萬貝貝，胡樂農(nóng)，徐紅偉

（浙江省麗水市中心醫(yī)院，浙江麗水323000）

鼻息肉組織核因子-κB和白細(xì)胞介素4的表達(dá)及意義

萬貝貝，胡樂農(nóng)，徐紅偉

（浙江省麗水市中心醫(yī)院，浙江麗水323000）

目的探討核因子-κB（NF-κB）和白細(xì)胞介素4（IL-4）mRNA在鼻息肉組織中的表達(dá)及意義。方法選取90例術(shù)后病檢確診為鼻息肉患者鼻腔新生物（不分側(cè)別）作實(shí)驗(yàn)組，同期取80例因單純鼻中隔偏曲而行下鼻甲部分切除的患者的下鼻甲組織（不分側(cè)別）作為對照組。采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）結(jié)合半定量分析方法檢測，比較兩組NF-κB、IL-4的表達(dá)水平。結(jié)果NF-κB和IL-4在實(shí)驗(yàn)組表達(dá)水平高于對照組（P<0.05）。結(jié)論NF-κB和IL-4 mRNA表達(dá)水平與炎癥相關(guān)，可能與鼻息肉的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。

核因子-κB；白細(xì)胞介素4；鼻息肉

鼻息肉作為耳鼻喉科的常見病、多發(fā)病，會嚴(yán)重影響患者的鼻腔通氣功能，致使患者生活質(zhì)量嚴(yán)重下降。然而時(shí)至今日，國內(nèi)外對于鼻息肉的確切發(fā)病機(jī)制仍不明確，多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為其是多因素、多種基因、多信號途徑參與的共同結(jié)果。鼻息肉組織的病理切片中以炎癥改變?yōu)橹?，表現(xiàn)為上皮增生、細(xì)胞間質(zhì)的高度水腫以及毛細(xì)血管增生等形態(tài)特征。核因子-κB（nuclear factor-κb，NF-κB）是一個(gè)近年來新發(fā)現(xiàn)的炎癥信號誘導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，國外最新研究發(fā)現(xiàn)鼻息肉上皮細(xì)胞中NF-κB的活性表達(dá)明顯升高，而同時(shí)國內(nèi)多位學(xué)者采用免疫組織化學(xué)方法研究也證實(shí)鼻息肉中NF-κB在鼻息肉組織的炎癥細(xì)胞、上皮細(xì)胞、部分腺體及血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞核及細(xì)胞漿內(nèi)均表現(xiàn)為高表達(dá)，表明NF-κB在鼻息肉組織中過度活化，細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，可能導(dǎo)致大量細(xì)胞因子的生成[1]，在鼻息肉的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。白細(xì)胞介素4（lnterleukin 4，IL-4）作為Th2的自分泌細(xì)胞因子，是免疫系統(tǒng)中作用最強(qiáng)、范圍最廣的細(xì)胞因子，既能調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫，又能調(diào)節(jié)體液免疫。它對Th2細(xì)胞的生長發(fā)育分化起著關(guān)鍵性作用，可使Th0直接轉(zhuǎn)變?yōu)門h2，增強(qiáng)細(xì)胞免疫作用，在免疫細(xì)胞之間發(fā)揮多重免疫調(diào)節(jié)作用。有國內(nèi)學(xué)者用免疫組織化學(xué)方法發(fā)現(xiàn)鼻息肉中IL-4的表達(dá)明顯增高，同時(shí)亦有研究發(fā)現(xiàn)鼻息肉中IL-4的表達(dá)不穩(wěn)定，在鼻息肉組織和正常鼻腔黏膜組織中表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[2]。而SOYKA[3]研究發(fā)現(xiàn)，IL-4會導(dǎo)致正常鼻腔黏膜上皮屏障的缺陷，可能與鼻息肉的發(fā)病有關(guān)聯(lián)。本次研究希望通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)進(jìn)一步探討NF-κB和IL-4 mRNA在鼻息肉組織中的表達(dá)及其對于未來鼻息肉臨床治療中可能發(fā)揮的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本選取2015年9月-2016年1月在麗水市中心醫(yī)院行鼻息肉摘除術(shù)的90例鼻息肉患者的鼻息肉組織（術(shù)后病檢為鼻息肉）作研究對象（實(shí)驗(yàn)組）。其中，男性51例，女性39例；年齡30～50歲。同期取80例患者因單純鼻中隔偏曲需切除鼻甲組織作為對照組。其中，男性42例，女性38例；年齡33～54歲。所有患者術(shù)前至少停止使用抗生素類或激素類藥物治療4周以上。

