楊蕾 盧錦標(biāo) 都偉欣 王國(guó)治 陳保文

?

·專論·

結(jié)核病診斷中酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)檢測(cè)試劑臨床應(yīng)用的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估與控制

楊蕾 盧錦標(biāo) 都偉欣 王國(guó)治 陳保文

通過(guò)對(duì)可能影響γ干擾素釋放試驗(yàn)(IGRA)的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(ELISPOT)檢測(cè)結(jié)果的受試者、檢測(cè)方法、環(huán)境設(shè)施和儀器等因素的風(fēng)險(xiǎn)識(shí)別與分析，提示ELISPOT檢測(cè)試劑在臨床結(jié)核病診斷應(yīng)用中可能產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)，并提出相應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)控制措施，以降低該類試劑的檢測(cè)風(fēng)險(xiǎn)。

結(jié)核； 干擾素γ； 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)； 危險(xiǎn)性評(píng)估； 質(zhì)量控制

結(jié)核分枝桿菌感染人體后激發(fā)的免疫反應(yīng)以誘導(dǎo)分泌γ干擾素的輔助T淋巴細(xì)胞(TH)1型免疫為主。γ干擾素釋放試驗(yàn)(interferon gamma release assay，IGRA)的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(ELISPOT)試劑以特異性抗原做為刺激源，體外激發(fā)特異性T細(xì)胞分泌γ干擾素，再利用固相ELISPOT 檢測(cè)分泌γ干擾素細(xì)胞的數(shù)量，以此來(lái)判斷是否感染了結(jié)核分枝桿菌。目前，已有大量研究顯示該試劑檢測(cè)活動(dòng)性結(jié)核病有較高的診斷敏感度和特異度[1-3]。與結(jié)核菌素純蛋白衍生物試驗(yàn)(purified protein derivative test，PPD試驗(yàn))皮內(nèi)診斷試劑相比，ELISPOT檢測(cè)結(jié)核感染不受卡介苗接種的影響[4-5]，具有較高的敏感度和特異度，但診斷結(jié)核病的穩(wěn)定性存疑[6]。

筆者對(duì)可能影響臨床檢測(cè)結(jié)果的受試者、檢測(cè)方法、環(huán)境設(shè)施及檢測(cè)儀器等因素進(jìn)行了風(fēng)險(xiǎn)識(shí)別與分析，提示ELISPOT檢測(cè)試劑臨床研究與臨床檢測(cè)時(shí)可能產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)，并提出了相應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)控制措施，為ELISPOT檢測(cè)試劑的臨床應(yīng)用、臨床研究方案的制定、臨床研究過(guò)程的監(jiān)督評(píng)估以及臨床研究結(jié)束后研究結(jié)果的分析提供參考。

