姚律，郝麗，郭長(zhǎng)策，丁士新

（1.安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，安徽合肥230601；2.海軍安慶醫(yī)院腎內(nèi)科，安徽安慶246003）

氧化應(yīng)激相關(guān)酶及信號(hào)通路蛋白表達(dá)對(duì)動(dòng)靜脈內(nèi)瘺患者血栓形成的影響

姚律1，郝麗1，郭長(zhǎng)策2，丁士新2

（1.安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，安徽合肥230601；2.海軍安慶醫(yī)院腎內(nèi)科，安徽安慶246003）

目的探討氧化應(yīng)激相關(guān)酶及信號(hào)通路蛋白表達(dá)對(duì)動(dòng)靜脈內(nèi)瘺（AVF）患者血栓形成的影響。方法該院血液中心于2014年1月-2016年1月收治120例行AVF手術(shù)或AVF修補(bǔ)術(shù)的腎臟疾病患者依據(jù)AVF術(shù)后是否有血栓形成分為兩組：A組71例（AVF術(shù)后有血栓形成），B組49例（AVF術(shù)后無(wú)血栓形成），比較兩組患者氧化應(yīng)激酶及信號(hào)通路蛋白水平。結(jié)果A組血漿甲狀旁腺激素、半胱氨酸水平高于B組（P=0.000和0.000），血紅蛋白、C反應(yīng)蛋白水平低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000和0.000）；A組患者血管組織中超氧化物歧化酶-1（SOD-1）、超氧化物歧化酶-2（SOD-2）、血紅素氧化酶-1（HO-1）、Ras相關(guān)C3肉毒素酶解-2（Rac-2）和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NOX-4）水平高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000、0.000、0.000、0.000和0.000）；A組患者血管組織中NADPH氧化酶亞單位P-22、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、叉頭框蛋白01（P-Fox01）和叉頭框蛋白03a（P-Fox03a）水平高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000、0.000、0.000和0.000）；內(nèi)瘺患者血栓形成與血管組織中SOD-1、SOD-2、HO-1、Rac-2、NOX-4、P-22、P13K、P-Fox01和P-Fox03a水平呈正相關(guān)（P=0.040、0.010、0.041、0.022、0.030、0.021、0.031、0.020和0.021）。結(jié)論氧化應(yīng)激反應(yīng)通過(guò)P13K/Fox0信號(hào)通路傳導(dǎo)表達(dá)相關(guān)酶及蛋白，引發(fā)血管內(nèi)皮損傷，導(dǎo)致動(dòng)靜脈內(nèi)瘺吻合處狹窄及血栓形成，臨床可通過(guò)干預(yù)動(dòng)靜脈內(nèi)瘺患者體內(nèi)應(yīng)激反應(yīng)及相關(guān)信號(hào)通路蛋白表達(dá)預(yù)防或治療動(dòng)靜脈內(nèi)瘺血栓的形成。

氧化應(yīng)激；信號(hào)通路蛋白；動(dòng)靜脈內(nèi)瘺；血栓

自體動(dòng)靜脈內(nèi)瘺（arteriovenous fistula，AVF）具有創(chuàng)傷小、使用時(shí)間長(zhǎng)、對(duì)心功能影響小、感染率低、安全性好等優(yōu)點(diǎn)，已成為慢性腎衰竭患者維持性血液透析建立血管通路的主要方式[1]。然而，受多種因素影響，內(nèi)瘺使用期間常發(fā)生阻塞，阻塞率高達(dá)30%~ 40%[2]，對(duì)患者生命產(chǎn)生嚴(yán)重威脅。研究表明，血栓是導(dǎo)致AVF障礙的主要原因之一[3]。盡管AVF血栓發(fā)生率較高，但其使用壽命長(zhǎng)、費(fèi)用低，因而在臨床中仍廣泛使用。因此，研究AVF血栓形成并進(jìn)行防治具有重要意義。據(jù)報(bào)道[4]，氧化應(yīng)激與血管內(nèi)膜損傷及血管炎癥相關(guān)，在介導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化和血栓形成起始和進(jìn)展中具有積極作用，而AVF患者長(zhǎng)期處于高氧化應(yīng)激水平，但這種長(zhǎng)期的持續(xù)高氧化應(yīng)激水平是否對(duì)AVF患者血栓形成產(chǎn)生影響，目前文獻(xiàn)報(bào)道較少。本研究比較AVF有和無(wú)血栓生成患者氧化應(yīng)激相關(guān)酶及信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平，分析AVF血栓生成與氧化應(yīng)激的相關(guān)性，旨在探討氧化應(yīng)激在AVF患者血栓形成中的作用及機(jī)制，為臨床預(yù)防和治療AVF患者血栓形成提供指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月-2016年1月于安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院血液中心收治的120例行AVF手術(shù)或AVF修補(bǔ)術(shù)的腎臟疾病患者。男性76例，女性44例；年齡30～75歲；病程3個(gè)月～60個(gè)月；透析時(shí)間0.12～192個(gè)月；內(nèi)瘺使用時(shí)間0.23～187個(gè)月。依據(jù)患者AVF術(shù)后是否形成血栓將患者分為兩組：A組71例，內(nèi)瘺成形術(shù)后有血栓形成；B組49例，內(nèi)瘺成形術(shù)后無(wú)血栓形成。兩組患者基線資料（見(jiàn)表1）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性（P>0.05）?；颊呒捌浼覍俸炇鹬橥鈺?，并獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