1.1.2 主要試劑及設(shè)備PCR反應(yīng)儀（德國Biometra公司），Trizol RNA試劑（美國Invitrogen公司），凝膠成像分析儀（美國Beckman公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Invitrogen公司）。引物合成交由上海捷瑞生物工程有限公司完成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取總RNA法標(biāo)本采集后裝入無菌凍存管內(nèi)，標(biāo)記后將其放入-80℃冰箱冷凍保存。標(biāo)本統(tǒng)一稱量，每100mg鼻息肉組織加入1ml RNA分離液提取標(biāo)本RNA，利用紫外分光光度計(jì)檢測提取的RNA純度。RNA的純度可以通過計(jì)算測定260 nm/ 280 nm的紫外吸收值來評定。RNA純度測定值需在1.9～2.0，這樣的RNA可以用來進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄RT體系配置及PCR反應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄（Real-time RT polymerase chain，RT）反應(yīng)體系20μl由標(biāo)本總RNA 8μl，隨機(jī)引物2μl，5×逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液4μl，逆轉(zhuǎn)錄酶1μl，RNA酶抑制劑0.5μl，0.1mol/L二硫蘇糖醇溶液1μl，脫氧核糖核苷三磷酸2μl，無RNA酶的雙蒸水1.5μl混合配置而成。PCR反應(yīng)體系20μl由正反向引物各1μl，Taq PCR mastermix 10μl，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 1.5μl，雙蒸水6.5μl配置而成。本實(shí)驗(yàn)中共有3對引物序列，NF-κB的引物序列正向：5'-CTTTTCGACTAC GCGGTGA-3'，反向：5'-GGCAGCTAGGTGCAAAAC A-3'，擴(kuò)增片段長度為390 bp。IL-4的引物序列正向：5'-CAGTTCTACAGCCACCATGAGA-3'，反向：5'-CATGATCGTCTTTAGCCTTTCC-3'，擴(kuò)增片段長度為188 bp。β-actin看家基因的引物序列正向：5'-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3'，反向：5'-TCCCT CTCAGCTGTGGTGGTGAA-3'，擴(kuò)增片段長度為590 bp。NF-κB的PCR反應(yīng)程序設(shè)定為95℃預(yù)變性5min，然后按下列設(shè)定程序進(jìn)行循環(huán)：94℃加熱15 s，59℃退火40 s，72℃延伸45 s，34個(gè)循環(huán)后于72℃再延伸10min。IL-4的PCR反應(yīng)程序設(shè)定為95℃預(yù)變性5min，然后按下列設(shè)定程序進(jìn)行循環(huán)：先94℃進(jìn)行加熱15 s，然后設(shè)定63℃退火30 s，之后72℃延伸45 s，反復(fù)進(jìn)行35個(gè)循環(huán)后再于72℃延伸10min后結(jié)束反應(yīng)。

1.2.3 檢測方法采用RT-PCR反應(yīng)將提取的標(biāo)本RNA在一定反應(yīng)條件下逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。RTPCR反應(yīng)按照說明書進(jìn)行操作。PCR反應(yīng)后，取9 μlMarker及9μl產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上持續(xù)電泳30min，分離PCR產(chǎn)物，凝膠成像儀上可清晰看見目的基因及看家基因的DNA擴(kuò)增片段條帶。NF-κB的擴(kuò)增片段條帶位于390 bp、IL-4的擴(kuò)增片段條帶位于188 bp、看家基因β-actin的擴(kuò)增片段條帶位于590 bp。用儀器自帶分析軟件以NF-κB擴(kuò)增條帶吸收度值（DNF-κB）與內(nèi)對照β-actin擴(kuò)增條帶吸收度值（Dact）的比值（DNF-κB/Dact）為NF-κB mRNA的表達(dá)水平，同樣以DIL-4/Dact為IL-4的mRNA的表達(dá)水平。逐個(gè)計(jì)算標(biāo)本的光密度比值后，對NF-κB、IL-4的相對表達(dá)水平進(jìn)行半定量數(shù)值統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組資料間的均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

RNA瓊脂糖電泳顯示，28 s rRNA和18 s rRNA條帶明亮清晰，且第1條帶（28 s）亮度為第2條（18 s）亮度的大約2倍，顯示提取的標(biāo)本mRNA質(zhì)量較好，可以繼續(xù)進(jìn)行后面的實(shí)驗(yàn)（見圖1）。實(shí)驗(yàn)組及對照組NF-κB、IL-4的mRNA均可見表達(dá)，且其在實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)量高于其在對照組中的表達(dá)（P<0.05），見圖2、3和附表。

圖1 總RNA電泳鑒定圖

圖2 NF-κB的RT-PCR電泳圖

圖3 IL-4的RT-PCR電泳圖

附表 實(shí)驗(yàn)組與對照組NF-κB、IL-4的m RNA表達(dá)量（±s）

附表 實(shí)驗(yàn)組與對照組NF-κB、IL-4的m RNA表達(dá)量（±s）

組別NF-κB IL-4實(shí)驗(yàn)組（n=90）1.093±0.263 0.852±0.238對照組（n=80）0.635±0.149 0.546±0.123t值10.027 7.476P值0.007 0.003

