朱名毅 姚金光 高潔△ 盧露碧 劉津

(1.右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000；2.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西 百色 533000)

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上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)標(biāo)志物在舌鱗癌組織中的表達(dá)及其臨床意義研究

朱名毅1姚金光2高潔1△盧露碧1劉津2

(1.右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000；2.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西 百色 533000)

目的 探討上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志物鋅指E-盒結(jié)合同源異形盒-1(ZEB1)、E-鈣黏蛋白 (E-cadherin)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)在舌鱗癌組織中的表達(dá)及其臨床意義。方法 采用免疫組織化學(xué)Streptavidin-Peroxidase(SP)法檢測(cè)68例舌鱗癌組織、63例舌癌癌旁組織和68例正常舌上皮組織中ZEB1、E-cadherin、和N-cadherin的表達(dá)情況，并分析其表達(dá)與患者臨床病理特征及轉(zhuǎn)移的關(guān)系。結(jié)果 ZEB1、E-cadherin蛋白在舌鱗癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率低于癌旁組織、正常上皮組織(P<0.05)；而N-cadherin蛋白在舌鱗癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織、正常上皮組織(P<0.05)。舌鱗癌組織中ZEB1、E-cadherin和N-cadherin蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率在不同腫瘤TNM分期、腫瘤分化程度及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。舌癌組織中ZEB1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)與E-cadherin蛋白陽(yáng)性表達(dá)呈正相關(guān)；ZEB1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)與N-cadherin陽(yáng)性蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論 ZEB1、E-cadherin和N-cadherin在舌鱗癌演變過程起重要的作用，可能參與了舌鱗癌侵襲和轉(zhuǎn)移的過程。

舌鱗癌； E-盒結(jié)合同源異形盒-1； E-鈣黏蛋白； N-鈣黏蛋白； 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

舌鱗狀細(xì)胞癌是口腔頜面外科最常見的惡性腫瘤之一，其易通過淋巴管和血管發(fā)生轉(zhuǎn)移，手術(shù)難以徹底清除轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞，而且轉(zhuǎn)移的細(xì)胞會(huì)抵抗后續(xù)的放療、化療等治療措施，從而引起腫瘤的復(fù)發(fā)[1]。有研究[2]報(bào)道上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮重要的作用，但上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在舌磷癌轉(zhuǎn)移方面的研究還比較少。我們擬采用免疫組織化學(xué)SP檢測(cè)核轉(zhuǎn)錄因子ZEB1和EMT相關(guān)標(biāo)志物(E-cadherin、N-cadherin)在正常舌黏膜鱗狀上皮組織、舌鱗癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況，并探討它們與舌鱗癌患者臨床病理因素之間的相關(guān)性，為闡明舌鱗癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制及評(píng)價(jià)這些指標(biāo)在舌鱗癌生物學(xué)中的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象及標(biāo)本來源 采用回顧性隊(duì)列研究，收集右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2010年1月至2013年9月手術(shù)切除的存檔舌鱗癌組織標(biāo)本68例。所有病例術(shù)前均未經(jīng)過化療、放療或其他治療措施，組織病理學(xué)證實(shí)均為鱗狀細(xì)胞癌。在68例癌標(biāo)本中選取癌旁組織63例和正常舌鱗狀上皮組織68例(距離腫瘤邊緣5 cm以上)。

1.2 研究方法 手術(shù)切除的標(biāo)本用4%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，按4 μm厚度做石蠟標(biāo)本切片，用SP法嚴(yán)格按照免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行免疫組化，然后在同等光源的條件下對(duì)標(biāo)本免疫組化的結(jié)果在顯微鏡下拍照。陽(yáng)性對(duì)照為已知的組織陽(yáng)性切片，陰性對(duì)照為磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗。鼠抗人ZEB1單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)sigma公司，E-cadherin和N-cadherin鼠抗人單克隆一抗、鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物酶(SP)二抗試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑均購(gòu)自福州邁新公司。

