王軍

(滁州市第一人民醫(yī)院，安徽 滁州 239000)

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WWOX蛋白與突變型P53蛋白在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及意義

王軍

(滁州市第一人民醫(yī)院，安徽 滁州 239000)

目的 探討WWOX與突變型P53蛋白在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)及癌旁組織中的表達(dá)與腫瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系及兩者表達(dá)的相關(guān)性。方法 用免疫組化elivision法分別檢測(cè)WWOX及突變型P53蛋白在51例NSCLC及20例癌旁正常組織中表達(dá)情況。結(jié)果 WWOX蛋白在NSCLC組織中與癌旁正常組織中表達(dá)的陽(yáng)性率分別為25.49%(13/51)和85.0%(17/20)。突變型P53蛋白在NSCLC組織中與癌旁正常組織中表達(dá)的陽(yáng)性率分別為58.82%(30/51)和10.0%(2/20)。WWOX蛋白的陽(yáng)性率與NSCLC的組織分化程度、病理類型、吸煙、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而與患者的年齡、性別及腫瘤TNM分期無(wú)關(guān)(P>0.05)。突變型P53的陽(yáng)性率與NSCLC的分化程度、腫瘤TNM分期、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，而與患者的年齡、性別、吸煙、病理類型無(wú)關(guān)(P>0.05)。WWOX蛋白、突變型P53在NSCLC中的陽(yáng)性表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-3.33，P<0.05)。 結(jié)論 WWOX蛋白和突變型P53在NSCLC及癌旁組織的表達(dá)有顯著差異。WWOX與突變型P53蛋白與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，并可能起協(xié)同作用，其綜合檢測(cè)對(duì)肺癌的病情判斷和預(yù)后評(píng)價(jià)具有一定價(jià)值。

非小細(xì)胞肺癌； WWOX； P53； 免疫組化

細(xì)胞的生長(zhǎng)是推動(dòng)細(xì)胞周期與抑制其進(jìn)行的基因之間微妙平衡的結(jié)果。任何一種產(chǎn)物的表達(dá)異常，都可能導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)的失控。腫瘤抑制基因是在正常細(xì)胞中存在的一類基因，抑制細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)、增殖而抑制腫瘤的發(fā)生。包含氧化還原酶的WW域基因(WWOX)是2000年由A.K.Bednarek[1]等鑒定出一個(gè)候選的抑癌基因，位于在染色體普通脆性位點(diǎn)FRA16D(16q23-32q24.1)區(qū)域。本研究用免疫組化方法檢測(cè)WWOX 蛋白、突變型P53在NSCLC組織中的表達(dá)，并分析其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系及兩者的相關(guān)性，旨在初步明確二者在NSCLC發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移中的作用，尤其是明確其與NSCLC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，為患者的預(yù)后判斷提供有價(jià)值的分子生物學(xué)指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本及臨床資料 選取蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2009年4月至2011年7月肺癌手術(shù)切除標(biāo)本51例，經(jīng)病理證實(shí)為NSCLC，并取癌旁正常組織20例，年齡41～76歲，中位年齡68.2歲。排除術(shù)前有放射治療或化學(xué)治療史的患者。51例肺癌患者中，男性患者32例，女性患者19例；鱗癌34例，腺癌17例；高分化14例，中分化16例，低分化21例；臨床分期：依據(jù)1997年國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ+Ⅱ期36例，Ⅲ+Ⅳ期15例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的28例，無(wú)轉(zhuǎn)移的23例。

