胡懷強(qiáng) 呂偉 唐吉剛 王樹才 曹秉振

(中國人民解放軍濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東 濟(jì)南 250031)

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氯化甲基汞蓄積對成年大鼠記憶功能及腦組織MBP的影響

胡懷強(qiáng) 呂偉 唐吉剛 王樹才 曹秉振△

(中國人民解放軍濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東 濟(jì)南 250031)

目的 探討氯化甲基汞(MMC)對成年大鼠記憶功能及腦組織髓鞘堿性蛋白(MBP)的影響。方法 通過灌胃給予大鼠不同劑量的MMC，采用水迷宮觀察大鼠記憶功能，采用免疫組織化學(xué)方法觀察不同時間點(diǎn)各組大鼠腦組織MBP的變化。結(jié)果 MMC增加學(xué)習(xí)及記憶潛伏期，大劑量組腦組織MBP與其它各組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論 MMC可引起成年大鼠記憶功能損害，髓鞘破壞可能是其導(dǎo)致記憶損害的機(jī)制之一。

氯化甲基汞； 記憶功能； 髓鞘堿性蛋白； 認(rèn)知障礙

汞是環(huán)境中常見的重金屬毒物之一，經(jīng)過水系食物鏈的生物富集作用及微生物甲基化作用使海產(chǎn)品中含有相當(dāng)量的甲基汞。甲基汞是持續(xù)性有機(jī)污染物，極易透過血腦屏障，具有強(qiáng)烈的神經(jīng)毒性作用[1]。腦組織比其他組織具有更豐富的脂質(zhì)成分，加之耗氧量高，成為汞的主要靶器官之一[2]，為進(jìn)一步觀察氯化甲基汞(MMC)對成年大鼠記憶功能的影響及其機(jī)制，我們觀察了不同劑量MMC在大鼠體內(nèi)蓄積時間不同對其記憶功能和腦組織髓鞘堿性蛋白(MBP)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 成年SPF級雄性SD大鼠120只，體質(zhì)量250～300 g，由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司質(zhì)監(jiān)中心實(shí)驗(yàn)動物室提供，證實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量合格證號：魯動質(zhì)號0005957(山東省實(shí)驗(yàn)動物管理委員會發(fā))，檢疫后備用，自由攝食進(jìn)水。實(shí)驗(yàn)過程中動物飼養(yǎng)及取材均遵守實(shí)驗(yàn)動物管理和保護(hù)的有關(guān)規(guī)定。

1.2 試劑設(shè)備 MMC由德國Labor Dr. Ehrenstorfer Schaefers公司提供，Rabbit MBP由武漢博士德生物工程有限公司提供，濃縮型DAB試劑盒由北京中杉金橋生物科技有限公司提供，Morris水迷宮由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所生產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組造模 實(shí)驗(yàn)動物購買后，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)預(yù)適應(yīng)飼養(yǎng)1周，1周后隨機(jī)分為：對照組、A組[MMC小劑量組(0.5 mg·kg-1·d-1)]、B組[MMC中劑量組(1 mg·kg-1·d-1)]、C組[MMC大劑量組(2 mg·kg-1·d-1)]共四個大組，每個大組30只；并根據(jù)觀察時間每組又分為1周、2周、4周共三個亞組，每個亞組動物數(shù)為10只。正常對照組：自由飲食，不做任何干預(yù)。氯化甲基汞小、中、大劑量組組分別給予不同劑量氯化甲基汞。

1.3.2 行為記憶觀察 每周稱量各組大鼠體質(zhì)量并做記錄，觀察各組大鼠進(jìn)食量、反應(yīng)能力及毛色變化。Morris水迷宮作為檢測實(shí)驗(yàn)大鼠學(xué)習(xí)記憶水平的工具，其測試程序主要包括定位航行試驗(yàn)和空間探索試驗(yàn)兩個部分。

1.3.3 免疫組化檢測腦組織MBP 取各組大鼠腦組織，用4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，取相同層面切片用免疫組織化學(xué)染色方法觀察腦組織MBP的陽性表達(dá)，運(yùn)用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文報告分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，記錄平均陽性細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 MMC對大鼠記憶功能的影響

2.1.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)潛伏期研究 結(jié)果見表1。

組別1周2周4周對照組25．21±2．1326．18±3．7226．85±4．16A組28．23±4．6832．34±5．73△42．87±6．53▲★B組30．73±5．4441．57±7．96▲◆▼65．35±8．23▲◆★C組35．26±6．31▲◇59．82±7．33▲◆※▼———