一、受試者影響因素風(fēng)險(xiǎn)管理

(一)抗結(jié)核藥物治療及治療時(shí)間對(duì)ELISPOT檢測(cè)結(jié)果的影響與控制

大量文獻(xiàn)報(bào)道，結(jié)核病患者經(jīng)抗結(jié)核藥物治療后特異性斑點(diǎn)數(shù)減少，有些試驗(yàn)結(jié)果顯示檢測(cè)陽(yáng)性率降低。劉紅等[7]報(bào)道：結(jié)核病患者在應(yīng)用抗結(jié)核藥物治療前與治療后[2～4周]分別進(jìn)行結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT.TB)檢測(cè)，治療前抗原A(早期分泌靶抗原6，ESAT-6)和抗原B(培養(yǎng)濾液蛋白10，CFP-10)的特異性斑點(diǎn)平均數(shù)分別為99個(gè)和49個(gè)，治療后平均數(shù)分別為47個(gè)和18個(gè)，治療后斑點(diǎn)數(shù)明顯少于治療前斑點(diǎn)數(shù)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.211，3.383；P值均<0.01)。Park和Tae[8]在韓國(guó)的一項(xiàng)研究顯示，活動(dòng)性結(jié)核病患者經(jīng)一線抗結(jié)核藥物治療前與治療后第1個(gè)周末，以及完成療程后分別進(jìn)行T-SPOT. TB檢測(cè)，結(jié)果表明：33例患者治療前及治療后第1個(gè)周末檢測(cè)有31例呈陽(yáng)性，2例呈陰性；完成療程后，31例檢測(cè)陽(yáng)性患者中有28例呈陽(yáng)性，其中3例陰轉(zhuǎn)，但2例檢測(cè)陰性患者全部轉(zhuǎn)陽(yáng)；另一方面，治療后抗原A(ESAT-6)和抗原B(CFP-10)的特異性斑點(diǎn)平均數(shù)較治療前下降明顯(下降數(shù)量分別為27個(gè)和24個(gè))，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Yan等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，正在接受抗結(jié)核藥物治療的活動(dòng)性結(jié)核病患者的T-SPOT.TB檢測(cè)陽(yáng)性率(65.17%，58/89)明顯低于未接受治療的患者(80.62%，208/258)(P=0.003)；并且，治療的時(shí)間越長(zhǎng)，檢測(cè)陽(yáng)性率也越低(P=0.010)。Li等[10]對(duì)兒童結(jié)核病的研究也有類似的結(jié)果，檢測(cè)抗結(jié)核藥物治療1周以上的患者假陰性率(57.31%)高于治療1周及1周以內(nèi)或未治療組的患者(18.3%)(P=0.035)。這些結(jié)果提示抗結(jié)核藥物治療1周以上會(huì)降低酶聯(lián)反應(yīng)斑點(diǎn)數(shù)，進(jìn)而影響檢測(cè)結(jié)果。

在我國(guó)，ELISPOT試劑已被批準(zhǔn)用于結(jié)核病輔助診斷[11]，而鑒于結(jié)核病患者經(jīng)治療后檢測(cè)斑點(diǎn)數(shù)可能降低，進(jìn)而影響診斷結(jié)果，因此，臨床使用可能僅作為結(jié)核病療效觀察和診斷性治療觀察的指標(biāo)之一[8-9]。但是，在試劑的臨床試驗(yàn)中，若將不同治療時(shí)間的患者均入組為結(jié)核病患者組，極有可能導(dǎo)致檢測(cè)陽(yáng)性率比實(shí)際結(jié)果偏低。

可以應(yīng)對(duì)的風(fēng)險(xiǎn)控制措施：(1)建議在臨床試驗(yàn)時(shí)，選擇初治且還未治療的患者、初治且治療1周內(nèi)的患者(可能不會(huì)干擾診斷結(jié)果，但可能使臨床結(jié)果偏離)、1個(gè)月內(nèi)病原學(xué)檢查陽(yáng)性的患者入組。(2)臨床研究的結(jié)果分析可按不同實(shí)驗(yàn)對(duì)象分級(jí)評(píng)價(jià)試劑敏感度，分別進(jìn)行菌陽(yáng)患者、菌陰患者和結(jié)核病患者(菌陽(yáng)與菌陰)的陽(yáng)性率分析。

(二)菌陽(yáng)、菌陰結(jié)核病患者的比例對(duì)研究結(jié)果的影響與控制

1.ELISPOT試劑對(duì)菌陽(yáng)患者的檢測(cè)效能：本試劑主要用于結(jié)核病輔助診斷，患者中應(yīng)包括菌陽(yáng)與菌陰患者，但ELISPOT試劑對(duì)二者的檢測(cè)敏感度有可能不同。Yan等[9]采用T-SPOT. TB試劑對(duì)涂陽(yáng)、涂陰、培陽(yáng)、培陰患者的檢測(cè)陽(yáng)性率分別為85.71%(84/98)、14.29%(14/98)、73.66%(73/107)、26.34%(34/107)。吳妍等[12]使用T-SPOT.TB試劑檢測(cè)了346例老年肺結(jié)核患者，菌陽(yáng)、菌陰患者檢測(cè)陽(yáng)性率分別為90.32%、72.09%。王新寧等[13]使用T-SPOT.TB試劑和分枝桿菌改良羅氏固體培養(yǎng)法檢測(cè)了214例結(jié)核病患者，其中菌陽(yáng)患者109例、菌陰患者105例，檢測(cè)結(jié)果顯示： ELISPOT檢測(cè)菌陽(yáng)和菌陰患者的陽(yáng)性率分別為89.0%(97/109)、18.1%(19/105)。以上結(jié)果均提示 ELISPOT試劑對(duì)菌陽(yáng)患者的檢測(cè)敏感度較高。