1.3 免疫組化結(jié)果的評(píng)定 ZEB1蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核，E-cadherin和N-cadherin蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)，黃色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，著色明顯高于背景。結(jié)果評(píng)估采用半定量積分法，即根據(jù)每張切片的染色范圍和染色強(qiáng)度進(jìn)行綜合評(píng)定。染色強(qiáng)度評(píng)分：棕褐色(強(qiáng)染色)，3分；黃色或淺棕色(中度染色)，2分；淺黃色(低度染色)，1分；無(wú)黃色(無(wú)染色)，0分。染色范圍評(píng)分：顯微鏡高倍視野下(×400)隨機(jī)每張切片選5個(gè)視野，按陽(yáng)性細(xì)胞占同類細(xì)胞百分比計(jì)分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>50%，3分；25%～50%，2分；5%～<25%，1分；<5%，0分。將兩個(gè)分值相乘做為每個(gè)病例的總積分，總積分>3分為陽(yáng)性，總積分≤3分為陰性。陰性對(duì)照用PBS代替一抗。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)的計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析進(jìn)行計(jì)數(shù)資料的相關(guān)性分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ZEB1、E-cadherin和N-cadherin蛋白的表達(dá)情況 舌鱗癌組中ZEB1和E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)率均低于癌旁組織組和正常舌組織組，三組間陽(yáng)性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；舌鱗癌組中N-cadherin陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織組和正常舌組織組，三組間陽(yáng)性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意(P<0.05)，見表1。

表1 E-cadherin、N-cadherin和ZEB1在舌癌相關(guān)組織中的陽(yáng)性表達(dá)情況

2.2 舌鱗癌組織中ZEB1、E-cadherin和N-cadherin表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 ZEB1、E-cadherin和N-cadherin的陽(yáng)性表達(dá)在不同性別和腫瘤大小間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在不同腫瘤TNM分期、腫瘤分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況下，ZEB1、E-cadherin和N-cadherin 在舌鱗癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這些結(jié)果表明ZEB1、E-cadherin 和N-cadherin蛋白表達(dá)高低可作為舌鱗癌惡性程度、轉(zhuǎn)移情況等臨床病理學(xué)特征的判斷標(biāo)志物之一，見表2。

表2 ZEB1、E-cadherin和N-cadherin表達(dá)與舌鱗癌患者臨床病理特征的關(guān)系

注：組間比較，*P<0.05。

2.3 舌鱗癌組織中ZEB1表達(dá)與E-cadherin和N-cadherin表達(dá)的相關(guān)性 68例舌癌組織中，ZEB1陽(yáng)性18例，陰性50例。在18例ZEB1陽(yáng)性的舌癌組織中E-cadherin陽(yáng)性17例，兩者呈正相關(guān)(r=0.608，P=0.000)；在18例ZEB1陽(yáng)性的舌癌組織中N-cadherin陽(yáng)性3例，兩者呈負(fù)相關(guān)(r=-0.773，P=0.000)。而在50例N-cadherin陽(yáng)性的舌癌組織中E-cadherin陽(yáng)性13例，兩者呈負(fù)相關(guān)(r=-0.608，P=0.000)。

