王艷麗， 孔慶霞, 鄭 戈

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螯合Cy5-AMT-SPIONs雙模探針在急性顳葉癲癇模型中的靶向定位

王艷麗1， 孔慶霞2, 鄭 戈3

目的 探討螯合Cy5-AMT-SPIONs雙模探針在氯化鋰-皮羅卡品誘導(dǎo)急性顳葉癲癇模型病灶中的靶向定位作用。方法 將30只急性顳葉癲癇大鼠隨機(jī)平均分為超順氧化鐵磁性納米粒子組(SPIONs組)、Cy5標(biāo)記的超順氧化鐵磁性納米粒子組(Cy5-SPIONs組)、Cy5標(biāo)記的α-甲基色氨酸的超順氧化鐵磁性納米粒子組(Cy5-AMT-SPIONs組)。各組分別于注射藥物前、注射后4 h行同參數(shù)MR T2序列和T2map序列并使用T2mapping軟件測(cè)量T2值。行普魯士藍(lán)染色觀察鐵粒子在海馬區(qū)的分布，在激光共聚焦顯微鏡下觀察Cy5在大腦中的分布，行免疫熒光染色觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞增生情況，行尼氏染色觀察神經(jīng)元缺失情況。結(jié)果 SPIONs組T2信號(hào)稍下降，Cy5-SPIONs組T2信號(hào)稍下降，Cy5-AMT-SPIONs組T2信號(hào)明顯下降。普魯士藍(lán)染色觀察鐵離子在海馬區(qū)的分布，可見藍(lán)棕色顆粒分布，主要分布在細(xì)胞漿內(nèi)，Cy5-AMT-SPIONs組相對(duì)其他兩組有明顯差異。激光共聚焦顯微鏡下觀察Cy5熒光分布各組間有明顯差異。免疫熒光法各組均可見星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，各組無明顯差異。尼氏染色各組均可見神經(jīng)元缺失情況，各組無明顯差異。結(jié)論 Cy5-AMT-SPIONs雙模探針對(duì)癲癇有精確靶向定位作用且對(duì)腦組織無明顯毒害作用。

顳葉癲癇； Cy5； α-甲基色氨酸； 超順氧化鐵磁性納米粒子； 雙模探針

顳葉癲癇是最常見的難治性癲癇之一，藥物治療往往效果不理想，手術(shù)治療成為主要的治療手段，而難治性癲癇病灶的精確定位是手術(shù)治療的關(guān)鍵之一。α-甲基色氨酸(alpha-methyl-L-tryptophan，AMT)是一種合成的氨基酸，有研究表明其可對(duì)癲癇病灶起到主動(dòng)靶向定位作用，國(guó)外Akhtari等[1]首次將AMT與MRI結(jié)合用于致癇灶定位研究，發(fā)現(xiàn)一種新型的fMRI方法。我們課題組前期實(shí)驗(yàn)[2]證實(shí)AMT的靶向定位，并探討了其最佳掃描時(shí)間。Cy5.5作為熒光染料的代表，具有在近紅外區(qū)域的最低吸收光譜，并可以深入患病組織[3]。Cy5是近紅外區(qū)的染料分子，作為一種熒光探針分子具有超靈敏成像的優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)以AMT作為探針的導(dǎo)向部分，通過將其與Fe3O4超順磁性納米顆粒和熒光染料Cy5 耦聯(lián)，構(gòu)建具有核磁/光學(xué)雙模態(tài)成像功能的癲癇病灶特異性分子影像探針，開展體內(nèi)成像實(shí)驗(yàn)，為提高癲癇病灶早期診斷的準(zhǔn)確率和特異性提供了分子影像學(xué)和光學(xué)支持。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 磁性納米粒子 超順氧化鐵磁性納米粒子(superparamagnetic iron oxide nanoparticles，SPIONs)、Cy5標(biāo)記的超順氧化鐵磁性納米粒子(Cy5-SPIONs)、Cy5標(biāo)記的α-甲基色氨酸的超順氧化鐵磁性納米粒子(Cy5-AMT-SPIONs)(南京東納公司)。

