張 帝，張 寧，陳吉剛，楊季芳*

(1.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院， 上海 201306；2. 浙江萬里學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院， 浙江 寧波 315100)

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4株海洋紅球菌產(chǎn)類胡蘿卜素分析及其全基因組測序

張 帝1，2，張 寧2，陳吉剛2，楊季芳*2

(1.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院， 上海 201306；2. 浙江萬里學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院， 浙江 寧波 315100)

以源于東太平洋海水的4株紅球菌分離菌Rhodococcussp. EPR-134、Rhodococcussp. EPR-147、Rhodococcussp. EPR-157和Rhodococcussp. EPR-279為研究對象，開展了菌株的色素提取和色素全波長掃描，并基于全基因組測序分析了4株細菌類胡蘿卜素代謝通路中的相關(guān)基因。色素全波長掃描結(jié)果顯示，菌株EPR-134不具備類胡蘿卜素產(chǎn)生能力，而其它3株紅球菌能夠產(chǎn)生類胡蘿卜素，且所產(chǎn)類胡蘿卜素組分不同?；蚪M分析表明，4個細菌基因組中存在較為完整的促使類胡蘿卜素形成的基因簇。對菌株參與番茄紅素形成的3個關(guān)鍵基因crtE、crtB和crtI的氨基酸序列同源性兩兩比對分析表明，菌株EPR-134 3個基因氨基酸序列與其它3個菌株相應(yīng)基因氨基酸序列同源性最低，這可能是導(dǎo)致該菌株不產(chǎn)類胡蘿卜素的關(guān)鍵原因。該研究結(jié)果為產(chǎn)類胡蘿卜素紅球菌的遺傳改造，以及為產(chǎn)類胡蘿卜素工程菌的構(gòu)建奠定了前期基礎(chǔ)。

海洋紅球菌；類胡蘿卜素；基因組；代謝通路

0 引言

類胡蘿卜素是一類在自然界中普遍存在的有機化學(xué)色素，屬于四萜烯有機分子。類胡蘿卜素具有體內(nèi)清除自由基、抗氧化、抗癌等多重生理作用，在已有的600多種類胡蘿卜素中有10多種已被多數(shù)國家批準使用于各個領(lǐng)域[1-3]。隨著類胡蘿卜素藥用價值的不斷發(fā)現(xiàn)，人類對類胡蘿卜素的種類和產(chǎn)量需求將越來越大。然而，類胡蘿卜素很難用化學(xué)方法合成，迄今為止，只有少數(shù)幾種類胡蘿卜素，如β胡蘿卜素、蝦青素、角黃素等能通過化學(xué)合成商業(yè)生產(chǎn)；通過天然微生物發(fā)酵途徑，也能生產(chǎn)β胡蘿卜素、蝦青素，但由于其產(chǎn)量較低所占市場份額較低[4]。因此尋找胡蘿卜素產(chǎn)量較高且其結(jié)構(gòu)新穎的微生物，并通過分子生物學(xué)手段進一步提高菌株的類胡蘿卜素產(chǎn)量尤為必要。

紅球菌在海洋中廣泛分布，其中大部分類群通過產(chǎn)生色素來抵抗海洋中的不良環(huán)境，其中廣泛存在能夠生產(chǎn)結(jié)構(gòu)新穎的類胡蘿卜的微生物類群。張加蓉 等[3]在北極海水中分離獲得一株產(chǎn)胡蘿卜素的紅球菌Rhodococcossp. B7740。其后，ZHANG et al[5]對該菌株進行了全基因組測序，在其基因組中發(fā)現(xiàn)了參與類胡蘿卜素合成的相關(guān)基因，這與此前趙文恩 等[6]報道類胡蘿卜素合成過程中基因特性表現(xiàn)一致。繼而，陳亞淑 等[7]采用液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)鑒定了B7740類胡蘿卜素的結(jié)構(gòu)特征，表明該菌株產(chǎn)生的類胡蘿卜素類型為甲基萘醌類胡蘿卜素。

