王會平，張洪江，董 歧，劉 潔，段 杉，葛軍旗，王仲華，張 政

(北京市朝陽區(qū)疾病預(yù)防控制中心，北京 100021)

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醫(yī)院環(huán)境物體表面及醫(yī)務(wù)人員手分離病原菌對抗菌藥物和消毒劑的耐藥性

王會平，張洪江，董 歧，劉 潔，段 杉，葛軍旗，王仲華，張 政

(北京市朝陽區(qū)疾病預(yù)防控制中心，北京 100021)

目的 了解醫(yī)院環(huán)境物體表面及醫(yī)務(wù)人員手分離的病原菌種類，及其對醫(yī)院常用抗菌藥物和消毒劑的耐藥性。方法對北京市某城區(qū)16所醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)病房、普通病房環(huán)境物體表面和醫(yī)務(wù)人員手分離的病原菌進(jìn)行細(xì)菌鑒定及藥敏試驗、消毒劑抗性試驗，并檢測病原菌對抗菌藥物和消毒劑耐藥的基因攜帶情況。結(jié)果16所醫(yī)院環(huán)境物體表面和醫(yī)務(wù)人員手共采集標(biāo)本979份，檢出病原菌75株(7.66%)，以革蘭陰性(G-)桿菌為主(占78.67%)，其中銅綠假單胞菌(24株)、陰溝腸桿菌(14株)和肺炎克雷伯菌(4株)居前3位。有1株銅綠假單胞菌對氨曲南、慶大霉素、妥布霉素、環(huán)丙沙星和左氧氟沙星耐藥；1株陰溝腸桿菌對哌拉西林耐藥，7株對呋喃妥因耐藥；4株肺炎克雷伯菌對哌拉西林全耐藥，2株對頭孢類抗菌藥物耐藥，1株對美羅培南耐藥。銅綠假單胞菌有7個耐藥基因陽性，以mir陽性率最高(100.00%)；陰溝腸桿菌有4個耐藥基因陽性，tem1和shv陽性率均為100.00%；肺炎克雷伯菌有5個耐藥基因陽性，shv和mir陽性率均為100.00%。銅綠假單胞菌和陰溝腸桿菌對葡萄糖酸氯己定(耐藥率分別為4.17%、57.14%)和三氯異氰尿酸(均為50.00%)均產(chǎn)生耐藥，兩種菌消毒劑耐藥基因(qacE△1-sul1)陽性率分別為79.17%、57.14%；肺炎克雷伯菌對兩種消毒劑均無耐藥性，均未檢出耐藥基因。結(jié)論醫(yī)院環(huán)境物體表面和醫(yī)務(wù)人員手均存在多種引起醫(yī)院感染的常見病原菌，以G-桿菌為主，且病原菌均出現(xiàn)不同程度的對抗菌藥物和消毒劑耐藥。

物體表面； 醫(yī)務(wù)人員； 手； 病原菌； 抗菌藥物； 消毒劑； 耐藥

[Chin J Infect Control，2016，15(12)：921-925]

近年來，臨床標(biāo)本分離的病原菌對抗菌藥物和消毒劑的耐藥性已經(jīng)引起人們的廣泛關(guān)注[1-4]，但對醫(yī)院環(huán)境表面分離的病原菌耐藥狀況研究較少[5]。研究[6-7]表明，醫(yī)院環(huán)境物體表面攜帶較多病原菌，甚至在消毒后仍存在許多病原菌，病原菌很容易附著于醫(yī)務(wù)人員手上，進(jìn)而傳播給患者，若為耐藥菌株，患者感染后會給臨床治療帶來較大的困難，同時也給患者帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[8-10]。為了解醫(yī)院環(huán)境物體表面和醫(yī)務(wù)人員手病原菌的分布情況，及其對醫(yī)院常用抗菌藥物和消毒劑的耐藥性，我們進(jìn)行了相關(guān)研究。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 標(biāo)本主要來源于北京市某城區(qū)16所醫(yī)院(二級醫(yī)院6所、三級醫(yī)院10所)重癥監(jiān)護(hù)病房(intensive care unit,ICU)、普通病房環(huán)境物體表面、醫(yī)務(wù)人員手分離的病原菌。標(biāo)準(zhǔn)菌株為銅綠假單胞菌ATCC 15442、大腸埃希菌ATCC 13706和肺炎克雷伯菌ATCC 27336(美國Microbiologics公司)，標(biāo)準(zhǔn)菌株主要用于抗菌藥物藥敏試驗、消毒劑抗性實驗及基因檢測的質(zhì)量控制。