1.1.2 其他實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雄性Sprague Dawley大鼠(山東魯抗實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證scxk魯20140007)，3.0T超導(dǎo)型MR掃描儀(德國(guó)西門子)，激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)蔡司公司)，恒冷切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)、氯化鋰、匹羅卡品、甲基化阿托品(美國(guó)Sigma)，抗GFAP一抗、cy3 標(biāo)記標(biāo)記驢抗兔二抗(英國(guó)Abcam)，水合氯醛、普魯士藍(lán)試劑盒(北京索萊寶公司科技有限公司)，甲苯胺藍(lán)染色(江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司)，生理鹽水(山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司)，無水乙醇、甲醇、氯化鈉、多聚甲醛等實(shí)驗(yàn)室常用藥品(山東省萊陽市鐵塔化工用品廠)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物顳葉癲癇模型制作 選擇健康雄性Sprague Dawley大鼠40只，體重200～250 g，環(huán)境為清潔級(jí)，溫度維持在20 ℃，分籠飼養(yǎng)，飼以標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲水，固定12 h人工晝夜循環(huán)的環(huán)境。采用氯化鋰-皮羅卡品誘導(dǎo)急性顳葉癲癇模型。具體方法如下：SD大鼠第1天提前18～24 h 腹腔注射氯化鋰(LiCl) 127 mg/kg;第2天提前30 min腹腔注射溴化甲基阿托品1 mg /kg，30 min后實(shí)驗(yàn)組腹腔注射新鮮配置的匹羅卡品30 mg/kg，按照Racine 癲癇行為標(biāo)準(zhǔn)觀察記錄大鼠行為30 min，若大鼠未達(dá)到Racine 分級(jí)的Ⅳ～Ⅴ級(jí)的癇性發(fā)作，繼續(xù)追加匹羅卡品的劑量，每隔10 min重復(fù)注射匹羅卡品一次，每次為10 mg/kg，最大追加劑量可達(dá)60 mg/kg。發(fā)作級(jí)別達(dá)Racine 分級(jí)Ⅳ～ Ⅴ級(jí)，發(fā)作持續(xù)1 h以上視為成功的顳葉癲癇模型。

1.3 分組 在造模成功且存活的顳葉癲癇模型中，按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)挑選出30只大鼠進(jìn)行急性期實(shí)驗(yàn)，共分為3組，每組10只，各組分別為：第1組:超順氧化鐵磁性納米粒子組(SPIONs組)；第2組：Cy5標(biāo)記的超順氧化鐵磁性納米粒子組(Cy5- SPIONs組)；第3組：Cy5標(biāo)記的α-甲基色氨酸的超順氧化鐵磁性納米粒子組(Cy5- AMT-SPIONs組)。

1.4 磁共振掃描及藥物注射 首先腹腔注射水合氯醛(0.3～0.4 ml/100 mg)誘導(dǎo)麻醉，觀察處于麻醉狀態(tài)后，水平趴在3英寸線圈上方并固定，使線圈的中心與大鼠體部及磁場(chǎng)的中心保持一致。采用西門子3.0T超導(dǎo)型MR掃描儀，行同參數(shù)MR T2序列和T2map序列,掃描序列為：T2sequences，2500 TR/TE 70，F(xiàn)OV 80 mm，層厚2.0 mm，片層12，掃描時(shí)間7.20 min。使用T2mapping軟件測(cè)量致癇灶局部組織的信號(hào)強(qiáng)度T2值。掃描時(shí)盡量使掃描定位一致，保持圖像對(duì)比的一致性，各組SD大鼠選擇癲癇發(fā)作后48 h進(jìn)行尾靜脈藥物注射，于注射藥物前和后4 h分別進(jìn)行磁共振掃描。

1.5 病理組織學(xué)檢查

1.5.1 腦組織取材 磁共振掃描完畢后立即進(jìn)行心臟灌注后取腦組織，首先麻醉、固定，依次以0.9%生理鹽水、4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌注固定，分離腦組織置于4%的多聚甲醛4 ℃過夜固定，后放入30%的蔗糖溶液中4 ℃浸泡至組織塊沉底，后行與MRI致癲灶位置吻合的位置連續(xù)冠狀冰凍切片，-80 ℃保存?zhèn)溆糜诮M織染色。

1.5.2 普魯士藍(lán)染色 冰凍切片4 ℃復(fù)溫30 min后涼干，蒸餾水沖洗2 min；入Perls,stain，浸染15～30 min；蒸餾水沖洗2～5 min；入核固紅染色液5～10 min；自來水沖洗1～5 s；常規(guī)脫水，二甲苯透明5 min，中性樹膠封片，采用普通顯微鏡觀察行圖像采集。

