解凌楠，王鑫雷，王麗艷，金雷，張文勁，荊瑞勇，劉永春

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319）

大慶濕地水體中可培養(yǎng)藍(lán)藻的分布及其形態(tài)鑒定

解凌楠，王鑫雷，王麗艷，金雷，張文勁，荊瑞勇，劉永春

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319）

通過限制性培養(yǎng)技術(shù)富集大慶濕地水樣中的可培養(yǎng)藍(lán)藻，采用顯微鏡觀察法對可培養(yǎng)藍(lán)藻進(jìn)行觀察及鑒定。結(jié)果表明，大慶濕地可培養(yǎng)藍(lán)藻含單細(xì)胞藍(lán)藻和絲狀藍(lán)藻，在不同類型濕地中不同時期的水樣中可培養(yǎng)藍(lán)藻的類群是不同的。經(jīng)顯微鏡觀察初步鑒定，大慶濕地水體中可培養(yǎng)藍(lán)藻菌株主要分布在4個目，即色球藻目（Chroococcales）、膠須藻目（Rivulariales）、顫藻目（Oscillatoriales）和念珠藻目（Nostocales），8個屬，即聚球藻屬（Synechococcus）、集胞藻屬（Synechocystis）、眉藻屬（Calothrix），鞘絲藻屬（Lyngbya）、束藻屬（Symploca）、微鞘藻屬（Microcoleus）、席藻屬（Phormidium）和魚腥藻屬（Anabaena）和1個類群，即藍(lán)綠藻類群（Gloeocapsa group）。

可培養(yǎng)藍(lán)藻；富集；顯微觀察；大慶濕地；分布

藍(lán)藻，亦稱藍(lán)細(xì)菌，是一類光能自養(yǎng)型細(xì)菌，在生物圈中廣泛存在。藍(lán)藻被廣泛應(yīng)用于固氮生物肥的研制[1]、環(huán)境污染的修復(fù)[2]、功能菌株的開發(fā)[3]、共生固氮機(jī)制的探索[4-5]及保健食品的研發(fā)等方面，藍(lán)藻也存在有害的一面，大量藍(lán)藻的爆發(fā)可引起海洋赤潮、湖泊水華現(xiàn)象，引起環(huán)境二次污染。因此，調(diào)查環(huán)境中藍(lán)藻的分布情況具有重要意義[6-8]。環(huán)境中藍(lán)藻的分布調(diào)查主要采用兩種方法，其一形態(tài)觀察法；其二為分子生物學(xué)方法。形態(tài)觀察法是常用的一種鑒定方法，可對不同環(huán)境中藍(lán)藻種類的分布特征進(jìn)行描述[6-11]；分子生物學(xué)方法可相對精確地估計環(huán)境中藍(lán)藻的種類。

大慶濕地位于我國松嫩平原中部，位置為123° 45′～125°47′E，45°23′～47°28′N。濕地面積達(dá)60萬公頃，濕地類型多樣，魚類、植物、浮游生物多樣、豐富[12]。大慶濕地作為我國內(nèi)陸堿性濕地，水體中藍(lán)藻的分布情況鮮有報道。藍(lán)藻分離純化方法較費時[6-7]，分子生物學(xué)方法相對投入較大[10]。因此，研究采用液體連續(xù)富集大慶濕地藍(lán)藻菌株，采用顯微鏡觀察法[9]，初步估計大慶濕地可培養(yǎng)藍(lán)藻的分布特征，為開發(fā)新的菌種資源提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試水體于2014年5月1日或2日、6月12日分別采集于大慶濕地水樣，包括萬寶湖（N46°35′，E125°05′）、扎龍濕地（N47°18′，E124°25′）、扎龍?zhí)J葦塘（N47°18′，E124°26′）、龍鳳濕地（N46°32′，E125° 11′）、林甸稻田（N47°18′，E124°37′）（6月20日取樣）、黎明湖（N46°35′，E125°07′）等地。采樣時取水表下層5 cm處水體（稻田水樣采集于表面），采用7點采樣混合法，用塑料瓶進(jìn)行收集后置于放冰袋的采樣箱中，于6 h內(nèi)送至實驗室，4℃冰箱保藏。

1.2 試驗設(shè)計

將2014年不同時期采集的水樣5 mL，接種于裝有45 mL已滅菌的選擇性BG-11[11]（放線菌酮100 mg·mL-1）液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于25℃，2 000 lx的光照強度下靜置培養(yǎng)。將大慶濕地不同水樣中富集的藍(lán)藻連續(xù)傳代4～5次，以富集可培養(yǎng)藍(lán)藻類群，逐步淘汰環(huán)境中不可培養(yǎng)的藍(lán)藻類群。每傳一代接種三瓶，以上一代三瓶培養(yǎng)物的混合物為接種物，接種量均為10%（v/v）。當(dāng)不同水樣中藍(lán)藻傳至第5代時，將每一水樣經(jīng)富集的培養(yǎng)混合物取5次進(jìn)行顯微鏡觀察，去同存異。

