過華蕾 王文慧 邵 暢

宮頸組織HPV感染與Dicer基因表達(dá)相關(guān)性分析

過華蕾1王文慧1邵 暢2

宮頸癌；HPV感染；Dicer

在世界范圍內(nèi)宮頸癌發(fā)病率位于女性腫瘤的第二位，每年有近50萬女性被確診為宮頸癌[1]。大量臨床證據(jù)與研究結(jié)果都證實(shí)人乳頭狀瘤病毒（Human Papillomavirus，HPV）的感染是宮頸癌發(fā)生的必要條件和主要危險(xiǎn)因素，然而HPV感染在育齡期婦女中相當(dāng)常見[1]。由于微小核糖核酸（microRNA，miRNA）已被報(bào)道是潛在的癌基因或抑癌基因，作為其加工酶，Dicer也備受關(guān)注。Dicer基因在果蠅中首次發(fā)現(xiàn)，最初被認(rèn)為是為了抵抗病毒入侵進(jìn)化而來[2]。真菌、線蟲、植物、哺乳動物以及人中均存在其同源序列，在人體中發(fā)揮作用只有Dicer1基因[3]。已有研究[4-6]表明，Dicer基因在不同種類的惡性腫瘤中表達(dá)異常。然而在宮頸正常及癌前病變的組織中，Dicer基因的表達(dá)情況尚不明確，而其表達(dá)與HPV感染的關(guān)系也未見報(bào)道。本研究收集正常宮頸標(biāo)本25份，宮頸上皮內(nèi)瘤變（Cervical Intraepithelial Neoplasia，CIN）組織75份，對收集的標(biāo)本進(jìn)行HPVL1及Dicer1免疫組化染色，由此對HPV感染與Dicer基因表達(dá)相關(guān)性進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料選取2013年8月—2015年8月于杭州市第一人民醫(yī)院行宮頸環(huán)切術(shù)患者共100例，年齡28～62歲，平均46.8歲，無其它基礎(chǔ)疾病。100例患者取宮頸組織標(biāo)本100份，包括HE染色確診正常宮頸組織25份、CINⅠ25份、CINⅡ25份、CINⅢ25份。

1.2 免疫組織化學(xué)法檢測HPV L1與Dicer1蛋白表達(dá)將標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)脫蠟和復(fù)水。放入EDTA緩沖液中進(jìn)行微波抗原修復(fù)，滴加過氧化酶阻斷溶液以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，正常羊血清封閉，分別滴加一抗配置濃度均為1∶100，4℃過夜。次日依次加生物素標(biāo)記的二抗和鏈霉親和素-辣根過氧化物酶結(jié)合的復(fù)合物一起孵育。3，3-二氨基聯(lián)苯胺染色，蘇木精-伊紅復(fù)染，脫水、透明、封固。免疫組化結(jié)果由兩位高年資病理科醫(yī)師判讀。陽性染色為棕黃色顆粒，特異性位于細(xì)胞漿內(nèi)，隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野（400倍）計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，至少計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞。參照文獻(xiàn)[3]綜合計(jì)分法（綜合陽性細(xì)胞所占比例和染色強(qiáng)度），在高倍鏡下對細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)如下評分：（1）無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。（2）陽性范圍：＜5%為0分，5%～25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，＞75%為4分。將兩種評分結(jié)果相加，分?jǐn)?shù)分為4個(gè)等級：0～1分為陰性（-），2分為弱陽性（1+），3～4分為中度陽性（2+），5～7分為強(qiáng)陽性（3+）。弱陽性、中度陽性和強(qiáng)陽性例數(shù)之和作為陽性總數(shù)。按綜合評分的等級來評價(jià)蛋白變化情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組陽性表達(dá)率比較用卡方檢驗(yàn)或Fisher＇s精確概率法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常組織HPV感染與Dicer基因表達(dá)情況的關(guān)系25份正常宮頸組織中HPV L1陰性8份（32.0%），其中Dicer1陰性表達(dá)7份（87.5%），Dicer1陽性表達(dá)1份（12.5%）；HPV L1陽性17份（68.0%），其中Dicer1陰性表達(dá)2份（11.76%），Dicer1陽性表達(dá)15份（88.24%）。對HPV L1與Dicer1表達(dá)相關(guān)性進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，證明HPV L1與Dicer1的表達(dá)呈明顯的正相關(guān)（χ2=10.445，P＜0.001）。正常宮頸組織HPV感染伴隨Dicer的表達(dá)，Dicer在HPV陰性的組織低表達(dá)（見封三圖1）。