表1 兩組患者基線資料比較

納入標(biāo)準(zhǔn)：①納入符合《慢性腎臟病及透析的臨床實(shí)踐指南》（美國(guó)NKF-K/DOQI工作組2002年制定）[5]中慢性腎臟病診斷標(biāo)準(zhǔn)患者。②納入符合內(nèi)瘺血栓形成診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]患者，具體診斷標(biāo)準(zhǔn)如下：內(nèi)瘺雜音降低，透析血流量<180ml/min；內(nèi)瘺雜音完全消失；B超或超聲波檢查確診有內(nèi)瘺血栓生成；患者局部疼痛，瘺口有血栓狀硬物或觸壓疼痛；血管造影時(shí)血管明顯狹窄，或無(wú)造影劑通過(guò)。③納入符合中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部于2010年發(fā)布的《血液凈化標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》[7]中自體AVF適應(yīng)證患者。④納入自愿參與并研究患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并神經(jīng)性疾病、神志不清或語(yǔ)言失常患者。②合并肝、腦、肺部疾病患者。③符合《血液凈化標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》中自體AVF禁忌證患者。④合并急性心臟衰竭、腦卒中、嚴(yán)重心律失?；颊摺＂莺喜⒓毙愿腥?、腫瘤、肝硬化失代償期患者。⑥哺乳期或妊娠期婦女。⑦使用人工合成移植血管通路患者。

1.2 研究方案

所有患者入院后記錄臨床資料，主要包括性別、年齡、原發(fā)病型、血漿白蛋白（ALB）、膽固醇（CHO）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白（HDL-c）、磷（P）、鈣（Ca）、胱抑素C水平。入院后次日取空腹肘靜脈血，離心測(cè)定血漿生化指標(biāo)水平。

所有患者入院后行AVF成形術(shù)或AVF修補(bǔ)術(shù)，所有手術(shù)由同一位手術(shù)者完成，手術(shù)具體操作如下：內(nèi)瘺吻合方式為頭靜脈-橈動(dòng)脈端側(cè)吻合，穿刺方式為繩梯式，內(nèi)瘺首次使用為術(shù)后6～8周，透析血流量>200ml/min。透析液為碳酸氫鹽，透析速率500ml/min，頻率2～3次/周，每次4 h。透析結(jié)束后彈力腕帶壓迫止血。所有患者在AVF手術(shù)及AVF修補(bǔ)術(shù)時(shí)取靜脈段標(biāo)本，用于血管組織氧化應(yīng)激相關(guān)酶及信號(hào)通路蛋白測(cè)定。

1.3 血漿生化指標(biāo)及氧化應(yīng)激相關(guān)酶、信號(hào)通路蛋白測(cè)定方法

血漿生化指標(biāo)水平測(cè)定采用日立7600-010型全自動(dòng)生化分析儀（日本Toshiba公司），主要包括血紅蛋白（Hb）、甲狀旁腺激素（iPTH）、C反應(yīng)蛋白（CRP）和半胱氨酸水平。

