色素提取液.

1.4.2 色素含量測(cè)定方法 取0.2 g血紅密孔菌粉末，加入20 mL 70%乙醇，75℃水浴40 min，水浴期間要不時(shí)震蕩，在4 000 r/min條件下離心10 min，用一次性過(guò)濾針頭過(guò)濾，并定容至25 mL，在190～1 100 nm范圍內(nèi)進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，確定最大特征吸收波長(zhǎng)為445.5 nm.

1.4.3 提取溶劑選擇 分別用蒸餾水、甲醇、乙醇、石油醚、乙酸乙酯、氯仿提取色素，在445.5 nm處測(cè)定色素提取液的吸光度，確定最適提取溶劑.

1.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制 以β-胡蘿卜素作為標(biāo)準(zhǔn)品，溶解于70%乙醇中，配制濃度分別為0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、 3.50、4.00、5.00 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，在445.5 nm處測(cè)定各標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度.以標(biāo)準(zhǔn)液的濃度為橫坐標(biāo)，以不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液對(duì)應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在所取的濃度范圍內(nèi)，其濃度和吸光度呈現(xiàn)出良好線性關(guān)系，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為:Y=0.157 32X+0.002 06，R2=0.999 85.

1.4.5 單因素試驗(yàn)

1.4.5.1 提取溫度選擇 取0.2 g血紅密孔菌粉末，加入20 mL 70%乙醇，于25、35、45、55、65、75、85、95℃中水浴40 min，離心，過(guò)濾，并定容至25 mL，在445.5 nm處測(cè)定色素提取液的吸光度，確定最適提取溫度.

1.4.5.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)選擇 取0.2 g血紅密孔菌粉末，加入20 mL濃度依次為0%(即蒸餾水)、20%、30%、50%、70%、90%、100%的乙醇，75℃水浴40 min，離心，過(guò)濾，并定容至25 mL，在445.5 nm處測(cè)定色素提取液的吸光度，確定最適提取劑濃度.

1.4.5.3 提取時(shí)間選擇 取0.2 g血紅密孔菌粉末，加入20 mL 70%乙醇，于75℃中水浴20、40、60、80、100、120 min，離心，過(guò)濾，并定容至25 mL，在445.5 nm處測(cè)定色素提取液的吸光度，確定最適提取時(shí)間.

1.4.6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)L9(33)正交試驗(yàn)，進(jìn)行PycnoporussanguineusZXJ.ZCC子實(shí)體色素提取最佳工藝的優(yōu)化.如表1所示.

1.4.7 色素穩(wěn)定性試驗(yàn)

1.4.7.1 pH穩(wěn)定性試驗(yàn) 取5 mL色素提取液，用1 mol/L的HCl或NaOH調(diào)節(jié)其pH值分別為1、3、5、7、9、11、13，室溫放置30 min后測(cè)定445.5 nm處吸光度，同時(shí)做空白對(duì)照.

1.4.7.2 氧化劑與還原劑穩(wěn)定性試驗(yàn) 取濃度梯度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L的雙氧水溶液、維生素C溶液、硫酸氫鈉溶液各1 mL加入到5 mL色素提取液中，室溫放置30 min后測(cè)定445.5 nm處吸光度，同時(shí)做空白對(duì)照.

1.4.7.3 金屬離子穩(wěn)定性試驗(yàn) 取5 mL色素提取液，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的氯化鈣溶液、硫酸鋅溶液、硫酸銅溶液、硫酸鎂溶液、氯化鋁溶液、硫酸鐵溶液、硫酸亞鐵溶液各1 mL，室溫條件下靜置30 min后，測(cè)定445.5 nm處吸光度，同時(shí)做空白對(duì)照.

1.4.8 數(shù)據(jù)處理 用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算與整理，用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析.

注：相同字母之間表示無(wú)顯著差異，不同大寫字母之間表示存在顯著差異(P<0.05，下同).圖1 最佳溶劑的選擇Fig.1 The choice of the best solvent

圖2 提取溫度對(duì)色素提取效果的影響Fig.2 Extraction temperature on the influence of pigment extraction

圖3 乙醇濃度對(duì)色素提取效果的影響Fig.3 The influence of ethanol concentration of pigment extraction effect

2 結(jié)果與分析

2.1 溶劑選擇

在相同條件下對(duì)溶劑蒸餾水、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、氯仿和石油醚進(jìn)行考察，結(jié)果如圖1所示.