1.2 主要試劑 兔抗人WWOX多克隆抗體(1∶100) ，購(gòu)自?shī)W博森生物醫(yī)藥有限公司，鼠抗人P53多克隆抗體和第二代即用型免組化ElivisionTM plus免疫組化試劑盒，均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法 常規(guī)石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片。采用免疫組織化學(xué)Elivision法，按試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。切片常規(guī)脫蠟入水，3%過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，高壓鍋抗原修復(fù)，加入一抗4 ℃過(guò)夜，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.4 試驗(yàn)結(jié)果的觀察和判斷 本研究中實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均由我院病理科資深醫(yī)師在相同條件下觀察每張切片后對(duì)結(jié)果作出判斷。兔抗鼠WWOX多克隆抗體，陽(yáng)性著色定位于腫瘤細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒。WWOX蛋白表達(dá)的判定[2]：(1)按陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的比例評(píng)分:0分，0～<5%;1分，5%～<25%;2分,25%～<50%;3分,50%～<75%；4分: ≥75%。(2)以著色的程度評(píng)分，1分弱陽(yáng)性，2分中等陽(yáng)性，3分強(qiáng)陽(yáng)性。以上兩者之和>1判斷為陽(yáng)性標(biāo)本。陰性對(duì)照以 PBS代替一抗。突變型P53蛋白陽(yáng)性著色定位于細(xì)胞核，呈棕黃色顆粒狀或團(tuán)塊狀。突變型P53蛋白表達(dá)的判定：參照Takahashi 雙評(píng)分半定量法進(jìn)行評(píng)分[3]，于免疫著色最多區(qū)域計(jì)數(shù)1 000個(gè)肺癌細(xì)胞。按陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占百分比計(jì)分:0分：<10%；1分>10%～<25%；2分25%～<50%；3分50%～<75%；4分≥75%以上。以著色的程度計(jì)分:0分:無(wú)著色；1分黃色；2分棕黃色；3分棕褐色。著色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)之和≥3分即為免疫反應(yīng)陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有資料經(jīng)SPSS l7.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 WWOX蛋白和突變型P53蛋白在NSCLC組織及癌旁正常組織中的表達(dá)情況 本實(shí)驗(yàn)中，WWOX蛋白在NSCLC組織及癌旁正常組織中陽(yáng)性表達(dá)率分別為25.49%(13/51)和85%(17/20)，在癌組織中的表達(dá)低于癌旁組織(χ2=20.851，P<0.01)。突變型P53蛋白在NSCLC組織及癌旁正常組織中陽(yáng)性表達(dá)率為58.8%(30/51)和10.0%(2/20)，突變型P53蛋白在癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=13.833，P<0.01)。

2.2 WWOX蛋白和突變型P53蛋白的表達(dá)與NSCLC各臨床病理因素的關(guān)系 WWOX蛋白在NSCLC組織中，吸煙組明顯低于不吸煙組，鱗癌組明顯低于腺癌組，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組明顯低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，有顯著差異(P<0.05)。WWOX蛋白在高分化、中分化和低分化NSCLC組織中，陽(yáng)性表達(dá)率分別為50.0%、25.0%和 9.5%，三組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中高分化與低分化組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而與病人的性別、年齡、及TNM分期無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。突變型P53蛋白在高分化、中分化和低分化NSCLC組織中，陽(yáng)性表達(dá)率分別為 28.57%、68.75%和71.43%，三組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中高分化與中低分化組間有極顯著性差異(P<0.01)，只有中分化與低分化組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；突變型P53蛋白在TNM分期Ⅰ+Ⅱ與Ⅲ+Ⅳ組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC組織中，突變型P53蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而與病人的性別、年齡、吸煙史及病理類型無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。見(jiàn)表1

表1 WWOX蛋白在NSCLC中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系[n(%)]