3 討 論

舌鱗癌的預(yù)后與腫瘤組織分化程度、TNM分期、腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素密切相關(guān)，其中腫瘤的病理分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響和評(píng)價(jià)患者預(yù)后的最重要的因素[1]。但是舌鱗癌的轉(zhuǎn)移過程非常復(fù)雜，近年來開始從分子生物學(xué)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)方面，對(duì)參與舌磷癌侵潤(rùn)轉(zhuǎn)移的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、核轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞因子有一些初步的認(rèn)識(shí)，但是，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在舌磷癌轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制還不是很清楚。近幾年發(fā)現(xiàn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，EMT是指上皮源細(xì)胞通過改變細(xì)胞形態(tài)、減少細(xì)胞間黏附等方式，轉(zhuǎn)變成為具有活動(dòng)能力的間質(zhì)細(xì)胞，從而獲得向周圍侵襲和遷移的能力。惡性腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT后，其侵襲和轉(zhuǎn)移的能力得到提高。EMT參與肺癌、前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、肝癌等癌癥的原發(fā)性浸潤(rùn)或繼發(fā)性轉(zhuǎn)移過程[3]。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)錄因子ZEB1主要通過對(duì)E-鈣黏蛋白及N-鈣黏蛋白的調(diào)節(jié)作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞間粘附作用從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，該機(jī)制己在多種腫瘤細(xì)胞中(胰腺癌、大腸癌及乳腺癌)所證實(shí)，轉(zhuǎn)染抑制細(xì)胞的ZEB1和ZEB2后，誘導(dǎo)N-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達(dá)上調(diào)及E-鈣黏蛋白的表達(dá)下調(diào)[4]。E-鈣黏蛋白是鈣依賴性細(xì)胞間粘附分子，對(duì)建立和維持細(xì)胞間連接以及參與細(xì)胞間信號(hào)傳遞有重要作用。作為上皮細(xì)胞主要粘附分子，E-鈣黏蛋白正常表達(dá)時(shí)，上皮細(xì)胞間都保持良好的相互連接，腫瘤細(xì)胞很少發(fā)生轉(zhuǎn)移，但是E-鈣黏蛋白表達(dá)下調(diào)時(shí)則會(huì)引起腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位脫落[5]。N-鈣黏蛋白也是一種跨膜黏附分子，常表達(dá)于神經(jīng)外胚層和中胚層來源的組織，正常上皮組織低表達(dá)。發(fā)生EMT的癌細(xì)胞則出現(xiàn)N-鈣黏蛋白的反常高表達(dá)，從而促使癌細(xì)胞從癌組織塊上脫離，進(jìn)一步與內(nèi)皮或基質(zhì)成分黏附，最終提高腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力[6]。

本研究結(jié)果表明，從正常舌上皮組織到最終的舌鱗癌的發(fā)生發(fā)展過程中，ZEB1和E-cadherin蛋白的表達(dá)依次增高，且在癌旁組織中其表達(dá)就開始下降；但是N-cadherin蛋白的表達(dá)依次增高，且在癌旁不典型增生組織中其表達(dá)就開始上調(diào)，表明上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程可能是舌鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生的早期事件，也就是說上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化參與了舌鱗癌的發(fā)生和形成。

本研究結(jié)果顯示，ZEB1、E-cadherin和N-cadherin蛋白的表達(dá)與病人性別及腫瘤大小無(wú)關(guān)(P>0.05)，而與舌鱗癌TNM分期、組織學(xué)分化及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。ZEB1和E-cadherin在舌癌組織早期(Ⅰ+Ⅱ期)的陽(yáng)性表達(dá)率均高于其在晚期(Ⅲ+Ⅳ期)的陽(yáng)性表達(dá)率，說明舌鱗癌進(jìn)展程度越高，ZEB1和E-cadherin的表達(dá)越低。但是，N-cadherin在舌癌組織早期(Ⅰ+Ⅱ期)的陽(yáng)性表達(dá)率均低于晚期(Ⅲ+Ⅳ期)的陽(yáng)性表達(dá)率，說明舌鱗癌進(jìn)展程度越高，N-cadherin的表達(dá)越高。此外，本研究結(jié)果表明舌鱗癌分化程度越低，其腫瘤的惡性程度越高，ZEB1和E-cadherin蛋白的表達(dá)越低，而N-cadherin蛋白的表達(dá)越高，因此ZEB1、E-cadherin和N-cadherin蛋白表達(dá)的高低可以作為衡量舌鱗癌惡性程度的標(biāo)志之一。我們還發(fā)現(xiàn)，ZEB1、E-cadherin和N-cadherin的表達(dá)也與是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，ZEB1和E-cadherin蛋白在有淋巴轉(zhuǎn)移組中的陽(yáng)性表達(dá)率低于無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移組，而N-cadherin蛋白在有淋巴轉(zhuǎn)移組中的陽(yáng)性表達(dá)率高于無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移組，均有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。因此，我們認(rèn)為ZEB1、E-cadherin和N-cadherin蛋白表達(dá)的高低有可能成為臨床判斷舌鱗癌是否轉(zhuǎn)移的標(biāo)志。