1.5.3 DAPI染色激光共聚焦顯微鏡下觀察Cy5在大腦中的分布情況 將冰凍切片4 ℃復(fù)溫30 min，加5%山羊血清封閉2 h， DAPI孵育染核10 min，室溫避光；PBS洗滌3次，每次10 min；抗熒光衰減封片劑封片，采用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行圖像采集。

1.5.4 免疫熒光染色 將冰凍切片4 ℃復(fù)溫30 min，加5%山羊血清封閉2 h，加入抗GFAP一抗4 ℃ 孵育16 h，PBS洗滌3次，每次10 min；加入cy3標(biāo)記驢抗兔二抗，避光室溫條件孵育2 h，PBS洗滌3次，每次10 min；DAPI孵育染核10 min，室溫避光；PBS洗滌3次，每次10 min；抗熒光衰減封片劑封片，采用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行圖像采集。

1.5.5 尼氏染色 冰凍切片4 ℃復(fù)溫30 min后涼干，PBS洗滌3次，每次10 min； 60 ℃的0.5%甲苯胺藍(lán)水溶液染色5～10 min；蒸餾水沖洗；70%酒精浸泡2 min；95%酒精中分色；梯度脫水；二甲苯Ⅰ、Ⅱ中透明各5 min，中性樹膠封片，采用普通顯微鏡進(jìn)行圖像采集。

2 結(jié) 果

2.1 造模情況 SD大鼠腹腔注射匹羅卡品10 min后開始出現(xiàn)排便排尿、軀體抖動(dòng)、行動(dòng)刻板等，直至最終出現(xiàn)全身強(qiáng)直-陣攣癲癇大發(fā)作，待發(fā)作持續(xù)1 h以上后給予水合氯醛終止發(fā)作，并加強(qiáng)呼吸道護(hù)理，給予葡萄糖、奶粉能量支持，降低死亡率。造模成功率為80%(40只大鼠，35只成功建立急性期模型，后死亡3只，存活32只)，從成功癲癇模型中隨機(jī)選擇30只癲癇大鼠用于實(shí)驗(yàn)研究。

2.2 磁共振掃描 急性期MRI顯示T2序列雙側(cè)顳葉海馬高信號(hào)病灶，給藥前3組致癇灶T2信號(hào)無明顯差異，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，組1、組2注射藥物前后經(jīng)比較T2信號(hào)無明顯差異，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，組3 注射藥物后T2信號(hào)明顯降低，T2map值顯著下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) (見圖1、表1)。

2.3 大鼠腦組織病理組織染色結(jié)果

2.3.1 普魯士藍(lán)染色觀察鐵粒子在海馬區(qū)的分布情況 3組鏡下均可見藍(lán)棕色顆粒分布，主要分布在細(xì)胞漿內(nèi)。其中組3鐵粒子分布較多，相對(duì)組1、組2鐵粒子分布有明顯差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) ，組2相對(duì)組1鐵粒子分布無明顯差異，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見圖2、表2)。

2.3.2 在激光共聚焦顯微鏡下觀察Cy5熒光分子在在大腦中的分布情況 可見組1無Cy5分布，組2、組3均有Cy5的分布，各組Cy5分布兩兩相比較有明顯差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) (見圖3、表3)。

2.3.3 在激光共聚焦顯微鏡下觀察各組星形膠質(zhì)細(xì)胞增生情況 各組均可見星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，各組間兩兩相比較無明顯差異，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見圖4、表4)。

2.3.4 尼氏染色觀察各組海馬神經(jīng)元缺失情況 尼氏染色鏡下可見，各組大鼠海馬CA1、CA3區(qū)大量神經(jīng)元缺失，空泡樣變性，神經(jīng)元形態(tài)異常，呈三角形或不規(guī)則形態(tài)，細(xì)胞排列紊亂，胞核與胞漿分界不清,各組相比較無明顯差異，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見圖5、表5)。

表1 3 組癲癇模型大鼠MRI T2map值

給藥后與給藥前比較*P>0.05

表2 3組癲癇模型大鼠普魯士藍(lán)鐵粒子數(shù)目±s)

組1與組2分別與組3比較*P<0.05

表3 3 組癲癇模型大鼠Cy5數(shù)目

3組間兩兩比較P<0.05

表4 3組癲癇大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目 ±s)

3組間兩兩比較P>0.05

表5 3組癲癇大鼠神經(jīng)元數(shù)目 ±s)