2. ELISPOT試劑的其他臨床應(yīng)用：ELISPOT試劑臨床試驗(yàn)招募的人群理論上應(yīng)盡可能與試劑未來(lái)使用人群相似，但不同級(jí)別的醫(yī)院患者的來(lái)源與背景不同，菌陰菌陽(yáng)患者的比例也不一樣。一般來(lái)說(shuō)，基層醫(yī)院就診的大多數(shù)為初診患者，菌陽(yáng)患者比例較低；大型專科醫(yī)院經(jīng)基層醫(yī)院診斷后再就診的患者較多，菌陽(yáng)患者比例較高；而綜合性醫(yī)院非典型癥狀的結(jié)核病患者和其他疾病需要排除結(jié)核病的患者較多。另外，由于ELISPOT試劑對(duì)不明原因發(fā)熱的患者檢測(cè)陽(yáng)性率較低[14]，對(duì)惡性腫瘤患者檢測(cè)的特異性也較低[5,15]，需特別注意。

可以應(yīng)對(duì)的風(fēng)險(xiǎn)控制措施：(1)考慮到 ELISPOT試劑對(duì)菌陽(yáng)與菌陰患者的檢測(cè)敏感度有可能不同，且病原學(xué)檢測(cè)呈陰性并不能排除結(jié)核分枝桿菌感染，故建議在進(jìn)行臨床總結(jié)分析時(shí)，應(yīng)參考體外診斷制劑的敏感度分析方式，分別計(jì)算菌陽(yáng)患者和菌陰患者的陽(yáng)性率，以及所有結(jié)核病患者的總陽(yáng)性檢出率，分析其在不同人群中的敏感度。(2)不同醫(yī)院結(jié)核病患者菌陽(yáng)與菌陰患者比例不同，各醫(yī)院不宜制定統(tǒng)一比例，建議參考《結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測(cè)試劑注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則》[16]中“涂片陰性的肺結(jié)核患者占所有肺結(jié)核患者的比例應(yīng)不小于50%”的基本要求，在總的研究結(jié)果中應(yīng)有一定比例的菌陰結(jié)核病患者數(shù)量，范圍控制在(45±10) %為宜。

(三)菌陰肺結(jié)核患者對(duì)研究結(jié)果的影響與控制

多數(shù)研究報(bào)告的結(jié)果顯示，ELISPOT試劑對(duì)菌陽(yáng)患者的檢出率高于菌陰患者[2-3,17]；但也存在不同的研究報(bào)告。依據(jù)劉紅等[7]的報(bào)道，該院T-SPOT.TB檢測(cè)確診結(jié)核病患者、菌陰患者的陽(yáng)性率分別為77.8%和87.6%，后者陽(yáng)性率明顯高于前者。李晉等[18]采用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法檢測(cè)無(wú)痰或痰涂片陰性的結(jié)核病患者密切接觸者，陽(yáng)性率為41.9%(18/43)；檢測(cè)痰涂片為“+++”的結(jié)核病患者密切接觸者，陽(yáng)性率為31.5%(23/73)。這兩項(xiàng)研究中ELISPOT檢測(cè)陽(yáng)性率均高于金標(biāo)準(zhǔn)，提示臨床醫(yī)師采用ELISPOT試劑輔助診斷菌陰結(jié)核病時(shí)，有將結(jié)核感染者誤診為結(jié)核病患者的可能。

