馬朋杰劉 魏,黃杰烽,△陳偉燕鄭 楊汪麗佩童培建
(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué),浙江 杭州 310053;2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院,浙江 杭州310006)
·研究報告·
基于ICC探索半夏厚樸湯加減對腰椎骨折后大鼠胃腸動力的影響及作用機(jī)制*
馬朋杰1劉 魏1,2黃杰烽1,2△陳偉燕1鄭 楊2汪麗佩1童培建2
(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué),浙江 杭州 310053;2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院,浙江 杭州310006)
目的觀察半夏厚樸湯加減對腰椎骨折后大鼠胃腸動力的影響,并基于ICC探討該方對腰椎骨折后大鼠胃腸動力影響的作用機(jī)制。方法 60只雄性SD大鼠隨機(jī)分為空白組,模型組,半夏厚樸湯高、中、低劑量組以及莫沙必利組(為避免實(shí)驗(yàn)過程中動物死亡對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響,每組增加2只SD大鼠,故實(shí)際操作中每組12只雄性SD大鼠,共72只SD大鼠),造模后第2天給予相對應(yīng)藥物灌胃(空白組、模型組予0.9%氯化鈉注射液灌服),連續(xù)灌胃10 d。處死動物前予自制半固體營養(yǎng)糊檢測大鼠胃殘留率和小腸推進(jìn)率,取大鼠空腸組織按免疫組化要求染色并觀察其空腸的病理結(jié)構(gòu)及c-kit蛋白表達(dá)。結(jié)果與空白組比較,模型組大鼠胃殘留率明顯升高、小腸推進(jìn)率顯著降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,半夏厚樸湯低、中、高濃度、西藥組大鼠胃殘留率均明顯降低、小腸推進(jìn)率顯著升高(P<0.05);與西藥組比較,半夏厚樸湯低、中濃度組大鼠胃排空、小腸推進(jìn)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),半夏厚樸湯高濃度組差異性顯著(P<0.05)。病理切片HE染色后顯示,與空白組比較,模型組大鼠空腸黏膜上皮大量壞死脫落,并伴有炎細(xì)胞浸潤,而半夏厚樸湯組低、中、高3個劑量組的病理變化逐漸減輕;免疫組化結(jié)果顯示,與模型組比較,空白組、西藥組空腸腺體細(xì)胞高表達(dá)c-kit蛋白,半夏厚樸湯組c-kit蛋白表達(dá)亦明顯增高,且呈劑量依賴性。結(jié)論半夏厚樸湯加減能促進(jìn)腰椎骨折后大鼠的胃腸動力,同時促進(jìn)其空腸組織恢復(fù)表達(dá)c-kit蛋白,這可能是該方調(diào)節(jié)大鼠胃腸動力的機(jī)制之一。
半夏厚樸湯加減 腰椎骨折 胃腸動力 胃殘留率 小腸推進(jìn)率 c-kit蛋白 SD大鼠
腰椎骨折常伴有嚴(yán)重的腹脹、便秘甚至惡心、嘔吐等胃腸動力障礙癥狀,延長患者住院時間,增加患者住院費(fèi)用。研究顯示胃腸動力障礙可能與平滑肌網(wǎng)絡(luò)-Caja間質(zhì)細(xì)胞-胃腸神經(jīng)系統(tǒng)的功能失調(diào)有關(guān)[1]。半夏厚樸湯原為治療痰氣郁結(jié)型“梅核氣”的經(jīng)典名方?!督饏T·婦人雜病脈證并治》“婦人咽中如有炙臠,半夏厚樸湯主之”。近年來研究發(fā)現(xiàn),半夏厚樸湯具有抗抑郁、抗焦慮等功效[2],臨床上應(yīng)用半夏厚樸湯治療胃腸動力障礙獲得了良好的療效,陳少鵬等運(yùn)用半夏厚樸湯加減治療腰椎術(shù)后胃腸功能紊亂46例,其總有效率為95.6%[3];劉魏等運(yùn)用半夏厚樸湯加減治療腰椎骨折術(shù)后胃腸功能障礙30例,其總有效率達(dá)90%,顯效率為70%[4]?,F(xiàn)將半夏厚樸湯加減應(yīng)用于腰椎骨折大鼠模型來進(jìn)一步研究其對腰椎骨折大鼠的胃腸動力影響,并通過比較各組大鼠空腸c-kit蛋白表達(dá)探討該方的作用機(jī)制?,F(xiàn)報告如下。
1.1 實(shí)驗(yàn)動物 雄性SD大鼠72只,體質(zhì)量200~250 g,由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供,動物許可證號SYXK(浙)2016-0009,動物觀察室溫度(25± 1)℃,相對濕度(60±10)%。適應(yīng)性喂養(yǎng)馴化1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