2.3 NSCLC組織中WWOX蛋白、突變型P53兩者表達(dá)的相關(guān)性 本組51例NSCLC組織中，WWOX、突變型P53均陽(yáng)性占7.84%(4/51)，WWOX陽(yáng)性、突變型P53陰性占17.65%(9/51)，WWOX陰性、突變型P53陽(yáng)性占50.98%(26/51)，WWOX、突變型P53均陰性占23.53%(12/51)，P<0.05，r=-3.33，兩者的表達(dá)存在負(fù)相關(guān)。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)中在NSCLC組織中WWOX蛋白表達(dá)缺失率為74.51%(38/51)，顯著高于癌旁正常組織中的15%(3/20)，二者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。即使NSCLC組織中有WWOX蛋白表達(dá) ，表達(dá)強(qiáng)度也顯著低于癌旁正常組織，提示在NSCLC的發(fā)生可能與WWOX基因的表達(dá)缺失有關(guān)。WWOX基因在許多腫瘤中表達(dá)減弱或消失，常表現(xiàn)為等位基因的純合性缺失、雜合性缺失和基因突變有關(guān)。其中腫瘤中WWOX 基因發(fā)生雜合性缺失更為常見(jiàn)。發(fā)生位點(diǎn)通常為 D16S3029、D16S3096、D16S504、D16S516及D16S518。在胃癌中雜合性缺失發(fā)生率45.7%[4]、食管鱗狀細(xì)胞癌中發(fā)生率41.4%[5]。這種缺失不僅與腫瘤的發(fā)生呈正相關(guān)性，還與TNM分期密切相關(guān)。甲狀腺癌中WWOX基因282位點(diǎn) (rs3764340)發(fā)生突變，脯氨酸突變?yōu)楸彼幔餡WOX啟動(dòng)子及外顯子超甲基化，顯著提高了發(fā)生甲狀腺癌的幾率[6]。E.M.Lange[7]用全基因組連鎖分析方法發(fā)現(xiàn)WWOX rs1079635位點(diǎn)的突變可能是前列腺癌的易感性因素。K.S.Higginbotham[8]等研究中發(fā)現(xiàn)WWOX基因的錯(cuò)義突變與乳腺癌的臨床分期、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目有顯著相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中WWOX的表達(dá)缺失與組織分化程度，組織學(xué)類型相關(guān)(P<0.05)，與吸煙顯著相關(guān)(P<0.01)。在肺癌組織中，男性鱗癌患者WWOX蛋白表達(dá)要明顯低于女性腺癌患者，吸煙患者明顯低于不吸煙患者，這可能與煙草中的致癌因素促進(jìn)WWOX甲基化所致。給予DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑 5-氮雜-2’-脫氧胞苷(5-Aza-CdR)刺激后可使 WWOX 的表達(dá)逆轉(zhuǎn)，從而抑制細(xì)胞增殖[9]。WWOX蛋白表達(dá)缺失率隨組織學(xué)分級(jí)的增高而顯著提高，提示W(wǎng)WOX基因表達(dá)的缺失與腫瘤的惡性程度有關(guān)。因此WWOX基因表達(dá)水平的下降可視為早期診斷NSCLC的分子標(biāo)記物。C.Lan[10]等的研究顯示卵巢癌的WWOX mRNA的表達(dá)情況與孕激素、雌激素的水平，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移能力以及FIGO分期密切相關(guān)。在WWOX基因剔除小鼠中，出現(xiàn)明顯的生殖系統(tǒng)的形態(tài)學(xué)改變、繁殖能力顯著減退[11]；雌性小鼠下丘腦促卵泡生成素及黃體生成素激素水平顯著降低，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)雄性小鼠輸精管萎縮、生殖功能下降[12]；均提示 WWOX 可能與甾體激素代謝密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的28病例中WWOX表達(dá)缺失為25例(89.29%)，而23例無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例中WWOX表達(dá)缺失僅為13例(56.52%)，WWOX蛋白表達(dá)與NSCLC是否伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的WWOX基因失表達(dá)率明顯高于沒(méi)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，這對(duì)于評(píng)價(jià)NSCLC轉(zhuǎn)移具有指導(dǎo)意義。Y.L.Zhou[13]等通過(guò)基因轉(zhuǎn)染方法，將WWOX基因轉(zhuǎn)染至WWOX基因陰性表達(dá)的肺癌細(xì)胞之后發(fā)現(xiàn)，癌細(xì)胞的增殖能力明顯減弱、凋亡指數(shù)明顯增加、克隆集團(tuán)形成能力和體內(nèi)成瘤能力明顯減弱?？梢?jiàn)，WWOX蛋白表達(dá)的高低與患者的臨床病理及預(yù)后密切相關(guān)。張繼平[14]發(fā)現(xiàn)，WWOX蛋白表達(dá)與腫瘤組織分化程度、浸潤(rùn)深度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。

在本實(shí)驗(yàn)中我們觀察到，突變型P53蛋白在NSCLC中高表達(dá)，而WWOX在NSCLC組織中表達(dá)減低或缺失。WWOX蛋白與野生型P53是壓力刺激感應(yīng)下的凋亡所必須的基因，在介導(dǎo)凋亡途徑中發(fā)揮協(xié)調(diào)作用，在紫外線、茴香霉素UV等誘導(dǎo)凋亡刺激因素等作用下，JNK1瞬時(shí)激活，可抑制WWOX蛋白的表達(dá)，并且P53蛋白穩(wěn)定性下降[15]。在應(yīng)激凋亡過(guò)程中，WWOX蛋白還通過(guò)與JNK1、P53等細(xì)胞因子相互作用形成異源三聚體。因此，聯(lián)合檢測(cè)WWOX基因與P53基因?qū)SCLC的臨床早期診斷、惡性程度和預(yù)后的判定均具有重要的指導(dǎo)作用。

[1] Bednarek AK，Laflin KJ，Daniel RL，et al. WWOX，a novel WW domain-containing protein mapping to human chromosome16q23.3-24.1，a region frequently affected in breast cancer[J].Cancer Res，2000，60(8):2140-2145.

[2] 李秋芳，楊瑞玲，王靜, 等．WWOX蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義[J].實(shí)用癌癥雜志，2008，7(23)：354-359.