氧化應(yīng)激相關(guān)酶、信號(hào)通路蛋白測(cè)定采用蛋白免疫印跡法（Western blot）[8]，主要檢測(cè)超氧化物歧化酶-1（superoxide dismutas-1，SOD-1）、超氧化物歧化酶-2（superoxide dismutas-2，SOD-2）、血紅素氧化酶-1（hemeoxygenase，HO-1）、Ras相關(guān)C3肉毒素酶解-2（ras-Related C3 botulinum toxin substrate，Rac-2）和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH oxidase-4，NOX-4）等酶蛋白和相關(guān)信號(hào)通路蛋白氧化酶亞單位p-22、磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）、叉頭框蛋白01（forkhead box protein 01，P-Fox01）和叉頭框蛋白03a（forkhead box protein 03a，P-Fox03a）表達(dá)水平。Western blot具體操作如下：取患者在AVF手術(shù)及AVF修補(bǔ)術(shù)時(shí)留下的靜脈段標(biāo)本，與Tris-HCl蛋白質(zhì)緩沖液一起勻漿，4℃、1 500 r/min離心10min，取上清液測(cè)定總蛋白濃度，方法為比色法。取20mg上述上清液進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，90 V電壓下轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜2 h，在脫脂牛奶中加入第一抗體孵育15 h，緩沖液沖洗3次，加入過(guò)氧化物酶標(biāo)記的驢抗兔IgG抗體，孵育1 h，緩沖液沖洗3次。增強(qiáng)發(fā)光并曝光，采用緩沖液沖洗3次，掃描蛋白條帶的吸光度，并采用Quantity one軟件分析蛋白吸光度，計(jì)算目的蛋白相對(duì)含量（為目的蛋白條帶吸光度和β-actin條帶吸光度百分比）。將B組相對(duì)蛋白含量計(jì)為100%，A組含量為A、B兩組相對(duì)蛋白含量百分比。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)，t檢驗(yàn)比較計(jì)量資料，AVF血栓形成與氧化應(yīng)激相關(guān)酶及信號(hào)通路蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析采用Kendall等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者血液生化指標(biāo)比較

A組血漿iPTH、半胱氨酸水平高于B組（P= 0.000和0.000），Hb、CRP水平低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000和0.000）。見(jiàn)表2。

2.2 兩組患者氧化應(yīng)激相關(guān)酶水平比較

A、B兩組患者氧化應(yīng)激相關(guān)酶Western blot結(jié)果見(jiàn)圖1，其定量分析結(jié)果見(jiàn)表3。A組患者血管組織中SOD-1、SOD-2、HO-1、Rac-2和NOX-4水平高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000、0.000、0.000、0.000和0.000）。

2.3 兩組患者氧化應(yīng)激信號(hào)通路蛋白水平比較

A、B兩組患者氧化應(yīng)激信號(hào)通路Western blot結(jié)果見(jiàn)圖2，其定量分析結(jié)果見(jiàn)表4。A組患者血管組織中P-22、P13K、P-Fox01和P-Fox03a水平高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000、0.000、0.000和0.000）。

表2 兩組患者血液生化指標(biāo)比較（±s）

表2 兩組患者血液生化指標(biāo)比較（±s）

半胱氨酸/（m m o l / L）A組（n= 7 1）7 3 . 1 ± 7 . 1 3 1 4 . 3 ± 2 0 . 1 9 . 4 ± 4 . 1 2 4 . 6 ± 6 . 5 B組（n= 4 9）1 1 0 . 4 ± 8 . 2 1 8 6 . 4 ± 1 3 . 2 3 6 . 3 ± 1 0 . 7 1 2 . 1 ± 5 . 1t值2 6 . 5 4 2 4 2 . 0 6 2 1 6 . 7 6 9 1 1 . 2 7 3P值0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0組別H b /（m m o l / L）i P T H /（p g / m l）C R P /（m g / m l）

圖1 兩組患者氧化應(yīng)激相關(guān)酶Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 兩組患者氧化應(yīng)激相關(guān)酶水平比較（%±s）

表3 兩組患者氧化應(yīng)激相關(guān)酶水平比較（%±s）

組別SOD-1 SOD-2 HO-1 Rac-2 NOX-4 A組（n=71）328.1±70.8 635.3±70.9 237.5±61.2 426.3±46.1 312.5±59.3 B組（n=49）100.0±11.1 100.0±17.2 100.0±9.8 100.0±8.5 100.0±19.7t值26.676 61.067 18.589 58.224 28.036P值0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

圖2 兩組患者氧化應(yīng)激相關(guān)信號(hào)通路Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 兩組患者氧化應(yīng)激信號(hào)通路蛋白水平比較（%±s）

表4 兩組患者氧化應(yīng)激信號(hào)通路蛋白水平比較（%±s）

組別P-22 P13K P-Fox01 P-Fox03a A組（n=71）728.1±73.8 335.3±72.1 517.5±41.7 376.3±76.3 B組（n=49）100.0±8.2 100.0±7.0 100.0±7.8 100.0±8.9t值71.081 27.313 82.302 30.217P值0.000 0.000 0.000 0.000