可以應(yīng)對(duì)的風(fēng)險(xiǎn)控制措施：由于在臨床試驗(yàn)總結(jié)中，常以某種診斷性試劑作為陽(yáng)性對(duì)照，使得陽(yáng)性對(duì)照試劑計(jì)算所得的陽(yáng)性檢出率一般會(huì)高于其他試劑。并且，我國(guó)目前僅批準(zhǔn)ELISPOT試劑用于結(jié)核病輔助診斷。所以，在臨床評(píng)價(jià)時(shí)，不應(yīng)單純以同類試劑作對(duì)照，建議增加其他檢測(cè)方法作為評(píng)價(jià)參考；應(yīng)避免在確診前進(jìn)行試劑盒的評(píng)價(jià)分析，尤其是菌陰結(jié)核病患者。并建議在檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)程序操作(SOP)中，規(guī)定各項(xiàng)檢測(cè)的報(bào)告時(shí)間與報(bào)告方式，以避免檢測(cè)結(jié)果干擾臨床醫(yī)師的判斷，造成誤診和評(píng)價(jià)不準(zhǔn)確。

(四) 免疫抑制劑使用患者對(duì)檢測(cè)結(jié)果的可能影響與控制

研究表明，在IGRA檢測(cè)免疫抑制劑使用患者時(shí)，ELISPOT法受免疫抑制狀態(tài)的影響較小，其檢測(cè)敏感度明顯高于ELISA法，以下研究均可證實(shí)ELISPOT檢測(cè)在免疫抑制劑使用患者的結(jié)核病診斷中有較高的價(jià)值[1，11，19-21]；但在患者機(jī)體處于嚴(yán)重免疫抑制狀態(tài)時(shí)，如人類免疫缺陷病毒(HIV)感染者、慢性免疫介導(dǎo)的炎癥性疾病患者、免疫系統(tǒng)未發(fā)育完全的兒童和器官移植患者等，T細(xì)胞反應(yīng)被嚴(yán)重抑制，ELISPOT檢測(cè)可能會(huì)出現(xiàn)假陰性[2，19-21]。一項(xiàng)Meta分析表明[22]，在中低收入國(guó)家，T-SPOT.TB檢測(cè)嚴(yán)重免疫抑制狀態(tài)的HIV感染者時(shí)陽(yáng)性率明顯降低。祁燕偉等[23]的研究表明，CD4+T淋巴細(xì)胞水平對(duì)T-SPOT.TB陽(yáng)性率有一定影響，在CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)≤50個(gè)/μl的HIV感染者中敏感度降低，且患者在IGRA檢測(cè)前經(jīng)免疫抑制劑治療很可能會(huì)降低其檢測(cè)敏感度[19]。Edwards等[24]的研究發(fā)現(xiàn)，皮質(zhì)類固醇和抗TNF-α治療使得30%的患者檢測(cè)結(jié)果由陽(yáng)轉(zhuǎn)陰，測(cè)得的IFN-γ濃度明顯降低。另一項(xiàng)Meta分析結(jié)果表明[25]，對(duì)免疫抑制劑治療的患者(如類固醇、口服免疫抑制劑和生物治療等)的檢測(cè)，對(duì)ELISPOT結(jié)果有負(fù)面效果。這些研究發(fā)現(xiàn)，免疫抑制劑的存在降低了ELISPOT的陽(yáng)性檢出率，提示ELISPOT在檢測(cè)這類患者時(shí)可能存在風(fēng)險(xiǎn)。