2.2 宮頸上皮內(nèi)瘤變組織HPV感染與Dicer基因表達(dá)的關(guān)系75例宮頸上皮內(nèi)瘤變組織（其中CINⅠ25例、CINⅡ25例、CINⅢ25例）中HPV L1陽性75例（100%）。25例CINⅠ組織中，Dicer1陽性表達(dá)19例（76%）；25例CINⅡ組織中，Dicer1陽性表達(dá)20例（80%）；25例CINⅢ組織中，Dicer1陽性表達(dá)25例（100%）。宮頸上皮內(nèi)瘤變組織HPV感染伴隨Dicer表達(dá)，隨著病變程度增加Dicer表達(dá)的范圍和量亦增加（見封三圖2）。

3 討論

宮頸癌發(fā)生、發(fā)展一般經(jīng)過鱗狀上皮增生-不典型增生-原位癌-浸潤癌的緩慢過程[7]。大量的研究已經(jīng)表明，高危型HPV感染是宮頸癌的主要病因。本研究結(jié)果亦顯示，在宮頸癌前病變患者中，HPV陽性率明顯高于正常組。近年來得益于宮頸涂片篩查與HPV疫苗的應(yīng)用，宮頸癌的發(fā)病率有所下降。在我國，由于篩查尚未普及，疫苗的應(yīng)用也有待于臨床試驗(yàn)的完成，宮頸癌仍是嚴(yán)重威脅女性健康的疾病之

一[8]。

近幾年，miRNA與多系統(tǒng)腫瘤的相關(guān)研究成為熱點(diǎn)，Dicer和Drosha均屬于核糖核酸內(nèi)切酶-Ⅲ（RNase-Ⅲ）家族成員，在miRNA的合成與成熟過程中起到重要作用，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色。Dicer同時(shí)負(fù)責(zé)miRNA和干擾核糖核酸（Small Interfering RNA，siRNA）的產(chǎn)生[9]。其中miRNA參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化與凋亡，參與個(gè)體發(fā)育、機(jī)體代謝以及腫瘤發(fā)生、發(fā)展等過程[10]。Dicer基因在不同種類的惡性腫瘤中均有異常表達(dá)，其中有報(bào)道表明，Dicer基因在前列腺癌、肺腺癌、結(jié)直腸癌中高表達(dá)[11-13]，但卻在卵巢癌、乳腺癌、肝細(xì)胞癌中低表達(dá)[14-16]。上述資料可以看出Dicer基因在不同腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著不同的角色，這也可能直接參與了不同類型腫瘤中不同的miRNA表達(dá)譜情況。本研究結(jié)果顯示，宮頸上皮內(nèi)瘤變組織Dicer表達(dá)增強(qiáng)，隨著病變程度增加Dicer表達(dá)的量亦增加。已有研究[17]結(jié)果顯示，在宮頸癌患者組織標(biāo)本中，Dicer基因在蛋白及基因水平均呈高表達(dá)，且Dicer基因表達(dá)水平較低的患者往往具有更短的生存期，更差的預(yù)后。Dicer基因可能具備對抗宮頸癌進(jìn)展的作用，其機(jī)制可能是通過其相應(yīng)miRNA的作用，引起靶mRNA的降解或抑制其翻譯從而使癌基因表達(dá)上調(diào)或者下降。

而作為Dicer的另一種產(chǎn)物-siRNA，它的作用是參與生物體抵抗病毒的防御系統(tǒng)，如抵抗人缺陷免疫病毒（human immunodeficiency virus，HIV），甲型流感病毒（influenza A virus，IAV）等[18-19]。在哺乳動物的研究過程中，siRNA介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)成為了功能基因研究的一個(gè)有利工具,為我們認(rèn)識人類基因功能、抵抗病毒感染提供了理論依據(jù)和技術(shù)基礎(chǔ)。而HPV感染是宮頸癌發(fā)生的必要條件和主要危險(xiǎn)因素，Dicer基因?qū)箤m頸癌進(jìn)展的作用機(jī)制可能與其病毒防御功能相關(guān)。

本研究顯示，在人類宮頸組織HPV感染伴隨Dicer基因的表達(dá)，Dicer在HPV陰性的組織中低表達(dá)。在宮頸上皮內(nèi)瘤變組織中，隨著病變程度的增加，Dicer表達(dá)的范圍和量亦增加。這是首次在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)Dicer基因和HPV病毒感染相關(guān)。本研究提示，Dicer基因在宮頸癌發(fā)生發(fā)展的過程中起重要作用，為探討宮頸癌發(fā)病機(jī)制和靶向治療提供了新的思路。近年來已認(rèn)識到miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及演進(jìn)中發(fā)揮重要作用，因而以RNA干擾為基礎(chǔ)的基因沉默技術(shù)是治療癌癥的另一種方法。Dicer基因在此過程中可能成為關(guān)鍵性的靶點(diǎn)。在不同的腫瘤細(xì)胞中，Dicer基因的異常表達(dá)情況是十分復(fù)雜的。腫瘤的形成是多個(gè)細(xì)胞信號調(diào)節(jié)通路及其網(wǎng)絡(luò)異常的結(jié)果，雖然Dicer基因在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用和機(jī)制尚未完全明確，但它可能作為腫瘤治療的靶分子。隨著相關(guān)研究的進(jìn)展，Dicer基因可能使腫瘤的治療邁出新的一步。