3 討論

本研究采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR反應(yīng)）方法從基因水平來檢測NF-κB和IL-4的表達(dá)，更加準(zhǔn)確地表明，NF-κB和IL-4在實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)均高于對照組，其在鼻息肉的病理生理過程中可能發(fā)揮著極其重要的作用。

NF-κB是近年來發(fā)現(xiàn)的一組具有多種生物學(xué)效應(yīng)的炎性轉(zhuǎn)錄因子，人類最初發(fā)現(xiàn)其可以調(diào)控B免疫球蛋白的k輕鏈而將其命名為NF-κB。研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB多以同源或異源二聚體P65和P50的形式與抑制蛋白家族成員形成復(fù)合體存在于人體組織細(xì)胞中。從近幾年的研究來看，NF-κB在許多領(lǐng)域倍受關(guān)注，其在機(jī)體的免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、應(yīng)激誘導(dǎo)反應(yīng)、細(xì)胞的增殖與凋亡中都發(fā)揮著極其重要的作用[4]。NF-κB經(jīng)典途徑活化后基因主要編碼MCP-1、IL-8等趨化因子，IL-4、IL-5、粒細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）等炎癥細(xì)胞因子，其中眾多的炎癥細(xì)胞因子如IL-4和TNF-α又可繼續(xù)活化NF-κB信號通路，誘發(fā)更多的炎癥細(xì)胞因子表達(dá)水平上調(diào)，導(dǎo)致最初炎癥信號進(jìn)一步放大，形成“瀑布效應(yīng)”，這是NF-κB的正反饋調(diào)節(jié)，同時(shí)也是NF-κB反應(yīng)靈敏并迅速增加的重要機(jī)制[5]。有最新研究表明，NF-κB mRNA主要表達(dá)分布與鼻息肉組織的嗜酸性粒細(xì)胞、上皮細(xì)胞、部分腺細(xì)胞、漿細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞漿中。提示NF-κB與鼻息肉的關(guān)系密切，可以通過抑制NF-κB的傳導(dǎo)同路來抑制炎癥細(xì)胞的分泌[6-7]。

IL-4是由抗原或絲裂原刺激B細(xì)胞、T細(xì)胞（Th2）產(chǎn)生的自分泌細(xì)胞因子，它可活化肥大細(xì)胞及各種粒細(xì)胞，與IL-5協(xié)同可刺激B細(xì)胞增殖并合成IgE及IgG1，國外有研究表明，在鼻息肉組織中的IgE水平與IL-4水平呈正相關(guān)。在正常人體中Th1和Th2細(xì)胞處于相對平衡趨勢，機(jī)體存在多種保持Th1/Th2平衡的調(diào)節(jié)機(jī)制。其中認(rèn)為IL-4、IFN-γ的相互調(diào)節(jié)是維持Th1/Th2平衡的關(guān)鍵因素[8]。Th1/Th2的平衡失調(diào)，Th2細(xì)胞因子表達(dá)占據(jù)主導(dǎo)可能與鼻息肉的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，而IL-4在Th2細(xì)胞因子產(chǎn)生和釋放中發(fā)揮極其重大的作用[9-10]。NF-κB是介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號傳遞最重要的核轉(zhuǎn)錄因子，NF-κB與Th細(xì)胞分化的關(guān)系的研究目前尚處于起步階段。有研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB參與Th1淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)過程，但也有學(xué)者認(rèn)為NF-κB通過對淋巴細(xì)胞中IL-4基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控，使機(jī)體免疫反應(yīng)向Th2淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫發(fā)展[11-12]。

本實(shí)驗(yàn)RT-PCR結(jié)果表明，NF-κB和IL-4在鼻息肉組織中基因表達(dá)水平高于正常鼻甲組織，兩者可能在鼻息肉的發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用。當(dāng)機(jī)體受到外界病源微生物的刺激時(shí)，NF-κB和IL-4的表達(dá)量驟然增加，導(dǎo)致嗜酸性粒細(xì)胞的聚集，繼發(fā)加劇機(jī)體內(nèi)Th2引發(fā)的炎癥反應(yīng)，由Th2誘發(fā)的炎癥反應(yīng)在機(jī)體內(nèi)不斷加劇，并不斷刺激NF-κB和IL-4的進(jìn)一步產(chǎn)生和釋放。Th2所誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)不僅可雙重刺激體內(nèi)IL-4的產(chǎn)生，與此同時(shí)也不斷促使大量其他的炎癥因子如粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）、IL-5、IL-8、IL-17、和TNF-α等，這些不同的炎癥因子與IL-4相互協(xié)同，使機(jī)體逐步失去了Th1/Th2的平衡。NF-κB和IL-4均參與鼻息肉的發(fā)病過程，研究表明，機(jī)體局部微環(huán)境的破壞可進(jìn)一步誘發(fā)機(jī)體Th1/Th2的失衡，上述兩個(gè)方面相互作用，對鼻息肉的發(fā)病起著非常重要的作用。繼續(xù)深入研究NF-κB和IL-4的表達(dá)及其與鼻息肉的發(fā)病關(guān)聯(lián)，可以在今后鼻息肉的臨床預(yù)防、后期診斷及用藥治療上提供充足的理論依據(jù)和參考指標(biāo)。