可以應(yīng)對(duì)的風(fēng)險(xiǎn)控制措施：(1)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療可以使HIV感染者的免疫功能得以恢復(fù)，建議HIV感染者ELISPOT檢測(cè)結(jié)果呈陰性時(shí)，可以在抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療后且CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)超過(guò)200個(gè)/μl時(shí)復(fù)查 ELISPOT[21]。(2)對(duì)于擬進(jìn)行器官移植和慢性免疫介導(dǎo)的炎性疾病患者，應(yīng)在免疫抑制劑治療前進(jìn)行ELISPOT檢測(cè)[1,21]。(3)臨床研究時(shí)對(duì)免疫抑制劑使用患者，尤其是5歲以下兒童，可同時(shí)使用皮內(nèi)診斷試劑檢測(cè)[1,11,21]。該建議考慮了兩點(diǎn)：其一是美國(guó)FDA的指南和美國(guó)兒科學(xué)會(huì)均推薦在5歲以下的兒童中優(yōu)先使用TST檢測(cè)，說(shuō)明該試劑檢測(cè)有一定的意義。其二是在臨床總結(jié)中將TST檢測(cè)作為同型對(duì)照實(shí)驗(yàn)，能更直觀的反映ELISPOT的敏感度和特異度，有利于對(duì)檢測(cè)結(jié)果作進(jìn)一步的解釋；并在研究結(jié)果中增加對(duì)免疫抑制劑使用患者的敏感度和特異度的分析，再結(jié)合同型對(duì)照試劑的檢測(cè)結(jié)果和臨床確診結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。

二、實(shí)驗(yàn)方法影響因素的風(fēng)險(xiǎn)管理

1. 細(xì)胞計(jì)數(shù)方式(人工、儀器)的影響：ELISPOT檢測(cè)細(xì)胞計(jì)數(shù)可在細(xì)胞染色后人工計(jì)數(shù)或儀器計(jì)數(shù)。人工計(jì)數(shù)時(shí)，由于顯微鏡觀察的視野為平面而細(xì)胞是立體的，有時(shí)難以確定細(xì)胞狀態(tài)導(dǎo)致計(jì)數(shù)結(jié)果不準(zhǔn)確；當(dāng)細(xì)胞分離狀態(tài)不好有碎片時(shí)，也可能會(huì)影響計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性；若加樣前未充分混勻，細(xì)胞沉積會(huì)導(dǎo)致計(jì)數(shù)結(jié)果偏低，影響檢測(cè)效果。儀器計(jì)數(shù)較人工計(jì)數(shù)相對(duì)準(zhǔn)確，但若細(xì)胞濃度過(guò)高或過(guò)低時(shí)，計(jì)數(shù)結(jié)果準(zhǔn)確性也會(huì)降低；當(dāng)樣本檢測(cè)結(jié)果位于灰區(qū)(細(xì)胞濃度過(guò)高)時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性，而細(xì)胞濃度過(guò)低時(shí)，也可能會(huì)導(dǎo)致假陰性。

2.斑點(diǎn)判讀方式的影響：ELISPOT檢測(cè)斑點(diǎn)數(shù)的判讀方式可分為人工和儀器兩種。人工判讀是使用放大鏡放大圖像，肉眼觀察斑點(diǎn)進(jìn)行判讀。儀器判讀是掃描斑點(diǎn)圖后根據(jù)設(shè)置自動(dòng)判讀，再人工復(fù)核。由于儀器判讀時(shí)放大倍數(shù)較大，斑點(diǎn)圖像更清晰，判讀更準(zhǔn)確，尤其是灰區(qū)樣本，人工判讀和儀器判讀結(jié)果可能會(huì)有偏差。

3.加樣后混勻方式的影響：ELISPOT檢測(cè)加樣操作分別為加入刺激物和淋巴細(xì)胞并將之混合均勻，有幾種操作方式：(1)應(yīng)輕拍或輕晃加樣板，但也有樣本污染的風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致相鄰的樣本混合：(2)用移液槍尖吸打，但槍尖尖銳，反復(fù)吸打可能造成細(xì)胞損傷，降低細(xì)胞活力，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡；(3)使用96孔板恒溫震蕩儀混勻樣液時(shí)需注意轉(zhuǎn)速，轉(zhuǎn)速過(guò)高可能會(huì)造成細(xì)胞損傷。