1.2 試藥與儀器 半夏厚樸湯加減由浙江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)門診部提供藥材。半夏厚樸湯加減由半夏∶厚樸∶茯苓∶干姜∶蘇?!描讱ぁ贸窗仔g(shù)∶生軍∶炙甘草=2∶2∶2∶2∶3∶2∶2∶1∶1組成,將中藥飲片置煎煮容器中,加相當(dāng)藥材量5倍冷水浸2 h,強(qiáng)火煮沸后文火煎 30 min,過濾。藥渣加2倍量水繼續(xù)煎煮,煮沸20 min過濾。合并2次濾液,濃縮成30 g/L(低濃度),60 g/L(中濃度),100 g/L(高濃度)的濃度。枸櫞酸莫沙必利片(由山西亞寶藥業(yè)太原制藥有限公司生產(chǎn),國藥準(zhǔn)字H20090158)。半固體營養(yǎng)糊標(biāo)記物(取羧甲基纖維素5 g溶于125 mL蒸餾水中,后分別加入奶粉8 g,白糖、淀粉各4 g,活性炭末 2 g,攪拌均勻后配制成約150 mL(約1 g/mL)黑色半固體糊狀物)。采用RM2128型切片機(jī)(德國Leica公司);XSP-300型雙目顯微鏡 (上海蔡康光學(xué)儀器有限公司)。
1.3 分組與造模 為避免給藥時刺激所致的應(yīng)激影響,于實(shí)驗(yàn)前3 d始,每日用灌胃針馴化處理2次,造模前12 h開始禁食,2 h前禁水。用10%水合氯醛,以3 mL/kg行腹腔內(nèi)注射麻醉,待麻醉起效后,于右側(cè)腹部及腰背部剪毛備皮3 cm×6 cm。實(shí)驗(yàn)大鼠取左側(cè)臥位,通過大鼠脊柱下段兩側(cè)可觸及的一對鈍形突起髖結(jié)節(jié),其正對腰6椎體,上數(shù)一節(jié)椎體定位大鼠腰5椎體的位置,依次往上標(biāo)記筆標(biāo)記L5,L4,L3椎體,碘伏消毒3遍,鋪巾。取右腹后外側(cè)縱行切口長約2 cm,腹外斜肌與背肌之間切開,鈍性分離椎前軟組織,腹膜外入路到達(dá)椎體右前外側(cè)方,注意不要損傷到腹膜及腹腔組織,暴露L4、L5椎體。咬除該兩腰椎的右側(cè)橫突,并用自制限深克氏針分別多點(diǎn)穿刺破壞L4、L5椎體及克氏針傾斜45°經(jīng)L4/5間盤鉆入L4椎體下終板,破壞L4/ 5髓核及椎間盤組織,穿刺深度約2.3 mm,不要損傷到脊髓。術(shù)畢,逐層縫合肌肉層、皮下、皮膚。電烤燈正對麻醉狀態(tài)中的大鼠照射,保溫待其完全蘇醒,放回鼠籠子飼養(yǎng)。72只SD雄性大鼠進(jìn)行隨機(jī)化分組:即正常組、模型組、枸櫞酸莫沙比利組、半夏厚樸湯低、中、高劑量組,每組12只(為避免實(shí)驗(yàn)過程中動物死亡對試驗(yàn)結(jié)果的影響,相對于試驗(yàn)設(shè)計每組實(shí)際操作中增加了2只SD大鼠)。造模后第2日開始給予灌胃,正常組和模型組給予灌服生理鹽水,低劑量組給予灌服30 g/L的半夏厚樸湯加減,中劑量組給予灌服60 g/L的半夏厚樸湯加減,高劑量組給予灌服100 g/L的半夏厚樸湯加減,西藥組給予莫沙必利0.15 g/L,各組灌服劑量均為20 mL/kg,每日灌服2次 (早晨10∶00及16∶00),連續(xù)灌胃10 d。
1.4 觀察指標(biāo) 1)大鼠胃內(nèi)殘留率、小腸推進(jìn)率的測定,最后1次灌胃給藥后,所有大鼠禁食不禁水24 h。隨后給予半固體營養(yǎng)糊標(biāo)記物2 mL灌服。30 min后每組選取10只SD大鼠脫頸椎處死,迅速剖開腹腔,將大鼠的胃賁門和幽門部兩端分別結(jié)扎,清除胃表面的血漬并稱取胃的質(zhì)量,將胃體剪開(沿胃大彎),將胃內(nèi)殘留物洗凈,濾紙拭干稱質(zhì)量,此即胃凈質(zhì)量,用胃全質(zhì)量減去胃凈質(zhì)量即得胃內(nèi)殘留物的質(zhì)量,計算胃內(nèi)殘留率。胃殘留率(%)=[(胃全質(zhì)量-胃凈質(zhì)量)/半固體營養(yǎng)糊標(biāo)記物質(zhì)量]×100%。然后將幽門至回盲部的腸管一段取出,用直尺測量其長度,此即小腸的總長度(cm),然后測出半固體營養(yǎng)糊標(biāo)記物推進(jìn)長度,即幽門部到半固體營養(yǎng)糊標(biāo)記物前沿的長度(cm),計算出小腸推進(jìn)率。小腸推進(jìn)率(%)=[營養(yǎng)糊推進(jìn)長度(cm)/小腸總長度(cm)]×100%。2)大鼠空腸組織病理學(xué)觀察大鼠胃內(nèi)殘留率、小腸推進(jìn)率的測定完成后,剪取大鼠一段空腸組織放入10%中性甲醛溶液中預(yù)固定組織,HE染色觀察大鼠空腸組織病理學(xué)改變情況。3)大鼠空腸組織c-kit蛋白表達(dá)的比較大鼠胃內(nèi)殘留率、小腸推進(jìn)率的測定完成后,剪取大鼠空腸組織一小塊,免疫組化法比較c-kit蛋白的表達(dá)。
1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理。計量資料以(s)表示,采用配對t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
