尹周 嚴(yán)曉銘 綜述 薛群 審校

外泌體介導(dǎo)神經(jīng)免疫與多發(fā)性硬化

尹周 嚴(yán)曉銘 綜述 薛群 審校

目的 外泌體顆粒內(nèi)部和表面均攜帶活性膜蛋白、脂質(zhì)和遺傳物質(zhì)，這些物質(zhì)可進(jìn)行信息傳遞，參與多種生物信號(hào)通路，如免疫應(yīng)答、炎性反應(yīng)等過程。研究結(jié)果顯示，外泌體在多發(fā)性硬化(MS)等多種自身免疫性疾病中含量明顯增加，可作為潛在的信息載體參與MS的生理病理過程，但其具體作用及機(jī)制尚不清楚。外泌體信號(hào)在細(xì)胞與細(xì)胞間的傳導(dǎo)加深了人們對MS發(fā)生、發(fā)展的認(rèn)識(shí)，同時(shí)為MS和其他神經(jīng)免疫性疾病的治療和干預(yù)提供了新的策略。本文主要就外泌體在免疫細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞之間炎性反應(yīng)誘導(dǎo)和炎性反應(yīng)擴(kuò)散的作用進(jìn)行綜述，并就外泌體對MS發(fā)生和發(fā)展的影響以及其在MS診斷和治療中的作用做一介紹。

多發(fā)性硬化；外泌體；神經(jīng)免疫；發(fā)病機(jī)制

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是發(fā)生在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的自身免疫性疾病，其病理特點(diǎn)是髓鞘脫失并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤，進(jìn)而引起神經(jīng)功能障礙。多項(xiàng)研究結(jié)果顯示MS與遺傳易患基因、環(huán)境因素、免疫穩(wěn)態(tài)等多因素有關(guān)，但其發(fā)病機(jī)制仍不完全明確。近年來研究證實(shí)外泌體(exosomes)參與MS的多個(gè)生理病理過程，同時(shí)，外泌體介導(dǎo)的炎性反應(yīng)可以破壞血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)，主要是通過周圍炎性細(xì)胞釋放含有干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)等炎性細(xì)胞因子有關(guān)的外泌體[1]。如IFN-γ可改變BBB腦內(nèi)皮細(xì)胞之間的組織結(jié)構(gòu)和緊密性，TNF-α和IL-1β通過表達(dá)一氧化氮合酶破壞BBB[2]。BBB緊密性的破壞可使白細(xì)胞遷移至CNS內(nèi)，進(jìn)而引起髓鞘脫失[3]。此外，小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體含有 IL-1β和Ⅱ型主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC-Ⅱ)，也可促進(jìn)神經(jīng)炎性擴(kuò)散，促進(jìn)MS的進(jìn)展。外泌體不僅直接影響MS的生理病理過程，而且可預(yù)示疾病的發(fā)展?fàn)顩r，提示外泌體可能成為MS發(fā)病機(jī)制潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[4]。

1 外泌體特性與生物學(xué)功能

外泌體是一種直徑約30～100 nm的膜性小囊泡，來源于晚期胞內(nèi)體〔也稱多泡體(multivesi-cular bodies)〕，電鏡下呈雙凹圓盤狀或杯口狀[5]。外泌體不同于一般的凋亡小體，是在細(xì)胞內(nèi)吞系統(tǒng)中形成、分泌和釋放[6]。活細(xì)胞通過內(nèi)吞途徑將原始胞內(nèi)小泡等內(nèi)吞物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)閮?nèi)吞小體，融合成早期胞內(nèi)體。在早期胞內(nèi)體成熟過程中，管腔內(nèi)囊泡(intraluminal vesicles)中的內(nèi)含物質(zhì)和表面分子構(gòu)成發(fā)生極大變化，蛋白和信號(hào)復(fù)合物聚集在多泡體內(nèi)膜上，通過多泡體膜內(nèi)陷選擇性地與管腔內(nèi)囊泡融合[7]，隨后多泡體內(nèi)的小囊泡進(jìn)入細(xì)胞外環(huán)境中形成外泌體。研究證實(shí)外泌體中含有mRNA、microRNA、蛋白質(zhì)和信號(hào)復(fù)合物等物質(zhì)，有些是所有外泌體共同標(biāo)記分子，如熱休克蛋白70[8]，而有些則是依賴于它們所分泌的細(xì)胞類型[7]，如抗原遞呈細(xì)胞釋放的外泌體攜帶的主要是MHC，而少突膠質(zhì)細(xì)胞釋放的外泌體可攜帶髓鞘蛋白[9]。這些囊泡可由體內(nèi)和體外培養(yǎng)的活細(xì)胞分泌而來，如神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞，同時(shí)也存在于腦脊液中[10]。