2.4 內(nèi)瘺患者血栓形成與氧化應(yīng)激相關(guān)酶及信號(hào)通路蛋白表達(dá)相關(guān)性分析

內(nèi)瘺患者血栓形成與血管組織中SOD-1、SOD-2、HO-1、Rac-2、NOX-4、P-22、P13K、P-Fox01和PFox03a水平呈正相關(guān)（P=0.040、0.010、0.041、0.022、0.030、0.021、0.031、0.020和0.021）。見(jiàn)表5。

表5 內(nèi)瘺患者血栓形成與氧化應(yīng)激相關(guān)酶及信號(hào)通路蛋白表達(dá)相關(guān)性分析

3 討論

內(nèi)瘺血栓是AVF患者最常見(jiàn)的難題，也是導(dǎo)致患者2次住院的首要原因。對(duì)于腎臟疾病醫(yī)生來(lái)說(shuō)，預(yù)防并治療內(nèi)瘺血栓生成是血液透析患者治療過(guò)程中最艱巨的課題之一[9]。據(jù)報(bào)道[10]，內(nèi)瘺血栓形成是導(dǎo)致AVF狹窄甚至閉塞的重要原因。目前，大量研究人員對(duì)內(nèi)瘺血栓形成原因進(jìn)行深入研究，李彩鳳等[11]認(rèn)為糖尿病、CRP是內(nèi)瘺血栓形成的危險(xiǎn)因素，鐘武華等[12]認(rèn)為腎衰竭患者透析時(shí)血壓過(guò)低、不適當(dāng)穿刺及過(guò)度超濾導(dǎo)致內(nèi)瘺血栓形成。其中，氧化應(yīng)激與內(nèi)瘺血栓形成的相關(guān)性已成為研究熱點(diǎn)[13]。AVF患者長(zhǎng)期處于高氧化應(yīng)激水平，本文主要探討氧化應(yīng)激對(duì)內(nèi)瘺血栓形成的影響，為內(nèi)瘺血栓的預(yù)防和治療提供依據(jù)。

AVF患者長(zhǎng)期處于高氧化應(yīng)激水平，而氧化應(yīng)激是導(dǎo)致患者發(fā)生心血管并發(fā)癥的重要原因[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，AVF血栓形成患者體內(nèi)氧化應(yīng)激相關(guān)酶及信號(hào)通路蛋白表達(dá)高于無(wú)血栓形成患者，且內(nèi)瘺患者血栓形成與血管組織中SOD-1、SOD-2、HO-1、Rac-2、NOX-4、P-22、P13K、P-Fox01和P-Fox03a水平呈正相關(guān)，說(shuō)明內(nèi)瘺患者高氧化應(yīng)激水平是導(dǎo)致內(nèi)瘺血栓形成的重要原因，臨床可通過(guò)下調(diào)內(nèi)瘺患者氧化應(yīng)激水平來(lái)預(yù)防或治療血栓的形成。