可以應(yīng)對(duì)的風(fēng)險(xiǎn)控制措施：(1)建議在檢測(cè)開展前，尤其是大規(guī)模的臨床研究，應(yīng)提前進(jìn)行實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化，在SOP中需限定采用同品牌同型號(hào)儀器，并設(shè)定同一參數(shù)檢測(cè)。(2)若無(wú)細(xì)胞計(jì)數(shù)或斑點(diǎn)計(jì)數(shù)儀器，可采用雙人獨(dú)立完成再對(duì)比復(fù)核的方式計(jì)數(shù)。

三、環(huán)境設(shè)施和儀器等影響因素的風(fēng)險(xiǎn)管理

1.ELISPOT試劑的儲(chǔ)存與運(yùn)輸：ELISPOT試劑需要低溫存放。若試劑在儲(chǔ)存和運(yùn)輸過(guò)程中，冰箱或冷鏈車輛的制冷裝置出現(xiàn)故障，環(huán)境溫度過(guò)高可造成試劑長(zhǎng)時(shí)間暴露在高溫中，或溫度過(guò)低導(dǎo)致試劑凍結(jié)，或試劑取出后放置室溫時(shí)間過(guò)長(zhǎng)等，這些非正常因素均可能影響試劑的檢測(cè)結(jié)果。

可以應(yīng)對(duì)的風(fēng)險(xiǎn)控制措施：(1)試劑儲(chǔ)放冰箱和冷鏈車輛宜有自動(dòng)記錄與自動(dòng)報(bào)警裝置，運(yùn)輸時(shí)應(yīng)備有應(yīng)急車輛；(2)應(yīng)制定儀器或裝置的故障應(yīng)急程序，該程序應(yīng)明確在何種情況下試劑不再使用或經(jīng)何種驗(yàn)證后方可恢復(fù)使用；(3)操作SOP時(shí)，應(yīng)明確試劑取出后在室溫下操作的時(shí)長(zhǎng)，在實(shí)驗(yàn)原始記錄中應(yīng)能體現(xiàn)，以便在結(jié)果異常時(shí)可溯源分析。

2.其他因素的風(fēng)險(xiǎn)管理：(1)ELISPOT檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞的提取和培養(yǎng)均需潔凈環(huán)境，若超凈工作臺(tái)、CO2培養(yǎng)箱或潔凈室清潔度不夠，可能導(dǎo)致污染的發(fā)生，影響檢測(cè)結(jié)果。(2)若在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，CO2培養(yǎng)箱發(fā)生故障致溫度異常，或CO2氣體耗盡但又無(wú)法補(bǔ)充，均可能導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)異常，影響檢測(cè)結(jié)果。(3)ELISPOT試劑檢測(cè)時(shí)還需試驗(yàn)人員自備淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll)。它是分離外周血淋巴細(xì)胞的關(guān)鍵試劑，若質(zhì)量好則細(xì)胞回收率高，質(zhì)量不好則細(xì)胞回收率低，可能會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的可靠性[5]。

可以應(yīng)對(duì)的風(fēng)險(xiǎn)控制措施：(1)承擔(dān)臨床試驗(yàn)和臨床檢測(cè)的操作人員應(yīng)進(jìn)行專門的實(shí)驗(yàn)和儀器操作規(guī)范培訓(xùn)；實(shí)驗(yàn)操作、儀器維護(hù)和人員進(jìn)出均嚴(yán)格按照細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)范進(jìn)行。(2)在開展臨床試驗(yàn)前應(yīng)對(duì)潔凈室和儀器進(jìn)行維護(hù)保養(yǎng)和清潔處理，確認(rèn)潔凈室和儀器處于正常狀態(tài)。(3)試劑采購(gòu)前經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)性能應(yīng)符合規(guī)定，采購(gòu)后均按規(guī)定放置，且需注意有效期。(4)CO2培養(yǎng)箱宜有自動(dòng)記錄與自動(dòng)報(bào)警裝置，在資金允許的情況下最好購(gòu)置備用儀器以應(yīng)對(duì)緊急情況。