研究證實(shí)外泌體是細(xì)胞間交流的特殊媒介[11-12]，神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞可借助外泌體實(shí)現(xiàn)物質(zhì)的轉(zhuǎn)移和信號(hào)的傳遞，形成精密高效的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)。如神經(jīng)元來源的外泌體受鈣內(nèi)流和突觸谷氨酸能突觸活性的影響[13]，同時(shí)神經(jīng)元可通過釋放信號(hào)提高少突膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+通道的通透性以促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞外泌體的釋放[14]，且少突膠質(zhì)細(xì)胞釋放的外泌體能被鄰近神經(jīng)元通過內(nèi)吞作用內(nèi)化[15]。此外神經(jīng)元還能調(diào)節(jié)膠質(zhì)細(xì)胞外泌體對其自身蛋白、mRNA和miRNAs的供應(yīng)[14]。在氧化應(yīng)激條件下，膠質(zhì)細(xì)胞來源的外泌體可通過抑制神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞的黏附并釋放突觸蛋白Ⅰ促進(jìn)軸突生長和神經(jīng)元存活[16]。星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放的外泌體也可能影響神經(jīng)元的存活，小膠質(zhì)細(xì)胞可清除其他神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞釋放的多余外泌體，選擇性激活炎性反應(yīng)，影響突觸活性[17]。

在病理刺激或損傷情況下，外泌體可表現(xiàn)出免疫刺激特性而活化和傳遞炎性反應(yīng)[18]，進(jìn)而影響神經(jīng)系統(tǒng)功能。如樹突狀細(xì)胞分泌的外泌體表達(dá)MHC-Ⅱ類分子，可結(jié)合抗原肽形成MHC-抗原肽復(fù)合物，促進(jìn)T細(xì)胞活化[18-19]。感染的巨噬細(xì)胞可釋放外泌體并表達(dá)病原相關(guān)模式分子，通過模式識(shí)別受體刺激巨噬細(xì)胞活化，進(jìn)而促進(jìn)炎性反應(yīng)[20]。此外，外泌體也包含促炎性反應(yīng)介質(zhì)(如IL-1β和TNF-α)，其對炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié)和擴(kuò)散起到重要作用[18-19]。適當(dāng)?shù)难仔苑磻?yīng)有利于組織修復(fù)，但過度或持久的炎性反應(yīng)可引起慢性或更為嚴(yán)重的神經(jīng)炎性反應(yīng)，促進(jìn)疾病進(jìn)展[21]?？傊鲜鲎C據(jù)表明，外泌體不僅可誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)，而且可以促進(jìn)炎性反應(yīng)擴(kuò)散，在神經(jīng)免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。

2 外泌體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與BBB的破壞

目前認(rèn)為MS發(fā)病機(jī)制的始動(dòng)因素是免疫細(xì)胞的異?；罨?，并透過BBB進(jìn)入CNS。在多種因素下免疫系統(tǒng)的異常激活可使免疫細(xì)胞釋放外泌體(如內(nèi)皮細(xì)胞、血小板、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞)，其釋放的囊泡均參與MS的發(fā)病機(jī)制[3]。內(nèi)皮細(xì)胞釋放的外泌體不但可以在缺少其他任何刺激信號(hào)下激活CD4+和CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)毒性，而且可以作為潛在啟動(dòng)自身免疫性腦病的初始步驟[22]。另外，內(nèi)皮細(xì)胞來源的囊泡攜帶金屬蛋白酶不僅可以促進(jìn)BBB損傷[23]，而且可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞活化，活化的血管內(nèi)皮細(xì)胞可以表達(dá)不同的選擇素，通過與 T淋巴細(xì)胞表達(dá)的配體結(jié)合介導(dǎo) T細(xì)胞的邊集，使T細(xì)胞得到趨化信號(hào)，促進(jìn)淋巴細(xì)胞進(jìn)入CNS。MS患者血小板來源的囊泡與血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的外泌體具有類似的作用，血小板分泌的囊泡表面表達(dá)P-選擇素可以增加細(xì)胞黏附分子極遲抗原-4(very late antigen-4，VLA-4)的表達(dá)[3]，與淋巴細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞黏附分子P-選凝素糖蛋白配基-1(platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PSGL-1)和血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1(platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1)相結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)淋巴細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合[24]。同時(shí)，血小板衍生的囊泡還可顯著增加腦內(nèi)皮細(xì)胞層的通透能力，參與BBB的破壞[25]。