1.2 標(biāo)本采集 依據(jù)GB15982-2012《醫(yī)院消毒衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定的方法，對醫(yī)院ICU、普通病房進(jìn)行環(huán)境物體表面和醫(yī)務(wù)人員手標(biāo)本的采集。環(huán)境物體表面和醫(yī)務(wù)人員手進(jìn)行日常清潔后，用浸有無菌生理鹽水采樣液的棉拭子涂抹采樣，然后將采樣棉拭子頭置于10 mL無菌生理鹽水試管內(nèi)。

1.3 病原菌分離、鑒定和藥敏試驗 采集的標(biāo)本按常規(guī)培養(yǎng)方法進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)后，采用全自動細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)(VITEK 2 Compact，法國生物梅埃公司)進(jìn)行病原菌種類鑒定及藥敏試驗。藥敏試驗采用AST-GN09藥敏卡測定革蘭陰性(G-)菌對21種常用抗菌藥物的耐藥性。

1.4 消毒劑抗性試驗 試驗選擇的消毒劑為醫(yī)院常用于皮膚消毒的胍類消毒劑葡萄糖酸氯己定(4.6 g/L)和常用于環(huán)境物體表面消毒的含氯消毒劑三氯異氰尿酸(1.5 g/片)。經(jīng)中和劑鑒定試驗確定葡萄糖酸氯己定的中和劑為含1%組氨酸的DE中和肉湯，三氯異氰尿酸的中和劑為含0.5%硫代硫酸鈉的磷酸鹽溶液。用液體培養(yǎng)基稀釋法[11]測定消毒劑對病原菌的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)和最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration,MBC)。具體操作方法：使用接種環(huán)從新鮮的固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(培養(yǎng)18～24 h)上挑取4～5個克隆轉(zhuǎn)移至5 mL MH肉湯內(nèi)培養(yǎng)4～6 h，濃度達(dá)0.5麥?zhǔn)蠁挝?，?.01 mL菌液加入0.1 mL對倍稀釋的消毒劑和0.1 mL雙倍濃度的MH肉湯，同時設(shè)陰性和陽性對照。經(jīng)過37℃培養(yǎng)48 h后觀察結(jié)果。無菌生長的消毒劑最低濃度為MIC，從MIC開始向上2個濃度，各吸取0.1 mL混合液接種至0.9 mL相應(yīng)中和劑中作用10 min，然后再吸取0.5 mL混合液接種至營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，經(jīng)過37 ℃培養(yǎng)48 h后無菌落生長的濃度為MBC，該試驗重復(fù)3次。以標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，MIC大于標(biāo)準(zhǔn)菌株的試驗菌即存在消毒劑抗性。

1.5 耐藥基因檢測 采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增方法對病原菌耐藥基因進(jìn)行檢測，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序后進(jìn)行比對證實為目的基因，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的基因測序由北京吉美生物技術(shù)有限公司完成。病原菌DNA提取的操作步驟參照QIAamp DNA Mini Kit說明書(QIAGEN公司)進(jìn)行，DNA模板液置于-20℃冰箱備用。PCR擴(kuò)增靶基因的名稱、引物序列及產(chǎn)物長度見表1。PCR擴(kuò)增熱循環(huán)參數(shù)為：96℃預(yù)變性5 min，96℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸40 s，30個循環(huán)，72℃延伸8 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)溴乙錠染色，通過紫外成像儀觀察結(jié)果。

表1 PCR引物序列及產(chǎn)物長度

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料以百分率描述，組間比較以卡方檢驗，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病原菌檢出情況 采集16所醫(yī)院環(huán)境物體表面(床單位、診療器械等)和醫(yī)務(wù)人員手標(biāo)本979份，檢出病原菌75株，檢出率為7.66%。檢出的病原菌以G-桿菌為主(占78.67%)，其中銅綠假單胞菌(24株)、陰溝腸桿菌(14株)和肺炎克雷伯菌(4株)居前3位，革蘭陽性球菌以凝固酶陰性萄萄球菌(6株)、腸球菌(4株)為主。二級醫(yī)院和三級醫(yī)院病原菌檢出率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=2.99，P>0.05)。ICU環(huán)境物體表面和醫(yī)務(wù)人員手病原菌檢出率低于普通病房(χ2=13.38，P<0.01)。見表2。環(huán)境物體表面共采集標(biāo)本868份，其中床單位、診療器械表面和其他物體表面病原菌檢出率分別為8.13%、2.91%、9.54%；醫(yī)務(wù)人員手共采集標(biāo)本111份，護(hù)士和其他醫(yī)務(wù)人員手病原菌檢出率分別為3.85%、21.21%。見表3。