由圖1可得，色素得率從大到小依次為甲醇、乙酸乙酯、乙醇、氯仿、蒸餾水、石油醚(幾乎無(wú)吸收)，甲醇、乙酸乙酯、乙醇色素得率沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)，考慮到用乙醇做為提取溶劑更安全和經(jīng)濟(jì)，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇乙醇作為提取溶劑.

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 提取溫度對(duì)色素提取效果的影響

在提取時(shí)間、乙醇濃度相同的條件下，考察不同溫度對(duì)色素得率的影響，結(jié)果如圖2所示.

由圖2可知，色素得率著提取溫度的升高而變大，則色素含量也隨著提取溫度的升高而越來(lái)越高，當(dāng)溫度為85℃時(shí)，其對(duì)應(yīng)的色素得率最高.由顯著性分析得知，當(dāng)溫度為85℃時(shí)，其對(duì)應(yīng)的吸光度與95℃相比無(wú)顯著差異(P>0.05)，但與其他溫度相比均有顯著差異(P<0.05)，說(shuō)明當(dāng)溫度升到85℃后，繼續(xù)升溫對(duì)色素提取率的增加無(wú)顯著影響，所以PycnoporussanguineusZXJ.ZCC子實(shí)體色素提取溫度宜選擇85℃.

2.2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)色素提取效果的影響 在提取時(shí)間、提取溫度相同的條件下，考察不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)色素得率的影響，結(jié)果如圖3所示.

由圖3可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，色素得率最大.當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在0%～70%之間時(shí)，色素得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高而變大；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在70%～100%之間時(shí)，色素得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高而變小.由于乙醇體積分?jǐn)?shù)越大，極性越弱；體積分?jǐn)?shù)越小，極性越強(qiáng).說(shuō)明PycnoporussanguineusZXJ.ZCC子實(shí)體色素具有一定水溶性.

由顯著性分析得知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，其對(duì)應(yīng)的吸光度與其他體積分?jǐn)?shù)相比均有顯著差異(P<0.05)，即對(duì)于PycnoporussanguineusZXJ.ZCC子實(shí)體色素提取效果最好的乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%.

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)色素提取效果的影響 在乙醇、提取溫度相同的條件下，考察不同提取時(shí)間對(duì)色素得率的影響，結(jié)果如圖4所示.

圖4 提取時(shí)間對(duì)色素提取效果的影響Fig.4 Extraction time on the influence of pigment extraction

注：※代表和對(duì)照有顯著性差異，P<0.05.圖5 pH對(duì)色素穩(wěn)定性的影響Fig.5 The pH effect on the stability of the pigment

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of orthogonal test

表3 正交試驗(yàn)方差分析Tab.3 Variance analysis of orthogonal test

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 The table of verifying test

由圖4可知，當(dāng)提取時(shí)間為60、80、100和120 min時(shí)，其對(duì)應(yīng)的色素得率之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)，但四者與20 min和40 min之間存在顯著差異(P<0.05).從高效節(jié)能方面考慮，PycnoporussanguineusZXJ.ZCC子實(shí)體色素提取時(shí)間取60 min較為合適.

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，PycnoporussanguineusZXJ.ZCC子實(shí)體色素提取最終的因素水平選擇見表1，用SPSS19.0軟件對(duì)正交數(shù)據(jù)進(jìn)行分析得表2、表3.由表2和表3可知，3個(gè)單因素對(duì)PycnoporussanguineusZXJ.ZCC色素含量的提取結(jié)果都有一定的影響，在9組正交試驗(yàn)中，所得色素含量大小有很大的差別.提取溫度對(duì)色素提取率有極顯著影響(P<0.01)，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)色素提取率有顯著影響(P<0.05)，提取時(shí)間對(duì)色素提取率影響不顯著(P>0.05)，3個(gè)單因素對(duì)色素提取效果的影響程度順序?yàn)椋篈>B>C，即提取溫度>乙醇體積分?jǐn)?shù)>提取時(shí)間.結(jié)合表4可得，色素提取的最佳因子配比為A2B2C3，即提取溫度為85℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，提取時(shí)間為80 min，此條件下測(cè)得的色素含量最高，為3.84 mg/g.