已有研究表明，趨化因子CCL5、γ干擾素誘生蛋白10(IP-10)和單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP-1)均是與MS發(fā)病有關(guān)的趨化因子，應(yīng)用相應(yīng)的抗體可抑制實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)的進(jìn)展?；罨腡細(xì)胞釋放的外泌體含有趨化因子CCL5和花生四烯酸，可以募集單核細(xì)胞，并可以上調(diào)細(xì)胞間黏附分子(ICAM)和淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原(LFA-1)[3]。 ICAM/LFA-1 之間的相互作用可調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的滾動(dòng)、黏附和滲入，一旦BBB發(fā)生炎性改變，ICAM/LFA-1可發(fā)生相互作用，并與 CD4+T細(xì)胞的MHC-Ⅱ型分子結(jié)合，進(jìn)而促使自身反應(yīng)性T細(xì)胞滲出血管內(nèi)皮進(jìn)入CNS[1]，啟動(dòng)MS的發(fā)生和發(fā)展。

3 外泌體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與MS進(jìn)展

越來越多的研究證實(shí)，免疫細(xì)胞釋放的外泌體具有免疫刺激特性，對免疫細(xì)胞的活化和炎性反應(yīng)的播散起到推動(dòng)作用[18]，促進(jìn)MS的發(fā)生和發(fā)展。BBB的損傷可影響其通透性，促進(jìn)單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的活化，黏附和跨膜遷移進(jìn)入CNS[26]。如果自身反應(yīng)性 T細(xì)胞一旦獲得進(jìn)入CNS的通路，就可以通過自身分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)降解血管基底膜的Ⅳ型膠原，尤其是MMP-9可以輔助淋巴細(xì)胞穿透細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)。其次，單核細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞釋放的外泌體攜帶胱天蛋白酶1(caspases 1)，可調(diào)節(jié)MMPs的蛋白水解活性[27]，促使許多重要的分子前體迅速通過蛋白溶解過程，轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚孕问?，如?xì)胞因子TNF-α或TNF-β前體、細(xì)胞因子受體IL6R和血管細(xì)胞黏附因子。這些細(xì)胞因子的活化使BBB破壞進(jìn)一步加重，使?jié)撛谥虏⌒缘募?xì)胞和抗體很快進(jìn)入CNS，加重組織破壞程度。

研究發(fā)現(xiàn)MS患者腦脊液和血液中外泌體水平明顯增加，這些外泌體囊泡含有IL1-β、MHC-Ⅱ等其他炎性成分[28]，在炎性反應(yīng)因子的作用下Th17/Treg平衡被打破而誘發(fā)MS[29]，同時(shí)濾泡輔助性T細(xì)胞(Tfh)在炎性信號(hào)的影響下產(chǎn)生IL-21、IL-10等細(xì)胞因子，輔助異位淋巴濾泡中的B細(xì)胞分化成漿細(xì)胞并產(chǎn)生抗體[30]，進(jìn)而促進(jìn)MS發(fā)展。MS病變部位釋放含有細(xì)胞因子和趨化因子的外泌體可以募集膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，引起持續(xù)的免疫激活反應(yīng)從而導(dǎo)致慢性炎性反應(yīng)過程[31]。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，將小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的外泌體注射到EAE模型小鼠大腦可發(fā)現(xiàn)大量的炎性細(xì)胞向注射部位募集[32]。在MS患者中，活化內(nèi)皮細(xì)胞脫落的囊泡可促進(jìn)單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的遷移穿過BBB，并輔助形成脫髓鞘病灶。這一假說由Jimenez等[33]實(shí)驗(yàn)證實(shí)：通過給予大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(microvascular endothelial cell，MVEC)模型注射緩解或復(fù)發(fā)性MS患者和對照組的血漿，發(fā)現(xiàn)只有復(fù)發(fā)患者的血漿可明顯促進(jìn)淋巴細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移。

綜上所述，這些含有炎性介質(zhì)的外泌體通過多種途徑引起B(yǎng)BB損傷，大量的免疫細(xì)胞遷移透過BBB進(jìn)入CNS，同時(shí)分泌的囊泡將信號(hào)傳遞至CNS內(nèi)，引起腦內(nèi)皮細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞產(chǎn)生含有趨化因子、整合素等促炎性分子的外泌體。通過免疫細(xì)胞與神經(jīng)細(xì)胞之間的多重相互作用引起炎性反應(yīng)的進(jìn)展與播散，從而進(jìn)一步加重BBB的破壞和神經(jīng)功能的損傷。外泌體的信號(hào)傳遞可能通過免疫細(xì)胞與膠質(zhì)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)細(xì)胞之間的聯(lián)系引起炎癥反應(yīng)的播散，啟動(dòng)并發(fā)展為MS。