表2 不同級別醫(yī)院及病房病原菌檢出率比較

表3 醫(yī)院不同標(biāo)本病原菌檢出率比較

Table 3 Comparison in detection rates of pathogens from different hospital specimens

標(biāo)本標(biāo)本數(shù)病原菌株數(shù)檢出率(%)床單位455378.13診療器械17252.91其他物體表面241239.54護(hù)士手7833.85其他醫(yī)務(wù)人員手33721.21合計979757.66

2.2 耐藥性分析

2.2.1 藥敏結(jié)果 24株銅綠假單胞菌中有1株對氨曲南、慶大霉素、妥布霉素、環(huán)丙沙星和左氧氟沙星耐藥，該菌株來源于ICU的枕芯表面；14株陰溝腸桿菌中，有1株對哌拉西林耐藥，7株對呋喃妥因耐藥；4株肺炎克雷伯菌對哌拉西林全耐藥，有2株對頭孢類抗菌藥物耐藥，1株對美羅培南耐藥，該菌株來源于ICU的聽診器。

2.2.2 耐藥基因檢測 分別檢測3種G-桿菌中磺胺類、β-內(nèi)酰胺類和氨基苷類耐藥基因的攜帶情況,其中銅綠假單胞菌有7個耐藥基因陽性，以mir陽性率最高(100.00%)，其次tem-1、sul1和sul2陽性率均>50%；陰溝腸桿菌有4個耐藥基因陽性，其中tem1和shv陽性率均為100.00%，mir和dha陽性率分別為92.86%和42.86%；肺炎克雷伯菌有5個耐藥基因陽性，其中shv和mir陽性率均為100.00%，sul1、sul2和dha陽性率均為50.00%。見表4。

2.3 消毒劑耐藥性分析

2.3.1 MIC和MBC測定結(jié)果 對葡葡萄糖酸氯己定的耐藥性結(jié)果顯示，24株銅綠假單胞菌的MIC為8～32 mg/L，MBC為 16～64 mg/L，其中1株產(chǎn)生耐藥性(4.17%)；14株陰溝腸桿菌的MIC為8～32 mg/L，MBC為32～64 mg/L，其中8株產(chǎn)生耐藥性(57.14%)。對三氯異氰尿酸的耐藥性結(jié)果顯示，24株銅綠假單胞菌的MIC為64～256 mg/L，MBC為128～512 mg/L，12株產(chǎn)生耐藥性(50.00%)，其中11株菌株來源于環(huán)境物體表面；14株陰溝腸桿菌的MIC為64～128 mg/L，MBC為256～512 mg/L，其中7株產(chǎn)生耐藥性(50.00%)，均來源于環(huán)境物體表面。銅綠假單胞菌對三氯異氰尿酸的耐藥性高于葡萄糖酸氯己定(P<0.01)，肺炎克雷伯菌對兩種消毒劑均無耐藥性。見表5。

2.3.2 耐藥基因檢測 檢測3種G-桿菌消毒劑耐藥基因(qacE△1-sul1)，結(jié)果顯示24株銅綠假單胞菌中，19株(79.17%)檢出耐藥基因；14株陰溝腸桿菌中，8株(57.14%)檢出耐藥基因；4株肺炎克雷伯菌均未檢出耐藥基因。

表4 16所醫(yī)院分離的主要G-桿菌抗菌藥物耐藥基因攜帶情況[陽性菌株數(shù)(%)]

Table 4 Carriage of antimicrobial resistance genes in main gram-negative bacilli from 16 hospitals (No.of positive isolates[%])

抗菌藥物基因名稱銅綠假單胞菌(n=24)陰溝腸桿菌(n=14)肺炎克雷伯菌(n=4)磺胺類sul116(66.67)0(0.00)2(50.00)sul213(54.17)0(0.00)2(50.00)β-內(nèi)酰胺類tem-120(83.33)14(100.00)0(0.00)shv5(20.83)14(100.00)4(100.00)dha0(0.00)6(42.86)2(50.00)vim7(29.17)0(0.00)0(0.00)mir24(100.00)13(92.86)4(100.00)氨基苷類aph(3’)-I1(4.17)0(0.00)0(0.00)