3組間兩兩比較P>0.05

3 討 論

血腦屏障在發(fā)揮中樞神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)作用的同時(shí)也阻礙了診斷和治療藥物向腦部的遞送[4]。超順磁性Fe3O4納米顆粒由于粒徑小、比表面積大、磁性強(qiáng)、制備工藝簡(jiǎn)單，同時(shí)又對(duì)人體不產(chǎn)生毒副作用、無免疫原性、可隨人體代謝排除體外、易穿過各種生理屏障到達(dá)指定部位，使其廣泛應(yīng)用[5]。最近納米粒子的發(fā)展促使各種磁性納米粒子的設(shè)計(jì)及合成，研究表明納米粒子在組織中以依賴濃度的方式改變了周圍質(zhì)子的磁環(huán)境并改變T1和/或T2信號(hào)[6]。α-甲基色氨酸是色氨酸的類似物，在癲癇灶中具有高攝取的特點(diǎn)[7]。小分子熒光探針由于具有良好的光學(xué)性能和優(yōu)異的生物相容性使得其口服給藥已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[8]。本實(shí)驗(yàn)制備Cy5標(biāo)記的α甲基色氨酸的超順氧化鐵磁性納米粒子，構(gòu)建具有核磁/光學(xué)雙模態(tài)成像分子影像探針。我們比較說明SPIONs、Cy5-SPIONs、Cy5-AMT-SPIONs在磁共振上的成像，發(fā)現(xiàn)注射Cy5-AMT-SPIONs前后磁共振T2相信號(hào)下降明顯，注射Cy5-SPIONs、SPIONs前后磁共振T2相信號(hào)變化不明顯，證實(shí)AMT的主動(dòng)靶向定位作用，我們課題組前期也已經(jīng)證明了α-甲基色氨酸對(duì)癲癇的靶向定位價(jià)值，且證明超順磁性納米粒子可以降低T2信號(hào)，因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)研究中注射劑量為4 mg/kg，相比課題組先前注射的15 mg/kg[2]，鐵離子劑量明顯減少，推測(cè)T2相信號(hào)的下降或許與鐵離子劑量相關(guān)，下一步應(yīng)繼續(xù)探討鐵離子劑量對(duì)磁共振成像的影響。靶向模式分為被動(dòng)靶向和主動(dòng)靶向，其中Fe3O4納米粒子基本上是通過組織器官對(duì)Fe3O4納米粒子的攝取來實(shí)現(xiàn)的，屬于被動(dòng)靶向模式。Fe3O4納米粒子的外殼包被材料如果裝配上特異性配體分子抗體、小分子配體、多肽配體等，借助于受體-配體的特異性結(jié)合作用，使得Fe3O4納米粒子與體內(nèi)組織或器官的特異性表面受體結(jié)合，達(dá)到對(duì)特定的靶細(xì)胞組織和器官進(jìn)行對(duì)比增強(qiáng)成像的目的，從而進(jìn)一步提高病灶的檢出率此時(shí)即為主動(dòng)靶向模式。普魯士藍(lán)染色比較各組鐵粒子的分布可見注射SPIONs、Cy5-SPIONs、Cy5-AMT- SPIONs海馬區(qū)均有鐵粒子分布，注射Cy5-AMT- SPIONs組相對(duì)其他兩組有顯著差異，在組織學(xué)上再次證明AMT對(duì)超順磁性納米粒子的主動(dòng)靶向作用。激光共聚焦顯微鏡下觀察各組Cy5在大腦中的分布，注射Cy5-SPIONs組Cy5在大腦病灶中有分布，表明Cy5可以通過超順磁性納米粒子進(jìn)行被動(dòng)靶向到致癇灶，注射Cy5-AMT-SPIONs組Cy5在大腦病灶中有分布，相對(duì)Cy5-SPIONs組大腦中Cy5分布較多，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，進(jìn)一步證明了AMT對(duì)熒光分子有主動(dòng)靶向作用，證實(shí)在AMT的主動(dòng)靶向作用下Cy5可深入致癇灶組織。免疫熒光觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞、尼氏染色觀察神經(jīng)元情況，各組無明顯差異，表明Cy5標(biāo)記的α-甲基色氨酸的磁性納米粒子雙模探針在急性顳葉癲癇模型精確定位是安全的，但是未進(jìn)行相關(guān)的毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)研究表明Cy5標(biāo)記的α-甲基色氨酸的磁性納米粒子能特異性定位急性癲癇模型致癇灶，達(dá)到解剖定位與功能定位一致的精確定位作用。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建具有核磁/光學(xué)雙模態(tài)成像功能的癲癇病灶特異性分子影像探針，開展體內(nèi)成像實(shí)驗(yàn)，為提高癲癇病灶早期診斷的準(zhǔn)確率和特異性提供分子影像學(xué)和光學(xué)支持。下一步需繼續(xù)探討不同劑量鐵離子及不同劑量熒光分子對(duì)核磁/光學(xué)雙模態(tài)成向的影響。