4 外泌體與MS的診斷

外泌體可間接反映腦內(nèi)細(xì)胞的狀態(tài)，據(jù)此推測其可能含有神經(jīng)免疫性疾病早期生化改變的關(guān)鍵信息。人腦脊液外泌體蛋白組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)外泌體含有大量標(biāo)記性蛋白，如熱休克蛋白、四跨膜超家族蛋白和腦內(nèi)衍生蛋白等，其揭示了外泌體可作為生物標(biāo)記物的潛力[34]。

研究證實(shí)，外泌體與“毒性”蛋白在大腦內(nèi)的播散和多種神經(jīng)變性疾病的進(jìn)展有關(guān)[35]。目前許多關(guān)于外泌體的研究集中于細(xì)胞外的miRNA功能，miR-122惟一被證實(shí)與MS相關(guān)[36]。最近一項(xiàng)研究結(jié)果顯示，幼齡大鼠產(chǎn)生的血清外泌體可明顯增加髓磷脂含量，增加少突膠質(zhì)前體細(xì)胞水平和神經(jīng)干細(xì)胞水平，減少海馬區(qū)氧化應(yīng)激反應(yīng)[37]，這些含有高濃度的miR-219外泌體在緊密髓磷脂的形成與維持中起著重要作用[38-39]，然而在人類MS患者中缺乏相關(guān)miR-219的外泌體[40]。

MS患者腦脊液中外泌體的含量明顯高于健康人，在急性期小膠質(zhì)細(xì)胞衍生的囊泡的數(shù)量高于病情穩(wěn)定或慢性期階段，并且內(nèi)皮細(xì)胞分泌的外泌體聯(lián)合CD31濃度的檢測對MS的臨床診斷與釓增強(qiáng)磁共振成像相比具有更高的靈敏度[3]。另一項(xiàng)研究顯示，復(fù)發(fā)-緩解型MS患者腦脊液中骨髓細(xì)胞衍生的囊泡(IB4+)水平與健康對照組相比明顯增加[32]，相對穩(wěn)定或慢性階段而言，急性階段腦脊液中外泌體的含量明顯增高。其次，外泌體在腦脊液中的含量與MRI檢測病損程度呈線性相關(guān)[35]。因此，無論發(fā)病高峰或臨床復(fù)發(fā)，還是慢性階段，腦脊液中外泌體濃度很好地反映出疾病的過程和嚴(yán)重程度。

5 外泌體與MS的治療

由于BBB限制了98%的蛋白成分藥物不能透過BBB，進(jìn)而影響CNS疾病的治療[41]。雖然目前已經(jīng)研制出不同納米顆粒的藥物，但仍面臨納米毒性和快速清除的挑戰(zhàn)[42]。而外泌體可以越過BBB，并可有效地減少藥物清除率[43]。在MS的治療中，經(jīng)過修飾的外泌體可遞送相關(guān)信息促進(jìn)髓鞘再生[44]。例如EAE孕鼠血清外泌體能抑制淋巴細(xì)胞增殖而促進(jìn)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(oligodendrocyte precursor cells)增殖和遷移，其原因可能與白血病抑制因子受體(leukemia inhibitory factor receptor)穿過BBB后嵌入少突膠質(zhì)前體細(xì)胞質(zhì)膜介導(dǎo)白血病抑制因子信號(hào)有關(guān)[45]，從而保護(hù)EAE軸突及促進(jìn)髓鞘再生。此外，無論在體外或體內(nèi)，IFN-γ刺激樹突狀細(xì)胞分泌的外泌體含有大量的miR219分子，可以增加髓鞘形成和氧化應(yīng)激的耐受性[44]，這些含有高濃度抗炎miRNA分子的外泌體可能在抑制MS的發(fā)展中起到免疫調(diào)節(jié)的作用[44，46]。因此，外泌體自身不僅可作為治療藥物，而且可作為結(jié)合藥物的載體，滿足精準(zhǔn)醫(yī)療的需求。

綜上所述，MS的發(fā)生可能主要通過周圍的炎性細(xì)胞釋放含有促炎細(xì)胞因子的外泌體介導(dǎo)炎性反應(yīng)，破壞BBB進(jìn)而使白細(xì)胞邊集、滲出、遷移至CNS內(nèi)。同時(shí)促進(jìn)神經(jīng)炎性反應(yīng)擴(kuò)散，進(jìn)而引起髓鞘脫失、神經(jīng)元損傷，發(fā)生神經(jīng)功能障礙，推進(jìn)MS的發(fā)展。外泌體參與細(xì)胞與細(xì)胞間信號(hào)的傳導(dǎo)，在促進(jìn)炎性反應(yīng)進(jìn)展中扮演重要的角色。深化對外泌體相關(guān)免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究將為進(jìn)一步闡明MS發(fā)病機(jī)制提供新的見解和認(rèn)識(shí)，為MS的診斷和治療干預(yù)提供新思路。

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(本文編輯：時(shí)秋寬)

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