近年來，依托多個航次的大洋科學(xué)考察，從深遠海中分離獲得了一些紅球菌，通過菌落培養(yǎng)特征結(jié)合菌株的16S rDNA比較分析，篩選獲得了親緣關(guān)系較遠，菌落顏色明顯不同的4株紅球菌(Rhodococcussp. EPR-134、Rhodococcussp. EPR-147、Rhodococcussp. EPR-157和Rhodococcussp. EPR-279)。本實驗通過對4株紅球菌色素的全波長掃描以及菌株的全基因組測序，分析4株細菌的產(chǎn)類胡蘿卜素能力以及參與類胡蘿卜的相關(guān)基因。研究結(jié)果將為后續(xù)產(chǎn)類胡蘿卜素紅球菌的遺傳改造，以及為產(chǎn)類胡蘿卜素工程菌的構(gòu)建奠定前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種信息

菌株Rhodococcussp. EPR-134、Rhodococcussp. EPR-147、Rhodococcussp. EPR-157和Rhodococcussp. EPR-279分離自中國大洋科學(xué)考察22航次采集的CTD海水樣品，樣品采集站位分別為-2 855 m(1°37.074′N，102°15.415′W)、-1 500 m(1° 44.951′N，102°17.552′W)、-2 855 m(1° 37.074′N，102° 15.415′W)和表層(5° 56.573′S，105° 41.102′W)。菌株保藏于寧波市微生物與環(huán)境工程重點實驗室。

1.1.2 培養(yǎng)基

紅球菌生長培養(yǎng)基配方為：牛肉膏7 g，酵母提取物5 g，葡萄糖5 g，乳糖3 g，加原位陳海水定容到1 L。固體培養(yǎng)基的瓊脂含量為1.5%。

1.1.3 主要試劑

溶菌酶、RNase A和蛋白酶K購自北京全式金生物公司；DNA回收試劑盒、小劑量質(zhì)粒提取試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司；DL2000，λ/HindIII DNA Marker購自Sigma公司；生化鑒定試劑購自青島海博生物公司；主要生化試劑為國藥或者進口分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 紅球菌色素的提取及全波長掃描

紅球菌色素的提取按照MAKUS et al[8]報道的方法進行。既在菌體中加入適量甲醇與丙酮(7∶3,V/V)，避光水浴1～2 h并每間隔20 min輕輕震蕩，離心收集上清液，超微量分光光度計Thermo Scientific NanoDrop 2000進行色素的全波長掃描。

1.2.2 基因組DNA的提取及測序

細菌基因組的提取采用CTAB法[9]，即挑取紅球菌單菌落接種于液體生長培養(yǎng)基，培養(yǎng)5～7 d至菌液適當(dāng)混濁后離心收集菌體，菌體經(jīng)溶菌酶消化和蛋白酶K與SDS裂解后加入CTAB/NaCl預(yù)熱液，待蛋白充分變性后采用酚、氯仿混合液抽提細菌基因組DNA。提取的基因組DNA加入RNAse A去除RNA。基因組測序測定委托杭州邁英圖生物科技有限公司完成，測序平臺為Illumina Hiseq 2000。

1.2.3 基因組分析軟件

通過RNAmmer 1.2軟件[10]預(yù)測rRNA；通過tRNAscan-SE 1.23軟件[11]預(yù)測tRNA區(qū)域；使用CRISPRsII軟件[12]分析規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列；采用IslandViewer軟件[13]預(yù)測基因組島；采用RAST(http://rast.nmpdr.org/)在線數(shù)據(jù)庫[14]對基因組進行注釋；采用Clustal X2[15]、MEGA 5.0[16]進行基因比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色素全波長掃描分析

菌株EPR-134、EPR-147、EPR-157和EPR-279菌落顏色存在明顯差異，其菌落顏色分別為無色、深黃色、淺黃色和深紅色。為了分析4株菌株是否產(chǎn)生類胡蘿卜素，以及分析它們產(chǎn)生的類胡蘿卜素的組成是否存在差異，本實驗通過全波長掃描對4株菌株色素提取物的吸收光譜進行了初步分析，結(jié)果如圖1～圖4所示。類胡蘿卜素代謝過程中形成的多種中間產(chǎn)物具有特征性的吸收光譜，如八氫番茄紅素、番茄紅素、β-胡蘿卜素和γ-胡蘿卜素的最大吸收峰通常位于270～300 nm，445～500 nm、425～480 nm和435～490 nm之間,此外，β-胡蘿卜素(無羥基)、β-隱黃質(zhì)(單羥基)和玉米黃素(雙羥基)實際上具有相同λmax(在乙醇中分別為428 nm、450 nm和476～478 nm)[17]。