四、小結(jié)

受試者的病原學(xué)狀態(tài)，抗結(jié)核藥物治療進(jìn)程和是否使用免疫抑制劑等是ELISPOT試劑使用的關(guān)鍵性風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)。環(huán)境設(shè)施、儀器耗材和檢測(cè)方法涉及到試劑的儲(chǔ)存運(yùn)輸、實(shí)驗(yàn)操作和質(zhì)量控制，也可能影響到ELISPOT試劑的檢測(cè)結(jié)果。臨床檢測(cè)和臨床研究時(shí)，應(yīng)針對(duì)這些風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)，采取相應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)控制措施，保證結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。

[1] Mazurek GH, Jereb J, Vernon A,et al. Updated guidelines for using interferon gamma release assays to detectMycobacteriumtuberculosisinfection-United States, 2010.MMWR Recomm Rep， 2010，59(RR-5):1-25.

[2] 章淑夢(mèng),周華,符一騏,等.γ干擾素釋放試驗(yàn)在活動(dòng)性結(jié)核病診斷中的臨床價(jià)值.中華結(jié)核和呼吸雜志，2014,37(5):372-373.

[3] Dai Y, Feng Y, Xu R, et al. Evaluation of interferon-gamma release assays for the diagnosis of tuberculosis: an updated meta-analysis. Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2012，31(11):3127-3137.

[4] 白雪娟,梁艷,陽(yáng)幼榮,等.卡介苗接種對(duì)酶聯(lián)免疫半點(diǎn)試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染的影響.中國(guó)防癆雜志，2015，37(7):753-756.

[5] 吳雪瓊,梁艷,王國(guó)治. γ干擾素釋放試驗(yàn)臨床應(yīng)用的價(jià)值、問(wèn)題與展望.中國(guó)防癆雜志,2015,37(7):722-727.

[6] Lu P, Chen X, Zhu LM, et al.Interferon-gamma release assays for the diagnosis of tuberculosis: a systematic review and meta-analysis. Lung, 2016,(194):447-458.

[7] 劉紅,黃永杰,王靜,等.結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)在疑似結(jié)核病患者診斷中的價(jià)值研究.中華結(jié)核和呼吸雜志,2014,37(3): 192-196.

[8] Park IN, Tae Sun Shim TS. Qualitative and quantitative results of interferon-γ release assays for monitoring the response to anti-tuberculosis treatment. Korean J Intern Med, 2017, 32(2): 302-308.

[9] Yan L,Xiao H,Han M, et al.Diagnostic value of T-SPOT.TB interferon-γ relsase assays for active tuberculosis. Exp Ther Med,2015,10(1): 345-351.

[10] Li T,Bao L,Diao N, et al. Influencial factors of the perfor-mance of interferon-γ releaseassays in the diagnosis of childhood tuberculosis.Clin Exp Med, 2015, 15(3):303-309.

[11] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)核病學(xué)分會(huì),《中華結(jié)核和呼吸雜志》編輯委員會(huì). γ-干擾素釋放試驗(yàn)在中國(guó)應(yīng)用的建議.中華結(jié)核和呼吸雜志, 2014, 37(10): 744-747.

[12] 吳妍,李琦,張宗德.γ-干擾素釋放試驗(yàn)對(duì)老年肺結(jié)核的輔助診斷價(jià)值.中國(guó)防癆雜志, 2016,38(2):122-128.

[13] 王新寧,施旭東,劉根焰,等.斑點(diǎn)技術(shù)和分枝桿菌改良羅氏固體培養(yǎng)法在肺結(jié)核輔助診斷中的價(jià)值.臨床檢驗(yàn)雜志, 2015, 33(12):898-899.