[3] Takahashi Y， Kitadai Y， Bucana CD，et a1．Expression of VEGF and its receptor, KDR, correlates with vascularity metastasis and proliferation of human colo cancer[J]．Cancer Res，1995；55(18)：3964-3968．

[4] Guo W, Dong Z, Dong Y, et al. Genetic and epigenetic alterations of WWOX in the development of gastric cardia adenocarcinoma[J]. Environ Mol Mutagen, 2013,54:112-123.

[5] Guo W, Wang G, Dong Y, et al. Decreased expression of WWOX in the development of esophageal squamous cell carcinoma[J]. Mol Carcinog, 2013,52:265-274.

[6] Cancemi L, Romei C, Bertocchi S, et al. Evidences that the polymorphism Pro-282-Ala within the tumor suppressor gene WWOX is a new risk factor for differentiated thyroid carcinoma[J]. Int J Cancer,2011,129:2816-2824.

[7] Lange EM, Beebe-Dimmer JL, Ray AM, et al. Genome-wide linkage scan for prostate cancer susceptibility from the University of Michigan Prostate Cancer Genetics Project: suggestive evidence for linkage at 16q23[J]. Prostate, 2009,69:385-391.

[8] Higginbotham KS, Breyer JP, McReynolds KM, et al. A multistage genetic association study identifies breast cancer risk loci at 10q25 and 16q24[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2012,21:1565-1573.

[9] Matteucci E, Maroni P, Luzzati A, et al. Bone metastatic process of breast cancer involves methylation state affecting E-cadherin expression through TAZ and WWOX nuclear effectors[J]. Eur J Cancer, 2013,49:231-244.

[10] Lan C, Chenggang W, Yulan B,et al.Aberrant expression of WWOX protein in epithelial ovarian canner:a clinicopathologic and immunohistochemical study[J]．Int J Gynecol Pathol，2012,31(2):125-132.

[11] Aqeilan RI, Hagan JP, de Bruin A, et al. Targeted ablation of the WW domain-containing oxidoreductase tumor suppressor leads to impaired steroidogenesis[J]. Endocrinology, 2009,150:1530-1535.

[12] Ludes-Meyers JH, Kil H, Nunez MI, et al. WWOX hypomorphic mice display a higher incidence of B-cell lymphomas and develop testicular atrophy[J]. Genes Chromosomes Cancer, 2007,46:1129-1136.

[13] Zhou YL, Li YC, Shou F, et al．Reversing effect of exogenous WWOX gene expression on malignant phenotype of primary cultured lung carcinoma cells[J]．Chin Med J(Engl),2010,123(5):615-620．

[14] 張繼平．抑癌基因 WWOX 和 p53 在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及臨床意義[J]．天津醫(yī)藥，2012，40(8)：787-789．

[15] Chang NS, Doherty J , Ensign A, et al. WOX1 is essential for tumor necrosis factor, UV light, staurosporine, and P53-mediated cell death, and its tyrosine33-phosphorylated form binds and stabilizes serine 46-phoporylated P53[ J ]. J Biol Chem, 2005, 280 (52): 43100-43108.

Expression of WWOX protein and mutant type P53 protein in non-small cell lung cancer and its clinical significance

WangJun.

TheFirstHospitalofChuzhouCity,Chuzhou239000,China.

Objective To investigate the relationship between the expression and the clinicopathological factors of WWOX and P53 protein in the tissue of non-small cell lung cancer (NSCLC) and paracancerous tissues. Methods Immunohistochemieal staining methods were used to respectively detect the expression of WWOX and P53 protein in 51 cases of NSCLC and 20 cases of the same cases of paracancer tissues of NSCLC. Results The positive rates of expression WWOX and P53 protein was 25.49 % and 58.82% in NSCLC, whereas in adjacent normal lung tissues it was 85.0% and 10.0%.WWOX expression was strongly associated with tumor histologic and histologic grade, lymph node metastasis,smoking and pathological grade(P<0.05). The expression of WWOX was not related with Age, sex and tumor TNM stage (P>0.05). P53 expression was strongly associated with tumor histologic and histologic grade, lymph node metastasis, and TNM stage(P<0.05). The expression of WWOX was not related with Age, smoking, sex and tumor pathological grade(P>0.05). WWOX was negative relation with the expression of P53 in NSCLC carcinomatissues(r=-3.33，P<0.05). Conclusion The expression of wwox protein and P53 protein in NSCLC and paracanerous, there are statistical significantly differences. WWOX and P53 protein might play synergetic role in the process of carcinogenesis of NSCLC. Determination of their expression might be used to evaluate prognosis.

NSCLC； WWOX； P53； Immunohistochemistry

R734.2

A

1000-744X(2016)03-0246-03

2015-10-23)