圖1 紅球菌Rhodococcus sp. EPR-134色素全波長掃描結(jié)果Fig.1 Full wavelength scanning results of pigments from Rhodococcus sp. EPR-134

圖2 紅球菌Rhodococcus sp. EPR-147色素全波長掃描結(jié)果Fig.2 Full wavelength scanning results of pigments from Rhodococcus sp. EPR-147

圖3 紅球菌Rhodococcus sp. EPR-157色素全波長掃描結(jié)果Fig.3 Full wavelength scanning results of pigments from Rhodococcus sp. EPR-157

圖4 紅球菌Rhodococcus sp. EPR-279色素全波長掃描結(jié)果Fig.4 Full wavelength scanning results of pigments from Rhodococcus sp. EPR-279

對4株紅球菌色素的全波長掃描結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，除了菌株EPR-134色素在250～300 nm范圍內(nèi)不存在明顯吸收峰外，其余3株菌色素在該波長范圍內(nèi)均存在比較明顯的吸收峰。此外，除了菌株EPR-134色素在450～500 nm波長范圍左右未檢測出較大的吸光度外，其余3株菌色素均檢測到明顯的吸收度高值。在450～500 nm范圍左右，EPR-147、EPR-157和EPR-279 3個菌株在不同波長范圍的吸光度存在明顯差異，其吸光度較大的波長主要停留在430和470 nm、450 nm以及400、430和460 nm。

2.2 基因組基本特征分析

EPR-134、EPR-147、EPR-157和EPR-279 4株細菌的基因組草圖的DDBJ/ENA/GenBank數(shù)據(jù)庫收錄號分別為LVCT00000000、LVCU00000000、LVCV00000000和LVCW00000000。對4株菌的基因組草圖基本特征分析表明(表1)，4株細菌的基因組草圖含有的contigs數(shù)量為626～894個，含有的scaffolds數(shù)量為56～94個；GC含量為62.39%～64.83%；4個基因組編碼蛋白的基因數(shù)量為5 464～7 251個，其中5 132～6 782個編碼的蛋白具有已知功能；4株細菌中，菌株EPR-134基因組含有的編碼蛋白及已知功能的蛋白數(shù)量最多，其次為菌株EPR-157；4個基因組含有tRNA、5s rRNA、16s rRNA、23s rRNA和sRNA數(shù)量基本相同。

2.3 參與胡蘿卜素通路的基因分析

目前對原核微生物的類胡蘿卜素的代謝通路研究得已比較透徹。原核生物的類胡蘿卜素代謝通路起始于前體物質(zhì)IPP，繼而通過中間產(chǎn)物的異構(gòu)化、縮合和脫氫以及系列酶的催化，最終形成結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜的類胡蘿卜素[4]。本實驗通過對4株紅球菌的基因組進行分析注釋及類胡蘿卜素代謝通路分析，發(fā)現(xiàn)了參與產(chǎn)類胡蘿卜素形成的相關(guān)基因，這些基因包括八氫番茄紅素合成酶(phytoene synthase，crtB)、八氫番茄紅素脫氫酶(phytoene dehydrogenase，crtI)、八氫番茄紅素脫氫酶相關(guān)蛋白(phytoene dehydrogenase and related protein)、牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthetase，crtE)、β-胡蘿卜素環(huán)化酶(Beta-carotene ketolase)、番茄紅素β環(huán)化酶(lycopene beta cyclase)和Phi-類胡蘿卜素合成酶(phi-carotenoid synthase)，其中Phi-類胡蘿卜素合成酶在菌株EPR-134基因組中缺失，而番茄紅素β環(huán)化酶在菌株EPR-157基因組中缺失。