實(shí)驗(yàn)過程中西藥組SD大鼠,死亡2只;中濃度組死亡1只;(灌胃過程中導(dǎo)致大鼠肺水腫死亡)由于各組實(shí)驗(yàn)中大鼠數(shù)量相對于實(shí)驗(yàn)設(shè)計額外增加2只,故對實(shí)驗(yàn)結(jié)果無影響。
2.1 半夏厚樸湯加減對SD大鼠胃排空、小腸推進(jìn)率的影響 見表1。與空白組比較,模型組大鼠胃殘留率明顯升高、小腸推進(jìn)率顯著降低(P<0.05);與模型組比較,半夏厚樸湯低、中、高濃度、西藥組大鼠胃殘留率均明顯降低、小腸推進(jìn)率顯著升高(P<0.05);與西藥組比較,半夏厚樸湯低、中組大鼠胃排空、小腸推進(jìn)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義,高濃度組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)。
表1 各組大鼠胃排空、小腸推進(jìn)率比較(%,s)
表1 各組大鼠胃排空、小腸推進(jìn)率比較(%,s)
與空白組比較,△P<0.05,△△P<0.01;與模型組比較,,*P<0.05,**P<0.01;與西藥組比較,▲P<0.05,▲P<0.01。
組別 n 胃殘留率 小腸推進(jìn)率空白組 10 38.25±4.01 69.03±5.09模型組 10 81.75±3.53△39.96±4.19△半夏厚樸湯低濃度組 10 72.55±3.61*48.32±4.12*半夏厚樸湯中濃度組 10 63.40±3.94*53.19±5.53*半夏厚樸湯高濃度組 10 46.70±7.91*▲64.11±3.95*▲西藥組 10 68.65±6.63*50.95±6.11*
2.2 大鼠空腸組織的病理學(xué)觀察 見圖1。病理HE染色結(jié)果顯示,空白組空腸組織黏膜上皮完整,無炎細(xì)胞浸潤;模型組大鼠空腸黏膜上皮出現(xiàn)大量變性壞死脫落,并伴有大量炎細(xì)胞浸潤;而經(jīng)西藥組治療后,腸黏膜上皮壞死脫落現(xiàn)象減輕,炎細(xì)胞浸潤減少;經(jīng)半夏厚樸湯組低、中、高劑量組治療后的空腸黏膜上皮變性壞死脫落及炎細(xì)胞浸潤現(xiàn)象亦逐漸減輕,并隨劑量增加,改善愈明顯,呈劑量依賴性。
圖1 半夏厚樸湯對空腸的作用(HE染色,100倍)
2.3 大鼠空腸組織c-kit蛋白表達(dá)的比較 見圖2。免疫組化結(jié)果顯示,空白組大鼠空腸組織腺體胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量棕黃色顆粒,提示其高表達(dá)c-kit蛋白;模型組大鼠空腸組織未見或少見棕黃色顆粒樣物質(zhì),提示其幾乎不表達(dá)c-kit蛋白;經(jīng)西藥組治療后的大鼠空腸組織腺體細(xì)胞亦表達(dá)大量棕黃色顆粒,提示西藥組高表達(dá)c-kit蛋白;而經(jīng)半夏厚樸湯低、中、高劑量組治療后的大鼠空腸組織重新出現(xiàn)棕黃色顆粒樣物質(zhì),且隨著劑量增加,表達(dá)逐漸增加,提示半夏厚樸湯可恢復(fù)空腸組織中c-kit蛋白的表達(dá),且呈劑量依賴性。
圖2 半夏厚樸湯對空腸中c-kit蛋白表達(dá)的影響(HE染色,100倍)
腰椎骨折后,圍手術(shù)期前后常伴有胃腸動力障礙,其臨床常表現(xiàn)為嚴(yán)重的腹脹、便秘甚至惡心、嘔吐等癥狀,增加醫(yī)療負(fù)擔(dān)。其發(fā)病機(jī)制可能是創(chuàng)傷激活抑制性交感神經(jīng)反射系統(tǒng),使胃腸交感神經(jīng)系統(tǒng)活動增強(qiáng),并通過抑制胃腸神經(jīng)叢的興奮性神經(jīng)元抑制胃腸動[5];創(chuàng)傷后應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致血糖升高,高血糖高對胃腸動力有抑制作用,且呈正相關(guān)[6];創(chuàng)傷后長期臥床以及患者的焦慮緊張情緒皆會對胃腸動力產(chǎn)生不利的影響[7],術(shù)中麻醉會對患者的胃腸動力產(chǎn)生抑制作用,研究表明影響麻醉對胃腸動力抑制的因素包括麻醉方式和藥物的選擇[8]。