1.3 觀察和鑒定

取每樣點富集后培養(yǎng)物混合物10 μL于載玻片上，用槍頭均勻分散可培養(yǎng)藍(lán)藻菌絲，蓋上蓋玻片，用Olympus顯微鏡40倍物鏡或100倍油鏡進(jìn)行觀察，以測微尺測定細(xì)胞大小。根據(jù)藍(lán)藻的個體形態(tài)、群體形態(tài)、培養(yǎng)特征、細(xì)胞大小等特征對照藻類分類圖譜進(jìn)行分類鑒定，以《中國淡水藻志》第九卷藍(lán)藻門[10]及Waterbury的《藍(lán)藻分離純化鑒定》[11]為主要參考依據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大慶濕地水體中可培養(yǎng)藍(lán)藻的分布及群落的描述

大慶濕地類型多樣，包括天然濕地和人工濕地兩種類型，研究共采樣為6個采樣地點，包括天然濕地的扎龍?zhí)J葦塘（ZLT），扎龍濕地（ZLW）、和龍鳳濕地（LFW），人工濕地的萬寶湖（LWB）和黎明湖（LLM）及林甸稻田（LDP）。通過選擇性BG-11液體培養(yǎng)基富集可培養(yǎng)藍(lán)藻類群5代后顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，大慶濕地水體中以絲狀藍(lán)藻為主，也存在著球狀藍(lán)藻。

圖1可見，在供試樣品中，可培養(yǎng)的球狀藍(lán)藻主要分布扎龍濕地、萬寶湖及扎龍?zhí)J葦塘水體中。根據(jù)形狀、大小、有無異形胞及細(xì)胞分裂情況等形態(tài)特征，參考Waterbury的《藍(lán)藻分離純化與鑒定》，ZLW、LWB和ZLT供試樣品中分布的可培養(yǎng)單細(xì)胞藍(lán)藻初步鑒定分別歸屬于藍(lán)綠藻類群（Gloeocapsa group）、聚球藻（Synechococcus）和集胞藻屬（Synechocystis）（見表1）。

對絲狀藍(lán)藻主要參考朱浩然的《中國淡水藻志》第九卷藍(lán)藻門進(jìn)行初步鑒定[10]，其形態(tài)學(xué)特征見圖1、表1，可培養(yǎng)絲狀藍(lán)藻歸屬于3個目，即膠須藻目（Rivulariales）、顫藻目（Oscillatoriales）和念珠藻目（Nostocales），6個屬，即眉藻屬（Calothrix），鞘絲藻屬（Lyngbya）、束藻屬（Symploca）、微鞘藻屬（Microcoleus）、席藻屬（Phormidium）和魚腥藻屬（Anabaena）。

從顯微觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在人工濕地中發(fā)現(xiàn)單細(xì)胞藍(lán)藻聚球藻屬（Synechococcus）類群，絲狀藍(lán)藻眉藻屬（Calothrix）、鞘絲藻屬（Lyngbya）類群，而天然濕地中也發(fā)現(xiàn)單細(xì)胞藍(lán)藻集胞藻（Synechocystis）類群、藍(lán)綠藻類群（Gloeocapsa group），絲狀藍(lán)藻鞘絲藻屬（Lyngbya）、束藻屬（Symploca）、微鞘藻屬（Microcoleus）、席藻屬（Phormidium）和魚腥藻屬（Anabaena）類群，天然濕地和人工濕地中可培養(yǎng)藍(lán)藻類群的分布未發(fā)現(xiàn)明顯規(guī)律。

2.2 大慶濕地水體中可培養(yǎng)藍(lán)藻的群落變化規(guī)律

研究對大慶濕地除黎明湖和林甸稻田外的其余4個樣點兩個時期藍(lán)藻類群均進(jìn)行了成功地富集培養(yǎng)。由表1可見，萬寶湖、扎龍?zhí)J葦塘、扎龍濕地及龍鳳濕地水體中在兩次采樣期間（40 d）可培養(yǎng)藍(lán)藻有不同程度的群落演替。萬寶湖水體中由聚球藻（Synechococcus）為主導(dǎo)的可培養(yǎng)藍(lán)藻逐漸演替為鞘絲藻屬（Lyngbya）為主導(dǎo)的藍(lán)藻類群；扎龍?zhí)了w中存在著大量球狀可培養(yǎng)集胞藻（Synechocystis）逐漸演替為束藻屬（Symploca）和微鞘藻屬（Microcoleus）的可培養(yǎng)藍(lán)藻類群。隨著外界環(huán)境的變化藍(lán)藻類群會發(fā)生群落演替。

圖1 大慶濕地不同水樣中可培養(yǎng)藍(lán)藻的形態(tài)顯微照片F(xiàn)ig.1 Morphological micrograph of cultivable cyanobacteria from different water samples in Daqing wetland

表1 大慶濕地不同水樣中部分可培養(yǎng)藍(lán)藻形態(tài)指標(biāo)測定Table 1 Morphological index detection of cyanobacteria in different water samples of Daqing wetland