表1 Rhodococcus sp. EPR-134，Rhodococcus sp. EPR-147，Rhodococcus sp. EPR-157和Rhodococcus sp. EPR-279細菌基因組基本特征

注：Nd為未發(fā)現(xiàn)，可能由于草圖測序過程中g(shù)ap所造成

2.4 類胡蘿卜素代謝通路關(guān)鍵基因crt E，crt B和crt I比較分析

原核微生物類胡蘿卜素代謝通路存在3個關(guān)鍵基因：八氫番茄紅素合成酶(phytoene synthase，crtB)，八氫番茄紅素脫氫酶(phytoene dehydrogenase，crtI)，牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthetase，crtE)，這3個基因?qū)儆陬惍愇於╊愇镔|(zhì)合成酶蛋白家族。crtE主要催化GGPP的合成，crtB主要催化兩個GGPP縮合形成八氫番茄紅素，crtI主要催化八氫番茄紅素進一步脫氫形成番茄紅素。

對菌株間的crtE、crtB和crtI3個基因的氨基酸序列兩兩比較發(fā)現(xiàn)(表2)，菌株EPR-147 3個基因與EPR-279 3個相應(yīng)基因氨基酸同源性均最高(100%)，而 EPR-134 3個基因與另3個菌株的相應(yīng)基因同源性均較低，其中EPR-134crtB、crtI和crtE分別與菌株EPR-157、EPR-147 和EPR-279 相應(yīng)基因氨基酸同源性最低，其同源性分別為49.86%、24.34%和59.37%。

表2 Rhodococcus sp. EPR-134，Rhodococcus sp. EPR-147，Rhodococcus sp. EPR-157和Rhodococcus sp. EPR-279 4 株細菌crt E、crt B和crt I 3個基因氨基酸序列比對

3 討論

本研究涉及的4株紅球菌EPR-134、EPR-147、EPR-157和EPR-279分離自東太平洋海水，其中菌株EPR-279分離自表層海水，而后3株均分離自深層海水。4株菌株菌落顏色存在明顯差異，其顏色與菌株來源的海水深度具有一定的聯(lián)系，即樣品來源越接近表層其菌落的顏色就越深，這可能因為位于海水表層的紅球菌受到環(huán)境因子，尤其是紫外線的脅迫較深層嚴重，生長在表層海水中的紅球菌通過產(chǎn)生色素來抵抗不利環(huán)境。通過顏色的差異，初步推斷這4株菌株在產(chǎn)類胡蘿卜素方面也可能存在差異。對4株菌株的全波長掃描結(jié)果初步證實了這一假設(shè)。菌落無色的菌株EPR-134不具有八氫番茄紅素特征性吸收峰。相比另外3株菌，菌株EPR-134的色素中也未檢測到番茄紅素、β-胡蘿卜素和γ-胡蘿卜素等高等類胡蘿卜素所具有的典型峰值。實驗結(jié)果說明菌株EPR-134不具備產(chǎn)生類胡蘿卜素的能力。全波長掃描結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株EPR-147、EPR-157和EPR-279雖然在450～500 nm范圍左右均有吸光度高值的出現(xiàn)，但是3個菌株無論在吸光度的范圍還是吸光度值的大小上均存在差異，這說明這3株細菌產(chǎn)生的類胡蘿卜素的組成存在差異。

基于產(chǎn)類胡蘿卜素菌株一定存在參與類胡蘿卜素形成的相關(guān)基因的這一事實，我們對4株細菌進行了全基因組測定，尋找參與類胡蘿卜相關(guān)基因的差異。測序結(jié)果表明，除了菌株EPR-134缺失Phi-類胡蘿卜素合成酶以及EPR-157缺失番茄紅素β環(huán)化酶(這可能是由于基因組草圖的gap導(dǎo)致)，其余參與類胡蘿卜素形成的相關(guān)基因均能在4個菌株基因組中找到。尤其值得一提的是，參與番茄紅素形成的3個基因crtE、crtB和crtI在不產(chǎn)類胡蘿卜素的菌株EPR-134中也存在。進一步的序列比對發(fā)現(xiàn)，EPR-134中的crtE、crtB和crtI3個基因的氨基酸序列與其它菌株相應(yīng)基因氨基酸序列的同源性較低，且該同源序列存在于相應(yīng)基因氨基酸序列的高度保守區(qū)，這可能導(dǎo)致了該菌株的3個酶功能喪失，從而使得該菌株不產(chǎn)八氫番茄紅素和番茄紅素。EPR-134crtE、crtB、crtI及其他類胡蘿卜素形成相關(guān)基因的存在是否說明該菌曾經(jīng)能夠產(chǎn)類胡蘿卜素，而在其進化過程中由于生存環(huán)境的改變導(dǎo)致了類胡蘿卜素產(chǎn)生能力的喪失，目前尚不得而知。