取0.2 g子實(shí)體粉末，按照提取溫度為85℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，提取時(shí)間為80 min進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果如表5.結(jié)果表明，所得提取工藝穩(wěn)定可行.

表4 Duncan多重比較結(jié)果

Tab.4 Duncan multiple comparison results

因素N同類子集1237531.5867A提取溫度/℃8533.40329533.16335032.1100 B乙醇濃度/%7033.14679032.89674032.3667 C提取時(shí)間/min6032.85678032.9300

2.4 色素穩(wěn)定性研究

2.4.1 pH對(duì)色素穩(wěn)定性的影響 5 mL色素提取液，在不同pH條件下放置30 min，在波長(zhǎng)445.5 nm條件下檢測(cè)其吸光度，結(jié)果如圖5所示.

圖5為PycnoporussanguineusZXJ.ZCC子實(shí)體色素在不同pH值下的吸光度.由顯著性分析可知，當(dāng)pH為5、7、9和11時(shí)，其對(duì)應(yīng)的吸光度與對(duì)照相比差異不顯著(P>0.05)；當(dāng)pH為1、3和13時(shí)，其對(duì)應(yīng)的吸光度與對(duì)照之間差異顯著(P<0.05).表明該色素在pH5～11時(shí)較為穩(wěn)定，但在強(qiáng)酸(pH<3)和強(qiáng)堿(pH>13)條件下，吸光度會(huì)顯著降低，特別是在強(qiáng)堿條件下更為明顯.

圖6 氧化劑與還原劑對(duì)色素穩(wěn)定性的影響Fig.6 Antioxidant and reducing agent effect on the stability of the pigment

圖7 金屬離子對(duì)色素穩(wěn)定性的影響Fig.7 Metal ions effect on the stability of the pigment

2.4.2 氧化劑與還原劑對(duì)色素穩(wěn)定性的影響 5 mL色素提取液，在三種溶劑不同摩爾體積分?jǐn)?shù)條件下放置30 min，在波長(zhǎng)445.5 nm條件下檢測(cè)其吸光度，結(jié)果如圖6所示.

加入不同摩爾體積分?jǐn)?shù)的雙氧水、維生素C、硫酸氫鈉后，色素提取液的吸光度變化如圖6所示.由顯著性分析可知，在雙氧水環(huán)境下，除當(dāng)雙氧水摩爾體積分?jǐn)?shù)為0.4 mol/L時(shí)產(chǎn)生了顯著差異外(P<0.05)，其他摩爾體積分?jǐn)?shù)下均無(wú)顯著差異；在維生素C環(huán)境下，當(dāng)摩爾體積分?jǐn)?shù)為0.4、0.6、0.8和1.0 mol/L時(shí)，與對(duì)照相比出現(xiàn)了顯著差異(P<0.05)；在硫酸氫鈉環(huán)境下，當(dāng)摩爾體積分?jǐn)?shù)為0.6、0.8和1.0 mol/L時(shí)，產(chǎn)生了顯著差異(P<0.05).可知，該色素在氧化劑雙氧水中要比在還原劑維生素C和硫酸氫鈉中穩(wěn)定.

2.4.3 金屬離子對(duì)色素穩(wěn)定性的影響 在色素提取液，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的氯化鈣溶液、硫酸鋅溶液、硫酸銅溶液、硫酸鎂溶液、氯化鋁溶液、硫酸鐵溶液、硫酸亞鐵溶液，室溫條件下靜置30 min后，測(cè)定445.5 nm處吸光度如圖7所示.

圖7的試驗(yàn)結(jié)果表明，除了Gu2+會(huì)引起PycnoporussanguineusZXJ.ZCC子實(shí)體色素吸光度顯著(P<0.05)降低外，Al3+、Fe2+、Fe3+、Zn2+和Mg2+均會(huì)在一定程度上引起PycnoporussanguineusZXJ.ZCC子實(shí)體色素吸光度顯著(P<0.05)升高，其中升高的最多的是Fe3+，其次是Fe2+，而Ca2+則對(duì)PycnoporussanguineusZXJ.ZCC子實(shí)體色素?zé)o顯著影響.