注：與同時間點(diǎn)正常對照組比較，△P<0.05、▲P<0.01；與同時間點(diǎn)小劑量組比較，◇P<0.05、◆P<0.01；與同時間點(diǎn)中劑量組比較，※P<0.01；組內(nèi)與1周時比較，▽P<0.05、▼P<0.01；組內(nèi)與2周時比較，☆P<0.05、★P<0.01。

2.1.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)記憶潛伏期研究 結(jié)果見表2。

組別1周2周4周對照組16．35±3．4816．72±4．0116．72±4．01A組20．67±4．8226．33±5．24▲▽37．48±7．37▲★B組29．31±5．21▲◆35．84±6．78▲◆▽43．19±7．56▲◇☆C組33．68±5．62▲◆42．25±6．83▲◆※▼———

注：與同時間點(diǎn)正常對照組比較，▲P<0.01；與同時間點(diǎn)小劑量組比較，◇P<0.05、◆P<0.01；與同時間點(diǎn)中劑量組比較，※P<0.05；組內(nèi)與1周時比較，▽P<0.05、▼P<0.01；組內(nèi)與2周時比較，☆P<0.05、★P<0.01。

2.2 MMC對大鼠腦組織MBP的影響 免疫組織化學(xué)染色檢測大鼠腦組織MBP的表達(dá)，顯示陽性細(xì)胞表達(dá)呈棕黃色，結(jié)果見表3。

組別1周2周4周對照組32．18±3．8330．54±2．9633．76±4．01A組29．43±3．9626．42±4．17△20．17±3．87▲★B組27．37±3．28△22．19±3．42▲◇▼16．48±3．03▲◇★C組25．85±3．77▲17．68±3．92▲◆※▼10．11±4．36▲◆●★

注：與同時間點(diǎn)正常對照組比較，△P<0.05、▲P<0.01；與同時間點(diǎn)小劑量組比較，◇P<0.05、◆P<0.01；與同時間點(diǎn)中劑量組比較，※P<0.05、●P<0.01；組內(nèi)與1周時比較，▼P<0.01；組內(nèi)與2周時比較，★P<0.01。

3 討 論

神經(jīng)行為測試是近年來發(fā)展起來的一種評價神經(jīng)毒物所致神經(jīng)系統(tǒng)損傷的方法。Morris水迷宮應(yīng)用于學(xué)習(xí)記憶腦機(jī)制研究[3]，在空間定位航行試驗(yàn)中，通過對其所處環(huán)境標(biāo)志物體的空間位置進(jìn)行比較、評價，從而學(xué)會尋找水迷宮中的平臺，并爬上平臺以逃避溺死，獲取經(jīng)驗(yàn)(學(xué)習(xí))的能力以逃避潛伏期即從大鼠入水至找到并爬上平臺所需時間來表示?？臻g搜索能力是以撤除平臺后大鼠經(jīng)過水迷宮平臺原址的次數(shù)來表示，因?yàn)樾枰_地定位原平臺所在的位置，故可作為大鼠保存經(jīng)驗(yàn)(記憶)的能力的敏感指標(biāo)[4]。因此本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用Morris水迷宮來研究學(xué)習(xí)記憶能力的改變是比較恰當(dāng)?shù)摹１狙芯勘砻?，MMC暴露組的學(xué)習(xí)潛伏期和記憶潛伏期較正常對照組明顯延長，同一觀察時間點(diǎn)給予MMC的劑量越大其潛伏期越長，同一組的MMC中毒大鼠隨著時間的延長其學(xué)習(xí)、記憶潛伏期均明顯延長，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析均有顯著性差異，由此可見大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力與體內(nèi)汞的蓄積量呈顯著劑量效應(yīng)關(guān)系。結(jié)合不同訓(xùn)練段數(shù)的各組大鼠游泳路線圖可以發(fā)現(xiàn)，對照組能較迅速地找到平臺，其游泳距離也最短，可見對照組定位能力和趨向性較好，游泳軌跡以目標(biāo)象限為主；而汞暴露組定位能力和趨向性較差，游泳軌跡比較分散，找到平臺的時間更長，游程也更長，并存在劑量效應(yīng)關(guān)系。本研究與S.B.Fountain[5]等研究結(jié)果相似，甲基汞暴露可顯著抑制海馬區(qū)突觸傳遞及其興奮性，并且存在劑量效應(yīng)關(guān)系。劉蘋[6]等研究也發(fā)現(xiàn)低濃度汞(甲基汞)可導(dǎo)致動物的神經(jīng)行為發(fā)生變化，出現(xiàn)學(xué)習(xí)和記憶能力的下降。

