河南省種子管理站 滕開(kāi)瓊 司冰 賈文華

PEG 脅迫條件下水、旱稻種子萌發(fā)的生理效應(yīng)及脂質(zhì)過(guò)氧化作用的影響

河南省種子管理站 滕開(kāi)瓊 司冰 賈文華

水稻和旱稻是在人工選擇和自然選擇的過(guò)程中，根據(jù)水分供應(yīng)狀況分化出來(lái)的兩大類(lèi)型。兩種類(lèi)型的關(guān)鍵差別在于抗旱性方面，旱稻是天然“抗旱類(lèi)型”，在生長(zhǎng)的全生育期可不灌水或者只在嚴(yán)重干旱的情況下輔以適量灌溉；水稻是天然“敏旱類(lèi)型”，水稻整個(gè)生育期大部分時(shí)間需要在有水的條件下生長(zhǎng)。種子萌發(fā)是一個(gè)復(fù)雜的生理過(guò)程，涉及到超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)的活性變化，種子萌發(fā)也受到植物體內(nèi)丙二醛（MDA）含量的影響，這些因素共同決定著種子的萌發(fā)。在干旱脅迫環(huán)境條件下，水稻種子的萌發(fā)過(guò)程吸水會(huì)受到抑制，這樣會(huì)導(dǎo)致種子中與碳氮代謝相關(guān)酶的活性及其代謝產(chǎn)物受到影響，種子的萌發(fā)受到抑制。旱稻需水少，抗旱性強(qiáng)，干旱條件下旱稻種子萌發(fā)是否優(yōu)于水稻，干旱條件下水、旱稻種子萌發(fā)的生理基礎(chǔ)是什么？本研究以水稻越富和旱稻IRAT109為材料，通過(guò)15% PEG模擬干旱脅迫，研究水、旱稻在干旱脅迫條件下種子萌發(fā)的生理效應(yīng)及脂質(zhì)過(guò)氧化作用，探討干旱脅迫條件下旱稻種子強(qiáng)萌發(fā)能力的內(nèi)在生理基礎(chǔ)，以期為闡明栽培稻種子抗旱萌發(fā)出苗提供理論基礎(chǔ)，為旱直播稻的推廣與應(yīng)用提供實(shí)踐依據(jù)。

一、材料與方法

（一）試驗(yàn)材料

以水稻品種越富為背景親本，以旱稻IRAT109為供體親本而得到的BC5F5導(dǎo)入系材料。

（二）試驗(yàn)方法

種子用10%的H2O2消毒10 min，然后用滅菌蒸餾水將種子沖洗干凈；28 ℃蒸餾水浸種1 d；采用培養(yǎng)皿進(jìn)行種子萌發(fā)試驗(yàn)，每培養(yǎng)皿放置3張已滅菌濾紙，加入20 mL的15%PEG6000進(jìn)行干旱模擬處理，蒸餾水為對(duì)照（均已滅菌）。均勻點(diǎn)入50粒種子，3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)30個(gè)培養(yǎng)皿。處理5 d。在光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行，光照強(qiáng)度為200 la，mol/(m·s)，光照/黑暗時(shí)間為12 h/ 12 h，光照溫度為28 ℃，黑暗時(shí)溫度為25 ℃。分別進(jìn)行以下項(xiàng)目的測(cè)定。

稱(chēng)取萌發(fā)種子（去殼，種子和萌發(fā)的根系、芽混合）約0．5 g，于研缽中加入5 mL提取液（50 mmol/L，pH值為7．8磷酸緩沖液，含1% PVP），在冰上研磨至勻漿后，于4 ℃以12 000 rpm離心20 min，上清液用于抗氧化酶SOD和POD活性的測(cè)定。

1．SOD活性測(cè)定。按下表依次向玻璃試管中加試劑，黑暗及光照下設(shè)置的對(duì)照均以pH值為7．8磷酸緩沖液代替酶提取液，混勻后將黑暗對(duì)照試管放于暗處，其余放置于4 000 LX光下30 min。反應(yīng)結(jié)束后，以黑暗對(duì)照為空白，分別測(cè)定560 nm處OD值。

SOD總活性=（Ack - Ae）× V/Ack×0．5×W×Vt；

Ack為照光對(duì)照管的吸收值；Ae為樣品管吸的收值；V為樣品總體積（mL）；Vt為測(cè)定時(shí)樣品用量（mL）；W為樣品鮮質(zhì)量（g）。

2．POD活性的測(cè)定。向比色皿中加入POD反應(yīng)混合液3 mL，然后加入酶提取液1 mL（以磷酸緩沖液作為校零對(duì)照），立即于分光光度計(jì)470 nm下測(cè)定OD值，每30 s計(jì)數(shù)1次，測(cè)定10次。

POD酶活性=[Δ470×V/（W× Vt）] / 0．01；

Δ470為每分鐘底物溶液吸光值的變化；V為樣品總體積(mL)；Vt為測(cè)定時(shí)樣品用量（mL）；W為樣品鮮質(zhì)量（g）；以每分鐘內(nèi)酶活性變化0．01為一個(gè)酶活性單位。

3．MDA含量的測(cè)定。于15% PEG處理的0 d、1 d、2 d、3 d和5 d，處理與對(duì)照每次重復(fù)各取15粒種子，于-40 ℃放置以備MDA含量測(cè)定。

4．采用硫代巴比妥酸法進(jìn)行測(cè)定。稱(chēng)取萌發(fā)種子（去殼）約0．5 g（當(dāng)根、芽長(zhǎng)達(dá)1 cm時(shí)去掉根、芽），于研缽中加5 mL 5% TCA冰浴研磨至勻漿，轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，4 000 rpm離心10 min；取上清液1．5 mL加2．5 mL 5% TBA沸水浴30 min，冰浴冷卻，4 000 rpm離心10 min；上清液于532 nm、600 nm和450 nm下測(cè)定OD值。