Cajal間質(zhì)細(xì)胞(ICC)是西班牙神經(jīng)解剖學(xué)家Cajal于1893年首先發(fā)現(xiàn)的存在于胃腸道的一種特殊間質(zhì)細(xì)胞,分布于整個胃腸道。其后大量研究證實(shí)ICC是胃腸道的起搏細(xì)胞,具有產(chǎn)生自發(fā)電信號、傳導(dǎo)慢波電位、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)等功能[9]。許多研究證實(shí)了ICC數(shù)量的減少、形態(tài)和網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)改變與胃腸動力障礙密切相關(guān)[10-11],同時大量研究表明ICC可以成為許多胃腸動力性疾病治療的靶向目標(biāo)[12-13]。一些以ICC為靶向的藥物已應(yīng)用于臨床,以中藥牽牛種子和延胡索塊莖合成的促胃動力劑DA-9701,可以通過激活I(lǐng)CC的起搏活性加速胃排空速率,且其促進(jìn)胃腸動力的效果強(qiáng)于莫沙必利和西沙必利[14-15]。
c-kit是胃腸道ICC表面的一種特異性受體蛋白[16],現(xiàn)在常用c-kit免疫組織化學(xué)法特異性地檢測ICC[17]。本實(shí)驗(yàn)以ICC為基礎(chǔ),重在探討半夏厚樸湯加減對腰椎骨折后大鼠胃腸動力的影響及其作用機(jī)制。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示半夏厚樸湯加減能降低腰椎骨折后大鼠胃殘留率,提高其小腸推進(jìn)率,且半夏厚樸湯高濃度組較西藥組更具有優(yōu)越性;該方可恢復(fù)腰椎骨折后大鼠空腸組織中c-kit蛋白的表達(dá),且呈劑量依賴性。綜上所述,本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了半夏厚樸加減能促進(jìn)腰椎骨折后大鼠胃腸運(yùn)動,增強(qiáng)胃腸排空能力;同時實(shí)驗(yàn)表明半夏厚樸湯加減能恢復(fù)腰椎骨折后大鼠空腸組織ckit蛋白表達(dá),即該方能恢復(fù)腰椎骨折后大鼠ICC的活性,這是該方促進(jìn)胃腸動力的作用機(jī)制之一。
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ICC-based Exploration on the Effect of Banxia Houpu Decoction on Gastrointestinal Motility in Rats af-ter Lumbar Fracture and Its Mechanism
MA Pengjie,LIU Wei,HUANG Jiefeng,et al. Zhejiang Chinese Medical University,Zhejiang,Hangzhou 310053,China.
Objective:To observe the impact of Banxia Houpu decoction on gastrointestinal motility in rats after vertebral fracture through animal experiments and to make ICC-based investigation into the mechanism of action of the dynamic effects of Banxia Houpu decoction on gastrointestinal motility in rats after vertebral fracture.Methods:60 male SD rats were randomly divided into control group,model group,Banxia Houpu decoction high,medium and low dose group and mosapride group(to avoid the effect of SD rats dying on the test results,two more SD rats were put into each group,so in the actual operation,there were 12 male SD rats in each group and the total was 72 SD rats).On the next day after model establishment,corresponding drugs were given orally(control group,model group were fed with normal saline),the gavage lasted for continuous 10 days.The animals were sacrificed after self-made semi-solid nutritional paste was used to detect rats’gastric residual rate and intestinal propulsive rate.Tissues from rat jejunum were