MBP是神經(jīng)髓鞘特有的膜蛋白，廣泛存在于少突膠質(zhì)細(xì)胞及其髓鞘中的骨架蛋白，是維持神經(jīng)元髓鞘結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，具有屏閉、支持、營養(yǎng)等作用。髓鞘的產(chǎn)生和維持對于大腦正常行使功能是必要的。研究[7]表明，血管性癡呆患者存在髓鞘損傷性病變，并且其MBP含量高低與髓鞘損傷嚴(yán)重程度密切相關(guān)。因此，MBP水平變化可反映腦白質(zhì)少突膠質(zhì)細(xì)胞髓鞘損傷的嚴(yán)重程度，是CNS損害和急性脫髓鞘的客觀生化指標(biāo)[8]，對判斷病情嚴(yán)重程度和預(yù)后有重要意義。在本研究中我們動態(tài)觀察了不同劑量下在不同時間點(diǎn)氯化甲基汞對大鼠腦組織MBP的影響，結(jié)果顯示隨著汞在大鼠體內(nèi)的蓄積其腦組織中的MBP明顯減少，且具有劑量時間依賴性，并具有統(tǒng)計學(xué)意義，表明汞可以明顯損害中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘堿性蛋白。研究表明氯化甲基汞可顯著損害少突膠質(zhì)細(xì)胞髓鞘，這可能是導(dǎo)致大鼠記憶功能障礙的主要機(jī)制之一。

[1] Rocha JB, Rocha LK, Emanuelli T, et al. Effect of mercuric chloride and lead acetate treatment during the second stage of rapid post-natal brain growth on the behavioral response to chlorp romazine and on delta-ALA-D activity in weaning rats [J]. Toxicol Lett, 2001, 125(1-3): 143-150.

[2] 吳敵，林世和，趙節(jié)緒，等. 金屬汞中毒顆粒在鼠腦神經(jīng)細(xì)胞的沉積[J]. 中華神經(jīng)科雜志，2000，33(2)：110-111.

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[4] Fischer W, Chen KS, Gage FH, et al. Progressive decline in spatial learning and integrity of forebrain cholinergic neurons in rats during aging [J]. Neurobiol Aging, 1992, 13(1): 9-23.

[5] Fountain SB, Rowan JD. Effects of sequential exposure tomultiple concentrations of methylmercury in the rat hippocampal slice [J]. Ecotoxicol Environ Saf, 2000, 47(2): 130-136.

[6] 劉蘋，李健，吳錫南，等. 甲基汞對親仔兩代大鼠的神經(jīng)行為毒性效應(yīng)[J]. 環(huán)境與健康雜志，2001，18(6)：339-342.

[7] 文志華，魏佳軍，袁先厚，等. 血管性認(rèn)知損害與S100β和髓鞘堿性蛋白的關(guān)系[J]. 中國腦血管病雜志，2007，4(1)：10-13.

[8] Wunderlich MT, Wallesch CW, Goertler M. Release of neurobiochemical markers of brain damage is related to the neurovascular status on admission and the site of arterial occlusion in acute ischemic stroke [J]. J Neurol Sci, 2004, 227(1): 49-53.

Effect of Methyl-mercuric Chloride on Memory and MBP of Adult Rats in Different Courses

HuHuaiqiang,LvWei,TangJigang,WangShucai,CaoBingzhen.

DepartmentofNeurology,TheGeneralHospitalofJinanMilitaryCommand,Jinan250031,China.

Objective To investigate the effect of methyl-mercuric chloride (MMC) on memory and MBP of adult rats in different courses. Methods The changes of memory were observed by water maze. The changes of MBP were detected by immunohistochemistry at different times after administrating various dosages. Results MMC significantly increased the latency of study and memory. MMC significantly inhibited MBP, which of large dose group there were statistical significantly differences compared with those of other groups (P<0.01). Conclusion MMC can impair the memory of adult rats, myelin sheath damage is one of the mechanism, which effects are dose and time dependent.

Methyl-mercuric chloride; Memory; Myelin basic protein; Cognitive impairment

中國博士后科學(xué)基金資助(項目編號：20080431409)

R114

A

1000-744X(2016)03-0241-02

2015-10-27)

△通信作者,E-mail：cbzxia2011@163.com