[1]陳金輝,楊武,陶澤璋,等.NF-κBp65、IkBα在人鼻息肉組織中的表達(dá)[J].中國耳鼻咽喉顱底外科雜志,2006,12(2):96-100.

[2]任秀敏,何強(qiáng),蔣新霞.白介素4、白介素5在鼻息肉及鼻息肉病組織中的表達(dá)[J].河北醫(yī)藥,2009,31(22):3036-3038.

[3]SOYKA M B,WAWRZYNIAK P,EIWEGGER T,et al.defective epithelial barrier in chronic rhinosinusitis:the regulation of tight junctions by ifn-gamma and IL-4[J].J Allergy Clin Immunol, 2012,13(5):1087-1096.

[4]TERGAONKAR V.NF kappa B pathway:a good signaling paradigm and therapeutic target[J].Int J Biochem Cell Biol, 2006,38(9):1647-1653.

[5]CASTIGLI E,WILSON S A,SCOTT S,et al.TACI and BAFF-R mediate isotpe switching in B cells[J].J Exp Med, 2015,20(4):35-39.

[6]CHO JS,HAN IH,LEE H R,et al.Prostaglandin E2 induces IL-6 and IL-8 production by the EP receptors/Akt/NF-kappa B pathways in nasal polyp-derived fibroblasts[J].Allergy Asthma Immunol Res,2014,6(5):119-457.

[7]VALERA FC,UMEZAWA K,BRASSESCO M S,et al.Suppression of inflammatory cytokine secretion by an Nf-kb inhibitor dhmeq in nasal polyps fibroblasts[J].Cell Physiol Biochem,2012, 30(10):13-22.

[8]鄒偉,朱麗敏,錢迪,等.結(jié)合分枝桿菌培養(yǎng)濾液蛋白對鼻息肉患者IL-4、IFN-γ、GM-CSF的影響[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2010, 35(9):1375-1377.

[9]RAMANATHAN M JR,LEE W K,SPANNHAKE EW,et al. Th2 cytokines associated with chronic rhinosinustitis with polyps down-regulate the antimicrobial immune function of human sinonasal epithelial cells[J].Am J Rhinol,2008,22(5):115-121. [10]OZKARA S,KELES E,ILHAN N,et al.The relationship between th1/th2 balance and 1alpha,25-dihydroxyvitamin d(3)in patients with nasal polyposis[J].Eur Arch Otorhinolaryngol, 2012,26(12):2519-2524.

[11]VANDENBROECK K,ALLOZA I,GADINA M,et al.Inhibiting cytokines of the interleukin-12 family:recent advances and novelchallenges[J].J Pharmacol,2014,56(2):145-160.

[12]LI-WEBER M,GIAISI M,BAUMANN S,et al.NF-Kappa B synergizes with NF-AT and NF-IL-6 in activation of the IL-4 gene in T-cell[J].Eur J Immunol,2014,34(4):1111-1118.

（張蕾編輯）

Expression and significance of NF-κB/IL-4 gene in nasal polyp

Bei-beiWan,Le-nong Hu,Hong-wei Xu
(Lishui Central Hospital,Lishui,Zhejiang 323000,China)

ObjectiveTo investigate the different expression of nuclear factor-κb and lnterleukin 4(IL-4)gene in tissue of the nasal polyp.MethodsA number of 90 cases of nasal polyp were collected as experimental group and 80 cases inferior turbinate tissues as normal group.Real-time quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCR)method was used to detect the different expression of NF-κB and IL-4 gene,and relative analysiswas used to analyzed the results.ResultsCompared with normal group,the expression of NF-κB and IL-4 gene in expermental group was significantly increased(P＜0.05).ConclusionsThe expressions of NF-κB and IL-4 are increased in experimental group,whichmay relatewith the occurrence and developmentof nasal ployp.

NF-κB;IL-4;nasal polyp

R 765

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.24.009

1005-8982（2016）24-0043-04

2016-04-08