表5 不同G-菌對兩種消毒劑的MIC和MBC

3 討論

本組診療器械表面病原菌檢出率為2.91%，低于床單位和其他物體表面，提示病房環(huán)境中床單位和其他公共用品的消毒工作需引起醫(yī)務(wù)工作者的重視。護(hù)士手標(biāo)本病原菌檢出率為3.85%，低于其他人員，說明醫(yī)院應(yīng)該加強護(hù)士以外的其他醫(yī)務(wù)人員如護(hù)工、保潔人員等的手衛(wèi)生。ICU病原菌檢出率(4.61%)低于普通病房(10.83%)，可能與ICU患者病情危重、機體抵抗力低，且經(jīng)常進(jìn)行各種侵入性診療，其醫(yī)務(wù)人員醫(yī)院感染相關(guān)理論知識掌握較好及管理能力較強，更重視對ICU環(huán)境的消毒工作有關(guān)。此外，對ICU出入人員進(jìn)行嚴(yán)格控制，也可有效預(yù)防和控制醫(yī)院感染。

研究[12-14]結(jié)果表明，銅綠假單胞菌、陰溝腸桿菌和肺炎克雷伯菌已成為ICU呼吸道和泌尿系統(tǒng)醫(yī)院感染的常見致病菌。本研究分離的75株病原菌主要以G-桿菌為主(占78.67%)，其中銅綠假單胞菌、陰溝腸桿菌和肺炎克雷伯菌居前3位。藥敏試驗結(jié)果顯示，24株銅綠假單胞菌PCR擴(kuò)增實驗檢測mir陽性率100.00%，tem-1陽性率為83.33%，其他3種基因陽性率相對較低,提示mir和tem-1基因在銅綠假單胞菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素(如青霉素類、頭孢菌素類)產(chǎn)生耐藥的過程中發(fā)揮著重要作用[15]。另外，1株銅綠假單胞菌對氨基苷類和喹諾酮類抗菌藥物耐藥，同時發(fā)現(xiàn)該菌株sul1、sul2和aph(3’)-I基因均陽性，說明該菌通過攜帶aph(3’)-I型氨基苷類修飾酶基因?qū)Π被疹愃幬锂a(chǎn)生耐藥[16]。肺炎克雷伯菌的藥敏結(jié)果與大多數(shù)銅綠假單胞菌相似，其中4株肺炎克雷伯菌對哌拉西林均耐藥，部分菌株對硝基呋喃妥因和復(fù)方磺胺甲口惡唑均耐藥，shv和mir陽性率均為100.00%，表明肺炎克雷伯菌主要是通過獲得編碼β-內(nèi)酰胺酶的shv和mir基因?qū)Ζ?內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生耐藥[17]。其中1株肺炎克雷伯菌除對以上抗菌藥物均耐藥外，對美羅培南也耐藥，該菌株來源于ICU的聽診器。診療器械直接接觸患者，一旦有多重耐藥菌定植，傳染給患者的概率較大，將給臨床治療和醫(yī)院感染控制帶來很大困難。

葡萄糖酸氯己定和三氯異氰尿酸為醫(yī)院常用于皮膚黏膜和物體表面消毒的常用消毒劑，MIC和MBC結(jié)果表明，銅綠假單胞菌和陰溝腸桿菌對葡萄糖酸氯己定和三氯異氰尿酸均產(chǎn)生耐藥，且陰溝腸桿菌對葡萄糖酸氯己定的耐藥性高于銅綠假單胞菌；而肺炎克雷伯菌對兩種消毒劑均敏感。臨床工作人員可依據(jù)病原菌選擇合適的消毒劑進(jìn)行消毒。3種病原菌消毒劑耐藥基因qacE△1-sul1檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，銅綠假單胞菌耐藥基因陽性率為79.17%，陰溝腸桿菌耐藥基因陽性率為57.14%，病原菌可以通過攜帶qacE△1-sul1基因?qū)ο緞┊a(chǎn)生耐藥[18]。