在進(jìn)一步的相關(guān)性分析中我們發(fā)現(xiàn)，ZEB1的表達(dá)與E-cadherin呈現(xiàn)出正相關(guān)，而與N-cadherin的表達(dá)呈現(xiàn)出負(fù)相關(guān)；但是E-cadherin表達(dá)與N-cadherin的表達(dá)呈現(xiàn)出負(fù)相關(guān)。由此我們認(rèn)為，臨床上對(duì)ZEB1、E-cadherin和N-cadherin的聯(lián)合免疫組化檢測(cè)更加有利于準(zhǔn)確判斷舌鱗癌的惡性程度及其轉(zhuǎn)移情況。

綜上所述，我們推測(cè)ZEB1可能通過調(diào)控E-cadherin和N-cadherin在舌鱗癌組織中的表達(dá)，進(jìn)而影響舌鱗癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，但是其確切機(jī)制尚需要進(jìn)一步闡明。因此對(duì)其進(jìn)行更加深入細(xì)致的研究，將有助于預(yù)防舌鱗癌的復(fù)發(fā)，提高舌鱗癌患者的預(yù)后、存活率及生存質(zhì)量等。

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Expression and Clinical Significance of Epithelial-mesenchymal transition (EMT) markers in tongue squamous cell carcinoma

ZhuMingyi1,YaoJinguang2,GaoJie1,LuLubi1,LiuJin2.

1.YoujiangMedicalUniversityForNationalities,Baise533000,China. 2.AffiliatedHospitalofYoujiangMedicalUniversityForNationalities,Baise533000,China.

Objective To investigate the expressions of Epithelial mesenchymal transition (EMT) markers Zinc Finger E-Box Binding Homeobox 1(ZEB1), E-cadherin and N-cadherin in tongue squamous cell carcinoma, and their clinical significances thereof. Methods Immunohistochemical streptavidin-peroxidase method was applied to detect expressions of ZEB1, E-cadherin and N-cadherin in 68 samples of tongue squamous cell carcinoma, 63 samples of tongue cancer adjacent tissues and 68 samples of normal tongue epithelium tissues. Correlations of expressions of ZEB1, E-cadherin and N-cadherin to clinical pathological parameters and metastasis were analyzed in three groups. Results The expression positive rates of ZEB1 and E-cadherin were significantly lower in tongue squamous cell carcinoma than those in tongue cancer adjacent tissues and normal tongue epithelium tissues(P<0.05). The expression positive rates of N-cadherin were significantly higher in tongue squamous cell carcinoma than those in tongue cancer adjacent tissues and normal tongue epithelium tissues(P<0.05). There were statistical significantly differences in the expression of ZEB1, E-cadherin and N-cadherin between different TNM stages, differentiation and lymph node metastasis in tongue squamous cell carcinoma (P<0.05). The positive expression of ZEB1 was positively correlated with the positive expression of E-cadherin. The positive expression of ZEB1 was negatively correlated with the positive expression of E-cadherin. Conclusion ZEB1, E-cadherin and N-cadherin play an important role in evolution of tongue squamous cell, it may be involved in the process of tongue squamous cell invasion and metastasis.

Tongue squamous cell carcinoma； Zinc Finger E-Box Binding Homeobox1； E-cadherin； N-cadherin； Epithelial mesenchymal transition

廣西高等學(xué)校科研項(xiàng)目[桂教科研(2012)10號(hào)]

R739.86

A

1000-744X(2016)03-0243-03

2015-09-21)

△通信作者，E-mail:278793730@qq.com