3 結(jié)論與討論

藍(lán)藻菌種的分離鑒定方法及多樣性調(diào)查有顯微觀察法及分子生物學(xué)方法[10,13]。藍(lán)藻采用顯微鏡法檢測時僅對形態(tài)學(xué)特征及生理特征進(jìn)行描述[11]，相對于分子生物學(xué)方法相對直觀，而分子生物學(xué)方法基本上基于藍(lán)藻的DNA進(jìn)行監(jiān)測[13-14]，各具特點。藍(lán)藻的分離純化工作相對費時[5-7]，采用富集顯微觀察又可直觀地觀察藍(lán)藻的形態(tài)特征。通過富集大慶濕地水樣中可培養(yǎng)藍(lán)藻類群，采用顯微形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)大慶濕地水體中存在著單細(xì)胞藍(lán)藻和絲狀藍(lán)藻，這是首次采用顯微鏡觀察并初步鑒定了大慶濕地藍(lán)藻類群的特點，同時發(fā)現(xiàn)在不同水樣中存在著不同的類群，且在同一地點水樣不同時期藍(lán)藻的主要類群不同，為可培養(yǎng)藍(lán)藻形態(tài)學(xué)鑒定提供數(shù)據(jù)支持。

單細(xì)胞藍(lán)藻廣泛存在于環(huán)境中，據(jù)報道海洋中藍(lán)藻主要以單細(xì)胞藍(lán)藻為主，如原綠球藻（Prochlorococcus）和聚球藻（Synechococcus）[15]。而在淡水水體中主要以絲狀藍(lán)藻為主，尤其在稻田中主要以絲狀藍(lán)藻為主[13]。在觀察藍(lán)藻形態(tài)特征時，發(fā)現(xiàn)按以前的報道藍(lán)藻的菌絲寬度均較大，約為5～9 μm，但采用油鏡觀察所測定的菌絲的寬度均較小，可能在大慶濕地存在著新的藍(lán)藻類群。此外，在藍(lán)藻鑒定時，應(yīng)采用分離培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)更加準(zhǔn)確地描述藍(lán)藻歸屬。目前為止，關(guān)于藍(lán)藻的形態(tài)學(xué)鑒定相關(guān)資料相對較少，為拓展藍(lán)藻的形態(tài)學(xué)鑒定方法提供數(shù)據(jù)支持。

綜上所述，研究從大慶濕地6個樣點兩個時期采集水樣，采用BG-11選擇性培養(yǎng)基富集可培養(yǎng)藍(lán)藻類群，通過顯微鏡觀察方法，首次發(fā)現(xiàn)大慶濕地存在著單細(xì)胞藍(lán)藻，初步鑒定為色球藻目（Chroococcales）的聚球藻（Synechococcus）、集胞藻（Synechocystis）及藍(lán)綠藻類群（Gloeocapsa group）。供試大慶濕地水體中主要以絲狀藍(lán)藻為主，分布在膠須藻目（Rivulariales）的眉藻屬（Calothrix）、顫藻目（Oscillatoriales）的鞘絲藻屬（Lyngbya）、束藻屬（Symploca）、微鞘藻屬（Microcoleus）和席藻屬（Phormidium）以及念珠藻目的魚腥藻屬（Anabaena）。供試大慶濕地水樣中不同時期，藍(lán)藻的類群將發(fā)生群落演替。通過顯微鏡觀察可直觀清晰地了解大慶濕地不同樣點在不同時期藍(lán)藻類群的變化，為藍(lán)藻的鑒定及菌種資源的開發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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Distribution and Identification of Cultivable Cyanobacteria from Water Sample in Daqing Wetland

Xie Lingnan，Wang Xinlei，Wang Liyan，Jin Lei，Zhang Wenjin，Jing Ruiyong，Liu Yongchun
（College of life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

Cultivable Cyanobacteria was enriched by limited-culture technology，the cultivable cyanobacteria in Daqing wetland was observed and identified by microscope.The results showed that there were unicellular and filamentous cultivable cyanobacteria in Daqing wetland，cultivable cyanobacterial species were different in different type wetlands at different sample stages.By the identification of microscopic observation，the observed cyanobacteria were distributed into 4 orders of chroococcales，Rivulariales，Oscillatoriales and Nostocales，8 genus of Synechococcus，Synechocystis，Calothrix，Lyngbya，Symploca，Microcoleus，Phormidium，Anabaena and Gloeocapsa group.

Cynaobacteria；enrichment；microscopic observation；Daqing wetland；distribution

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.05.015

Q938.2

A

1002-2090（2016）05-0077-04

2015-12-18

大學(xué)生創(chuàng)新項目（xc2014061，201410223024）；校博士啟動基金（XDB2014-13）；國家自然科學(xué)基金項目（31300425）。

解凌楠（1994-），女，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院制藥工程專業(yè)2012級本科生。

王麗艷，女，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：laosan1@126.com。