[14] Shi X,Zhang L,Zhang Y, et al. Utility of T-cell interferon-γ release assays for etiological diagnosis of classic fever of unknown origin in a high tuberculosis endemic area--a pilot prospective cohort. PLoS One, 2016,11(1): e0146879.

[15] 黃毅,黨麗云,郭琪，等.全血γ-干擾素釋放試驗(yàn)對(duì)結(jié)核病與惡性腫瘤患者檢測(cè)結(jié)果的比較研究.中國(guó)防癆雜志, 2015,37(7):774-777.

[16] 國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局.結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測(cè)試劑注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則(2015年第65號(hào))(2015-09-21)[2017-03-02]. http://www.sfda.gov.cn/WS01/CL0087/130520.html.

[17] Cai R, Chen J, Guan L, et al. Relationship between T-SPOT.TB responses and numbers of circulating CD4+T-cells in HIV infected patients with active tuberculosis. BioSci Trends, 2014, 8(3):163-168.

[18] 李晉,楊倩婷，岳建榮，等.γ干擾素釋放試驗(yàn)與結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)在肺結(jié)核患者密切接觸者隨訪中的應(yīng)用比較.中國(guó)防癆雜志, 2015,37(7):748-752.

[19] Santin M, Garcia-Garcia JM. Executive summary of the guidelines for the use of interferon-γ release assays in the diagnosis of tuberculosis infection. Enferm Infecc Microbiol Clin, 2016, 34 (5):304-308.

[20] Smith RA，Cattamanchi A,Steingart KR, et al.Interferon-γ release assays for diagnosis of latent tuberculosis infection: evidence in immune-mediated inflammatory disorders. Curr Opin Rheumatol, 2011, 23 (4): 377-384.

[21] 李鋒,盧水華.γ干擾素釋放試驗(yàn)在兒童結(jié)核病和潛伏結(jié)核感染中的診斷價(jià)值.中國(guó)防癆雜志,2015,37(7):732-735.

[22] Cattamanchi A, Smith R, Steingart KR, et al. Interferon-gamma release assays for the diagnosis of latent tuberculosis infection in HIV-Infected individuals: a systematic review and Meta-analysis. J Acquir Immune Defic Syndr,2011,56(3):230-238.

[23] 祁燕偉,白勁松,萬(wàn)榮，等.T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)在人類免疫缺陷病毒合并肺結(jié)核感染中不同T細(xì)胞水平臨床診斷價(jià)值.昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2011,(9):63-67.

[24] Edwards A, Gao Y, Allan RN, et al.Corticosteroids and infliximab impair the performance of interferon-gamma release assays used for diagnosis of latent tuberculosis.Thorax, 2017，pii: thoraxjnl-2016-209397.

[25] Wong SH, Gao Q, Tsoi KK, et al. Effect of immunosuppressive therapy on interferon γ releaseassay for latent tuberculosis screening in patients with autoimmune diseases: a systematic review and meta-analysis. Thorax, 2016,71(1):64-72.

(本文編輯：孟莉 薛愛(ài)華)

Risk assessment and control of interferon-γ release enzyme-linked immunospot assay in its clinical applications for TB detection

YANGLei,LUJin-biao,DUWei-xin,WANGGuo-zhi,CHENBao-wen.

DivisionofTnberculosisVaccins,NationalInstitutesforFoodandDrugControl,Beijing100050,China

CHENBao-wen,Email:bwchen@126.com

In order to reduce the risk of the interferon-γ enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay when it is used for detection of patients with tuberculosis (TB) in clinical trial or clinical diagnosis, we did a risk assessment through risk identification and analysis to the factors that may affect the test results, such as the subjects who received ELISPOT test, the test methods, environmental facilities and instruments, etc. and then we put forward the corresponding risk control measures.

Tuberculosis; Interferon-gamma; Enzyme-linked immunospot assay; Risk assessment; Quality control

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.08.020

100050 北京，中國(guó)食品藥品檢定研究院結(jié)核病疫苗室

陳保文，Email：bwchen@126.com

2017-03-03)