extracted and stained by immunohistochemical staining.The pathological structure of jejunum and its c-kit protein expression were observed.Results:Compared with the control group,rats’gastric residual rate was significantly higher,intestinal propulsive rate was significantly lower in the model group and the difference was statistically significant(P<0.05).Compared with the model group,low density,medium density,high density,western medicine group rats’gastric residual rate decreased and intestinalpropulsion rate increased significantly,with a significant difference(P<0.05).There was no significant difference on gastric emptying and intestinal propulsive rate of low concentration group and medium concentration group compared with western medicine group,the difference was not statistically significant(P>0.05).The difference with the high concentration group was significant(P<0.05).Pathological HE staining showed that compared with the control group,lots of necrosis happened to rats’jejunal mucosal epithelia in the model group,accompanied by inflammatory cell infiltration.Among the low dose,medium dose and high dose Banxia Houpu groups,the pathological changes gradually reduced.IHC results showed that compared with the model group,the jejunum gland cell protein expression of c-kit increased in the control group and western medicine group.The histone expression of c-kit had also significantly increased in a dose-dependent manner in the Banxia Houpu groups.Conclusion:Banxia Houpu decoction can promote gastrointestinal motility of rats after fracture,while promoting the expression of c-kit in its jejunal tissue,which may be one of the mechanisms that regulate gastrointestinal motility in rats.
Banxia Houpu decoction;Lumbar fracture;Gastrointestinal motility;Gastric residual rate;Intestinal propulsive rate;C-kit protein;SD rats
R285
A
1004-745X(2016)12-2209-04
10.3969/j.issn.1004-745X.2016.12.001
2016-08-17)
國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81403223);浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.LQ14H290003);浙江省中醫(yī)藥科技計劃科研基金項(xiàng)目(No.2016ZA078)
△通信作者(電子郵箱:40983285@qq.com)