［1］Thomison J 3rd，Thomas LK，Shroyer KR.Human papillomavirus：molecular and cytologic/histologic aspects related to cervical intraepithelial neoplasia and carcinoma［J］.Hum Pathol，2008，39（2）：154-166.

［2］Bernst ein E，Caudy AA，Hammond SM，et al.Role f or a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference［J］.Nature，2001，409（6818）：363.

［3］Lee YS，Nakahara K，Pham JW，et al.Distinct roles for Drosophila Dicer-1 and Dicer-2 in the siRNA/miRNA silencing pathways［J］.Cell，2004，117（1）：69-81.

［4］魏柳瓊，曾曙光，黃澤明，等.Dicer蛋白在口腔癌中的表達(dá)及其臨床意義［J］．廣東牙病防治，2012，20（6）：307-312.

［5］Sugito N，Ishiguro H，Kuwabara Y，et al.RNASEN regulates cell proliferation and affects survival in esophageal cancer patients［J］.Clin Cancer Res，2006，12（24）：7322-7328.

［6］韓磊，張安玲，岳曉，等.RNA干擾敲低Dicer對人膠質(zhì)瘤惡性表型的影響［J］．中華神經(jīng)外科雜志，2011，27（2）：132-135.

［7］Pientong C，Wongwarissara P，Ekalaksananan T，et al.Association of human papillomavirus type 16 long control region mutation and cervical cancer［J］．Virol J，2013，10（1）：1-9．

［8］Lu Q，Ma D，Zhao S.DNA methylation changes in cervival cancers［J］.Methods Mol Biol，2012，863（863）：155-176.

［9］彭杰軍，燕飛，陳海如，等.Dicer結(jié)構(gòu)和功能研究進(jìn)展［J］.遺傳，2008，30（12）：1550-1556.

［10］Gregory RI，Shiekhattar R.MicroRNA biogenesis and cancer［J］．Cancer Res，2005，65（9）：3509-3512.

［11］Chiosea S，Jelezcova E，Chandran U，et al.Up-regulation of dicer，a component of the MicroRNA machinery，in prostate adenocarcinoma［J］.Am J Pathol，2006，169（5）：1812-1820.

［12］Karube Y，Tanaka H，Osada H，et al.Reduced expression of Dicer associated with poor prognosis in lung cancer patients［J］.Cancer Sci，2005，96（2）：111-115.

［13］Faber C，Horst D，Hlubek F，et al.Overexpression of Dicer predicts poor survival in colorectal cancer［J］.Eur J Cancer，2011，47（9）：1414-1419.

［14］He L，Wang HY，Zhang L，et al.Prognostic significance of low DICER expression regulated by miR130a in cervical cancer［J］.Cell Death Dis，2014，5（5）：e1205.

［15］Yan M，Huang HY，Wang T，et al.Dysregulated expression of dicer and drosha in breast cancer［J］.Pathol Oncol Res，2012，18（2）：343-348.

［16］Pampalakis G，Diamandis EP，Katsaros D，et al.Diamandis downregulation of dicer expression in ovarian cancer tissues［J］．Clin Biochem，2010，43（3）：324－327．

［17］Wu JF，Shen W，Liu NZ，et al.Down-regulation o f Dicer in hepatocellular carcinoma［J］.Med Oncol，2011，28（3）：804-809.

［18］Klase Z，Kale P，Winograd R，et al.HIV-1 TAR element is processed by Dicer to yield a viral micro-RNA involved in chromatin remodeling of the viral LTR［J］.BMC Mol Biol，2007，8（4）：63.

［19］Matskevich AA，Moelling K.Dicer is involved in protection against influenza A virus infection［J］.J Gen Virol，2007，88（Pt10）：2627-2635.

（收稿：2016-03-12修回：2017-02-09）

1杭州市婦產(chǎn)科醫(yī)院病理科（杭州310008）；2杭州市第一人民醫(yī)院病理科（杭州310006）

過華蕾，E-mail：jane__123@163.com