3 結(jié)論與討論

溫度對(duì)提取PycnoporussanguineusZXJ.ZCC子實(shí)體色素有顯著的影響.溫度越高，色素得率越大，說(shuō)明血紅密孔菌色素耐高溫，熱穩(wěn)定性好.不同濃度的乙醇也對(duì)PycnoporussanguineusZXJ.ZCC子實(shí)體色素得率產(chǎn)生一定的影響，試驗(yàn)結(jié)果顯示，采用濃度為70%的乙醇作為提取劑，色素得率最高.采用乙醇作為提取劑，成本低，還可以實(shí)現(xiàn)回收再利用，降低生產(chǎn)成本.通過(guò)PycnoporussanguineusZXJ.ZCC子實(shí)體色素多因素正交試驗(yàn)，最佳提取工藝為提取溫度為85℃，乙醇濃度為70%，提取時(shí)間為80min.3個(gè)因素對(duì)色素提取效果的影響程度不同，提取溫度>乙醇濃度>提取時(shí)間，其中，提取溫度是提取血紅密孔菌色素的關(guān)鍵因素.

色素穩(wěn)定性對(duì)色素的開發(fā)應(yīng)用極為重要，它直接影響并決定了色素的利用價(jià)值.因此本文對(duì)所得色素的穩(wěn)定性進(jìn)行了初步研究，以期為該色素的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供一定依據(jù).PycnoporussanguineusZXJ.ZCC子實(shí)體色素的穩(wěn)定性研究表明，血紅密孔菌色素的熱穩(wěn)定性相當(dāng)好，即使在85℃的高溫下依然穩(wěn)定；除強(qiáng)酸強(qiáng)堿外，血紅密孔菌色素在一般酸堿條件下穩(wěn)定性也很好；血紅密孔菌色素對(duì)氧化劑雙氧水具有較好的穩(wěn)定性，對(duì)低濃度的還原劑硫酸氫鈉和維生素C穩(wěn)定性較好，當(dāng)濃度變高時(shí)穩(wěn)定性變差；在金屬離子環(huán)境中，Al3+、Fe2+、Fe3+、Zn2+和Mg2+均會(huì)在一定程度上引起血紅密孔菌色素吸光度的升高，而Gu2+會(huì)引起血紅密孔菌色素吸光度降低，Ca2+則對(duì)血紅密孔菌色素?zé)o顯著影響.

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責(zé)任編輯：高 山

Study on Process Optimization and Stability of Pigment Extraction ofPycnoporussanguineus

ZHANG Xinxin1，AO Tianjie2，ZHANG Chengcheng2，JIANG Nian2，ZHENG Xiaojiang1，2*

(1.School of Forestry and Horticulture，Hubei University for Nationalities，Enshi 445000，China；2.School of Biological Science and Technology，Hubei University for Nationalities，Enshi 445000，China)

In this study,a strain containing a large amount of red pigment in wildPycnoporusfruitbodyis taken as test material,and 3 factors,namely,extraction temperature,ethanol concentration and extraction time are used for the extraction process of optimization,and the stability of the fruiting body of pigment is studied.The results show that:optimum extraction conditions of blood red hole fruiting body pigment,70% ethanol,extraction temperature of 85℃, extraction time 80 min,pigment content 3.84 mg/g.The research results of pigment stability shows that the pigment has good stability,such as temperature,oxidizing agent,reducing agent,metal ion and so on. It has great development and utilization value in food and industry,and it is worth further research.

Pycnoporussanguineus;pigment;extraction process;stability;antioxidation

2016-11-24.

湖北省自然科學(xué)基金創(chuàng)新群體項(xiàng)目(2009CDA115)；生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目(PKLHB1525、1526); 恩施州技術(shù)研發(fā)項(xiàng)目(2013、2014).

張新欣(1991- )，女，碩士生，主要從事野生植物資源保護(hù)與利用的研究;*

鄭小江(1958- )，男，教授，主要從事野生植物資源保護(hù)與利用的研究.

1008-8423(2016)04-0455-05

10.13501/j.cnki.42-1569/n.2016.12.021

TS202.3

A