本研究基于全波長掃描確定了3株海洋紅球菌能夠產(chǎn)類胡蘿卜素，通過全基因組測序找到了類胡蘿卜素代謝通路中的關(guān)鍵基因，但有關(guān)這些菌株產(chǎn)生的類胡蘿卜素的組成及結(jié)構(gòu)還需依賴更加精確的純化分析，開展類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)特征與構(gòu)效研究，在此基礎(chǔ)上，進一步改造或調(diào)控紅球菌的類胡蘿卜素代謝途徑，構(gòu)建工程菌，以期提高目標類胡蘿卜素的產(chǎn)量。

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Analysis on caroteniod producing of four marine Rhodococcus and its genome sequence determining

ZHANG Di1,2, ZHANG Ning2, CHEN Ji-gang2, YANG Ji-fang*2

(1.CollegeofFisheriesandLifeSciences,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China;2.FacultyofBiological&EnvironmentalScience,ZhejiangWanliUniversity,Ningbo315100,China)

Rhodococcussp. EPR-134,Rhodococcussp. EPR-147,Rhodococcussp. EPR-157 andRhodococcussp. EPR-279 were isolated from water samples of East Pacific Ocean, extraction of pigment and pigment full wavelength scan were carried out in this study. Based on the whole genome sequencing, the related genes in carotenoid metabolic pathways were analyzed. Pigment full wavelength scan results show that strain EPR-134 does not have a kind of caroteniod production ability, while other 3 strains ofRhodococcuscan produce carotenoids, and the carotenoid composition was different. Genome analysis show that there are more complete gene clusters in the 4 bacterial genomes.crtEgene、crtBgene andcrtIgene are very important in the metabolic pathway of caroteniod producing, and by analyzing amino acid sequence homology of these genes in different strains, it is find that amino acid sequences of these genes in the strain EPR-134 share the lowest sequence homology compared with other 3 strains. This may be the key reason why strain EPR-134 can’t produce carotenoid. The results of this study may lay a preliminary foundation for genetic modification of the carotenoid producingRhodococcusand construction of carotenoids producing engineering bacteria.

marineRhodococcus; carotenoid; genome; metabolic pathway

10.3969/j.issn.1001-909X.2016.04.010.

2016-04-25

2016-05-19

國家海洋公益性行業(yè)科研專項項目資助(201405015-5)；寧波市科技公關(guān)重大項目資助(2012C10038)；浙江省重中之重學(xué)科學(xué)生創(chuàng)新計劃項目資助(CX2015007)

張帝(1991-)，男，湖北仙桃市人，主要從事海洋資源微生物方面的研究。E-mail：396358077@qq.com

*通訊作者:楊季芳(1963-)，男，研究員，主要從事海洋微生物生態(tài)過程、海洋微生物資源與環(huán)境研究。E-mail：jfkwlq@163.com

Q93；Q78

A

1001-909X(2016)04-0078-06

10.3969/j.issn.1001-909X.2016.04.010

張帝，張寧，陳吉剛，等.4株海洋紅球菌產(chǎn)類胡蘿卜素分析及其全基因組測序[J].海洋學(xué)研究,2016,34(4):78-83,

ZHANG Di, ZHANG Ning, CHEN Ji-gang, et al. Analysis on caroteniod producing of four marineRhodococcusand its genome sequence determining[J]. Journal of Marine Sciences, 2016,34(4):78-83, doi:10.3969/j.issn.1001-909X.2016.04.010.