氧化應(yīng)激對(duì)AVF血栓形成的影響是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程。LIN等[15]研究發(fā)現(xiàn)，HO-1基因中有長(zhǎng)GT序列重復(fù)基因多態(tài)性的血液透析患者AVF障礙發(fā)生率更高，提示氧化應(yīng)激影響AVF血管內(nèi)膜增生，導(dǎo)致內(nèi)瘺狹窄或失效。血管內(nèi)膜增生部位的平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞是患者氧化應(yīng)激所引起，氧化應(yīng)激作用通過(guò)這些細(xì)胞參與血管內(nèi)膜增生，并引發(fā)血管內(nèi)皮功能紊亂。而血管內(nèi)皮功能紊亂引起血管內(nèi)膜損傷啟動(dòng)血栓形成：血管內(nèi)皮功能紊亂導(dǎo)致血管張力調(diào)節(jié)作用減弱，血流速度降低，進(jìn)而出現(xiàn)血小板附著、炎癥和吞噬細(xì)菌侵蝕現(xiàn)象，激活凝血和纖溶系統(tǒng)，從而導(dǎo)致血栓生成[16]。據(jù)報(bào)道，P13K/Fox0通路[17]是氧化應(yīng)激參與血管內(nèi)皮功能的主要通道。P13K/Fox0通路受體及其蛋白主要包括Rac-2、SOD、HO-1和NOX4等。其中，Rac-2是通過(guò)血漿調(diào)控NADPH氧化酶活性來(lái)調(diào)節(jié)ROS生成的重要酶類之一，本研究發(fā)現(xiàn)，Rac-2是在AVF血栓患者中高表達(dá)，表明Rac-2可通過(guò)激活血管纖維生成和細(xì)胞收縮調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移，導(dǎo)致血管狹窄[18]。SOD和HO-1是血管損傷的保護(hù)因子[19]，在血管內(nèi)皮功能紊亂調(diào)節(jié)中具有抗氧化、抗炎及抗凋亡等作用。本組中，內(nèi)瘺血栓生成患者體內(nèi)SOD和HO-1表達(dá)顯著升高，說(shuō)明在各種刺激下，防御性SOD和HO-1表達(dá)水平增加，起到保護(hù)血管、抑制血栓生成的作用。NOX4氧化酶在血管損傷中作用目前存在分歧[20]，但其在血管狹窄、高血壓等疾病中高表達(dá)，本組中內(nèi)瘺血栓患者中NOX4高表達(dá)，提示NOX4參與內(nèi)瘺血栓形成，但具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，氧化應(yīng)激酶及信號(hào)通路蛋白在維持性血液透析患者AVF血栓形成中扮演重要角色，有血栓形成患者氧化應(yīng)激水平高于無(wú)血栓形成患者。氧化應(yīng)激反應(yīng)通過(guò)P13K/Fox0信號(hào)通路傳導(dǎo)表達(dá)相關(guān)酶及蛋白，引發(fā)血管內(nèi)皮損傷，促進(jìn)AVF吻合處狹窄及血栓形成。因此，臨床可通過(guò)干預(yù)AVF患者體內(nèi)應(yīng)激反應(yīng)及相關(guān)信號(hào)通路蛋白表達(dá)預(yù)防或治療AVF血栓的形成，為臨床AVF患者血栓生成的預(yù)防和治療提供了一種新的干預(yù)方案。

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（張蕾編輯）

Influence of oxidative stress-related enzymes and signal pathway protein expression on thrombosis in patientsw ith arteriovenous fistula

Lv Yao1,Li Hao1,Chang-ce Guo2,Shi-xin Ding2
(1.Department of internalmedicine,the Second Affiliated Hospital of Medical University of Anhui, Hefei,Anhui230601,China;2.Department of internalmedicine,Anqing Navy Hospital, Anqing,Anhui 246003,China)

ObjectiveTo investigate the influence of oxidative stress-related enzymes and signal pathway protein expression on arteriovenous fistula(AVF)in patientswith thrombosis.MethodsFrom January 2014 to January 2016, 120 patients treated with routine arteriovenous fistula(AVF)or AVF repair surgery were divided into two groups according whether AVF thrombosis occurred after surgery:A group of 71 cases(AVF thrombosis after surgery), group B had 49 cases(AVF postoperative thrombosis).Levels of blood biochemicalmarker,oxidative stress-related enzymes(SOD-1,SOD-2,HO-1,Rac-2 and NOX-4)and related signaling pathway proteins(P-22,P13K,PFox01 and P-Fox03a)were compared.ResultsLevels ofplasma parathyroid hormone,homocysteine in group Awere significantly higher than group B(P=0.000,0.000),and hemoglobin,C-reactive protein levels were significantlylower than group B,the differenceswere significant(P=0.000,0.000).Levels of SOD-1,SOD-2,HO-1,Rac-2 and NOX-4 in group A were significantly higher than group B,the differences were statistically significant(P=0.000, 0.000,0.000,0.000,0.000).Levels of P-22,P13K,P-Fox01 and P-Fox03a in vastular tissue of group A were higher than group B,the differences were significant(P=0.000,0.000,0.000,0.000).Fistula thrombosis in patients with vascular tissuewere significantly correlated with SOD-1,SOD-2,HO-1,Rac-2,NOX-4,P-22,P13K,P-Fox01 and P-Fox03a levels(P=0.040,0.010,0.041,0.022,0.030,0.021,0.031,0.020,0.021).ConclusionsThe oxidative stress expresses protein associated enzymes by P13K/Fox0 signal transduction pathway,causes endothelial damage, leads to stenosis of arteriovenous fistula and anastomosis thrombosis.Clinical intervention by the stress response can move fistula patients intravenously and in vivo signaling pathway associated protein expression in the formation of prevention or treatmentof arteriovenous fistula thrombosis.

oxidative stress;signal pathway protein;arteriovenous fistula;thrombus

R 543

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.24.006

1005-8982（2016）24-0028-05

2016-05-17

郝麗，E-mail：haoliqilin@163.com