MDA含量（nmol/g）=[6．452×（OD532- OD600）- 0．559×OD450× V]/(Vt×W)

V為提取液總體積（mL）；Vt為測(cè)定時(shí)取用的提取液體積（mL）；W為鮮質(zhì)量（g）。

二、結(jié)果與分析

（一）PEG處理對(duì)種子萌發(fā)過(guò)程中SOD和POD活性的影響

植物體在受到不良的外界環(huán)境脅迫時(shí)會(huì)啟動(dòng)自身的抗氧化還原系統(tǒng)，其中POD和SOD是抗氧化系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶。POD的作用是負(fù)責(zé)清除H2O2，從而防止氧化傷害或毒性更強(qiáng)的自由基·OH的形成，而種子中一定含量的H2O2則有利于種子的萌發(fā)；SOD的作用是催化過(guò)氧陰離子（O2-·）發(fā)生歧化反應(yīng)生成H2O2，清除自由基。正常萌發(fā)情況下，水稻越富及導(dǎo)入系IL392種子內(nèi)的SOD活性變化趨勢(shì)基本一致，萌發(fā)前期的SOD活性較高，在萌發(fā)1～2 d達(dá)到最高，分別為133．46U·g-1FW和121．61 U·g-1FW，在第3天開(kāi)始顯著降低。而IRAT109在浸種1天后萌發(fā)0d的SOD活性最高，然后一直呈下降趨勢(shì)，第3天也出現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)。PEG處理后，SOD活性變化在品種間沒(méi)有明顯差異，IRAT109和IL392更早地出現(xiàn)了上升趨勢(shì)，在脅迫處理后5 d，SOD活性都基本達(dá)到了初始的酶活水平，其中IRAT109最高，達(dá)到了131．51 U·g-1FW。由圖1、圖2可知，POD活性變化與SOD趨勢(shì)相反，前期處于較低水平，隨著種子萌發(fā)進(jìn)程其活性不斷升高，在正常水分萌發(fā)情況下，POD活性一直處于上升狀態(tài)，IRAT109和IL392在第3天、第5天顯著高于越富。而PEG脅迫后3個(gè)材料的POD活性都在第2天達(dá)到最高，之后開(kāi)始平緩下降，且IRAT109的POD活性高于同時(shí)期越富及IL392。這可能是由于前期的SOD產(chǎn)生的H2O2有利于種子的萌發(fā)，后期過(guò)高的H2O2會(huì)產(chǎn)生毒害作用。逐漸升高的POD活性會(huì)清除H2O2，以減少對(duì)萌發(fā)種子的毒害作用 。

圖1 PEG脅迫處理后萌發(fā)種子中SOD的活性變化

圖2 PEG脅迫處理后萌發(fā)種子中POD的活性變化

圖3 PEG脅迫處理后萌發(fā)種子中MDA的含量變化

（二）PEG處理對(duì)種子萌發(fā)過(guò)程中MDA含量的影響

在正常水分萌發(fā)情況下，MDA含量總體處于上升趨勢(shì)，由于后期SOD活性顯著下降，萌發(fā)2天后的種子中MDA含量開(kāi)始顯著上升（圖3）。PEG脅迫后MDA含量都在第1天最低，之后開(kāi)始上升。由于受到PEG脅迫，在種子萌發(fā)的過(guò)程中SOD、POD并不能完全保持細(xì)胞內(nèi)自由基平衡，而且隨著種子的萌發(fā)，種子本身就處于消耗降解的過(guò)程，所以在SOD和POD活性較高的情況下MDA含量仍較高，這可能是由于測(cè)定時(shí)去掉了大于1cm的根和芽，萌發(fā)過(guò)程中的種子處于一種衰老過(guò)程，后期SOD活性顯著下降，而POD活性的升高并未降低MDA的含量。

三、結(jié)果與討論

種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)狀況是由其內(nèi)在遺傳因素和外界環(huán)境條件共同決定的。水分是各種環(huán)境條件中的主要限制因素。水稻和旱稻是研究干旱脅迫種子萌發(fā)分子機(jī)制很好的材料。水分是植物種子萌發(fā)的首要條件。種子吸水后，細(xì)胞才會(huì)從靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)向活躍狀態(tài)，然后才能萌發(fā)。種子萌發(fā)是指種子從吸脹作用開(kāi)始的一系列有序的生理過(guò)程和形態(tài)發(fā)生過(guò)程，在這一期間的各種逆境都會(huì)引起種子的生理反應(yīng)，如膜脂過(guò)氧化反應(yīng)、抗氧化防御反應(yīng)及各種激素的條件作用。PEG模擬干旱脅迫3個(gè)材料的MDA含量總體都明顯上升，顯示遭受水分脅迫。但是旱稻IRAT109比水稻有較高的POD活性，清除MDA和H2O2等危害，以減少對(duì)萌發(fā)種子的毒害作用。目前，栽培稻旱直播已經(jīng)成為一種趨勢(shì)，為了保證旱直播足夠的成苗率及秧苗生長(zhǎng)均勻度，研究水、旱稻在干旱脅迫下種子萌發(fā)的生理效應(yīng)及脂質(zhì)過(guò)氧化反映，以及進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)旱脅迫下控制種子萌發(fā)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，有助于我們從生理和基因水平調(diào)控種子的萌發(fā)，這對(duì)于保障我國(guó)稻米糧食安全具有重要的意義。