醫(yī)院的消毒工作在醫(yī)院感染控制中占重要地位，而醫(yī)院環(huán)境致病菌的控制主要通過使用消毒劑達(dá)到消毒或滅菌效果。隨著多種消毒劑的廣泛使用，消毒劑耐藥菌株也隨之產(chǎn)生，給醫(yī)院日常消毒工作帶來較大困難。當(dāng)病原菌同時出現(xiàn)消毒劑抗性和抗菌藥物耐藥性時，醫(yī)院感染控制工作形勢將更為嚴(yán)峻。因此，醫(yī)院要重視消毒劑在醫(yī)院環(huán)境物體表面和醫(yī)務(wù)人員手消毒過程中的規(guī)范使用，建立專門的消毒管理部門，加強科學(xué)使用消毒產(chǎn)品的管理和培訓(xùn)。使用消毒劑時，參考消毒產(chǎn)品說明書使用劑量和使用范圍，同時根據(jù)醫(yī)院的實際情況，對醫(yī)院環(huán)境的清潔消毒等級進(jìn)行分類，制定標(biāo)準(zhǔn)化操作流程。通過及時了解細(xì)菌對消毒劑敏感性的變化，有針對性地調(diào)整消毒產(chǎn)品的有效使用濃度，必要時可以更換消毒產(chǎn)品種類。只有科學(xué)、合理、有效地使用消毒產(chǎn)品才能確保消毒效果，從而切斷傳播途徑，有效預(yù)防和控制醫(yī)院感染。

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(本文編輯：孟秀娟)

Antimicrobial and disinfectant resistance of pathogens isolated from hospital environmental inanimate surfaces and hands of health care workers

WANGHui-ping,ZHANGHong-jiang,DONGQi,LIUJie,DUANShan,GEJun-qi,WANGzhong-hua,ZHANGZheng

(BeijingChaoyangDistrictCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing100021,China)

Objective To investigate the types, antimicrobial resistance, and disinfectant resistance of pathogens isolated from hospital environmental inanimate surfaces and hands of health care workers (HCWs).Methods Pathogens isolated from hospital environmental inanimate surfaces and hands of HCWs in intensive care units and general wards in 16 hospitals in Beijing were performed bacterial identification, antimicrobial susceptibility testing, and disinfectant resistance testing. The carriage of antimicrobial resistance genes and disinfectant genes in pathogens were also detected.Results A total of 979 specimens were collected from inanimate surfaces and hands of HCWs in 16 hospitals, 75(7.66%)pathogenic strains were isolated, 78.67% of which were gram-negative bacilli. The top 3 pathogens werePseudomonasaeruginosa(P.aeruginosa,n=24),Enterobactercloacae(E.cloacae,n=14), andKlebsiellapneumoniae(K.pneumoniae,n=4). OneP.aeruginosastrain was resistant to aztreonam, gentamycin, tobramycin, ciprofloxacin, and levofloxacin; OneE.cloacaestrain was resistant to piperacillin, 7 strains were resistant to nitrofurantoin; 4K.pneumoniaestrains were all resistant to piperacillin, 2 were resistant to cephalosporins, and 1 was resistant meropenem.P.aeruginosahad 7 drug-resistant genes, positive rate ofmirwas 100.00%;E.cloacaehad 4 drug-resistant genes, positive rates oftem1andshvwere both 100.00%;K.pneumoniaehad 5 drug-resistant genes, positive rates ofshvandmirwere both 100.00%. The resistant rates ofP.aeruginosaandE.cloacaeto chlorhexidine gluconate were 4.17% and 57.14% respectively, to trichloroisocyanuric acid were both 50.00%, positive rates of drug-resistant genes (qacE△1-sul1)were 79.17% and 57.14% respectively；K.pneumoniaehad no resistance to two kinds of disinfectant, dug-resistance gene was not found.Conclusion Multiple common pathogens which can cause healthcare-associated infection exist in hospital environmental inanimate surfaces and hands of HCWs, which are dominated by gram-negative bacilli, pathogens had resistance to antimicrobial agents and disinfectant in different degrees.

inanimate surface; health care worker; hand; pathogen; antimicrobial agent; disinfectant; drug resistance

10.3969/j.issn.1671-9638.2016.12.006

2016-02-16

首都衛(wèi)生發(fā)展科研專項(2011-7023-03)

王會平(1979-)，女(漢族)，河北省石家莊市人，主管檢驗師，主要從事醫(yī)院感染管理研究。

張政 E-mail：anggie_zhzh@126.com

R181.3+2

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1671-9638(2016)12-0921-05