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圖1 各組磁共振掃描圖像 注：圖A1～D1為組1；圖A2～D2為組2；圖A3～D3為組3。圖A1～A3、C1～C3為各組注射藥物前后MR T2序列相；圖B1～B3、D1～D3為各組注射藥物前后T2map 序列相，箭頭所指為組3給藥后T2信號(hào)明顯下降

圖2 各組普魯士藍(lán)染色情況 注：A為組1，B為組2，C為組3，箭頭所指為鐵粒子的分布(×400倍)

圖3 各組Cy5在大腦中的分布情況 注：A為組1，B為組2，C為組3，箭頭所指為Cy5的分布(×200倍)

圖4 星形膠質(zhì)細(xì)胞增生情況 注：可見星形角質(zhì)細(xì)胞增生(×200倍);圖5 海馬組織尼氏染色情況 注：可見神經(jīng)元缺失，空泡樣變性，神經(jīng)元形態(tài)異常，呈三角形或不規(guī)則形態(tài)，排列紊亂，胞核與胞漿分界不清(×400倍)

The target location of chelating Cy5-AMT-SPIONs dual-mode probe in acute temporal lobe epilepsy model

WANGYanli，KONGQingxi,ZHENGge.

(GraduateSchool，TianjinMedicalUniversity，Tianjin300070，China)

Objective To investigate the target location by the action of chelating Cy5 labeled alpha-methyl-L-tryptophan superparamagnetic iron oxide nanoparticles dual-mode probe on lithium chloride-Piluoka induced acute temporal lobe epilepcy model.Methods Thirty temporal lobe epilepsy rats were randomly and evenly assigned to superparamagnetic iron oxide nanoparticles group,Cy5 labeled superparamagnetic iron oxide nanoparticles group,Cy5 labeled alpha methyl tryptophan superparamagnetic iron oxide nanoparticles group.Each group was prior to drug injection,injection after 4 h,with parameters MR T2weighted images and T2map sequence and we used T2mapping software to measure the T2value.Perl，iron stain was used to observe the iron distribution in the hippocampus.We used laser scanning confocal microscope to observe the distribution of Cy5 in the brain.Immunofluorescence staining was used to observe the astrocyte proliferation,Nissl staining was used to observe the neuronal loss situation.Results T2signal of the superparamagnetic iron oxide nanoparticles group decreased slightly,T2signal of Cy5 labeled sup superparamagnetic iron oxide nanoparticles group decreased slightly,Cy5 labeled alpha methyl tryptophan superparamagnetic iron oxide nanoparticles group decreased significantly.The iron was mainly distributed in the cytoplasm.The Cy5-AMT-SPIONs group was significantly different from the other groups in the distribution of iron in the hippocampus area by Prussian blue staining.Laser scanning confocal microscope observation groups Cy5 fluorescence distribution had obvious differences.Immunofluorescence observed were visible astrogliosis.There was no significant difference between the groups.Nissl staining of groups were visible neuron loss groups.There was no significant difference between the groups.Conclusion Cy5 labeled alpha methyl tryptophan superparamagnetic iron oxide nanoparticles dual-mode probe had an impact on precise targeting positioning function of epilepsy and had no obvious toxic effect on the brain tissue.

Temporal lobe epilepsy; Cy5; Alpha-methyl-L-tryptophan; Superparamagnetic iron oxide nanoparticles; Dual-mode probe

1003-2754(2016)12-1072-04

2016-08-12；

2016-09-30 基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(No.81371423) 作者單位：(1.天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津 300070；2.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東 濟(jì)寧 272000；3吉林大學(xué)第二醫(yī)院肝膽胰外科，吉林 長(zhǎng)春 130041) 通訊作者：孔慶霞，E-mail：kqx1970@aliyun.com

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