李永寧 肖晶晶 趙建勇

(貴州醫(yī)科大學，貴州 貴陽 550004)

?

Caspase-3及Cleaved-Caspase-3在氟中毒大鼠肝臟中表達

李永寧 肖晶晶 趙建勇△

(貴州醫(yī)科大學，貴州 貴陽 550004)

目的 探討氟中毒大鼠肝臟組織中Caspase-3及Cleaved-Caspase-3的表達情況。方法 選用36只健康SD大鼠分為對照組、低氟組、高氟組(飲用含氟量分別為 <1 mg/L、5 mg/L及50 mg/L的自來水)，每組12只(雌雄各半)。飼養(yǎng)6個月后，股動脈放血處死，氟離子電極法檢測大鼠尿氟含量；自動血生化分析儀檢測大鼠肝功能；免疫組織化學法和蛋白印記(Western blot)法檢測Caspase-3及Cleaved-Caspase-3蛋白表達水平。結(jié)果 低氟組、高氟組大鼠尿氟[(1.85±0.13)、(2.23±0.10) mg/L均高于對照組[(1.63±0.11) mg/L] (P<0.05)；低、高氟組大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶及谷草轉(zhuǎn)氨酶活性[(48.66±5.55)、(68.17±8.39)U/L及(142.57±16.21)、(165.89± 28.26)U/L]均高于對照組[(38.49±2.98)、(117.98±9.88) U/L](P<0.05)；高過劑量氟組Caspase-3及Cleaved-Caspase-3蛋白表達[(98.08±13.08)、(106.33±9.14)]明顯高于對照組[(53.92±6.36)、(59.78±7.54)](P<0.05)。 結(jié)論 氟可促進Caspase-3及Cleaved-Caspase-3蛋白的表達，其可能參與慢性氟中毒所致肝臟損傷發(fā)病過程。

氟中毒； Caspase-3； Cleaved-Caspase-3； 細胞凋

氟不僅可以導致骨質(zhì)疏松、骨硬化、骨軟化等一系列的骨相損害，還能造成中樞神經(jīng)、心血管、消化、內(nèi)分泌等多系統(tǒng)的非骨相損害[1]。肝臟是人體最重要解毒器官，能將體內(nèi)毒物變?yōu)闊o毒或水溶性大的物質(zhì)，隨消化或泌尿系統(tǒng)排出體外，基于肝臟的解毒作用，氟對肝組織的損害越來越被研究者所重視[2],氟中毒時肝細胞索排列紊亂，細胞膜消失，細胞出現(xiàn)水樣變性或脂肪樣變，細胞核出現(xiàn)固縮、碎裂、溶解等壞死的形態(tài)學改變。本研究主要檢測氟中毒大鼠肝臟組織中Caspase-3及Cleaved-Caspase-3的表達情況，探討氟致肝臟損傷的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 氟化鈉(NaF)分析純(天津化學試劑有限公司)；GTVisionTM Ⅱ 型免疫組化試劑盒(上海基因科技有限公司)；兔抗鼠Caspase-3、Cleaved-Caspase-3單克隆抗體(美國CST公司)；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgGⅡ抗(美國Bio-Rad公司)；Western制膠一套(上海碧云天生物技術(shù)研究所)；化學發(fā)光試劑(ECL)(美國Millipore公司)。

1.2 分組與處理 SD大鼠36只[(合格證號：ISCXK(黔)2012-0001)由貴州醫(yī)科大學實驗動物中心提供]常規(guī)飼養(yǎng)一周后，按其體質(zhì)量隨機分為三組：對照組、低氟組、高氟組(飲用含氟量分別為<1 mg/L,5 mg/L及50 mg/L的自來水)，每組12只，組內(nèi)雌雄各半并分籠飼養(yǎng)，定時喂養(yǎng)普通鼠飼6個月后進行后續(xù)試驗。

1.3 指標與方法 代謝籠收集大鼠24 h尿液后，采用氟離子選擇電極法測定尿氟水平。采用自動生化儀檢測各組大鼠血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的活性及白蛋白(ALB)的含量。石蠟切片常規(guī)脫蠟后將肝臟組織切成3 μm的切片，HE染色后在光鏡下觀察其形態(tài)學改變。蛋白表達檢測：(1)免疫組化法：按照GTVisionTMⅡ 型免疫組化試劑盒操作方法，使用兔抗鼠Caspase-3及Cleaved-Caspase-3單克隆抗體測定肝組織中Caspase-3及Cleaved-Caspase-3蛋白的表達，其工作濃度1∶200，以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為空白對照。陽性反應為細胞漿及細胞核出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒，采用BIOMIAS-2001分析軟件測定每張標本中Caspase-3、Cleaved-Caspase-3積分光密度(IOD)，IOD值高低與陽性表達成正比。(2)Western blot法：提取大鼠肝臟組織蛋白，采用二喹啉甲酸法進行蛋白定量，蛋白經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯膜，用5%牛血清蛋白封閉1 h，4 ℃孵育一抗Caspase-3、Cleaved-Caspase-3(1∶1 000)過夜，次日室溫孵育二抗(1∶3 000)1 h，曝光顯影，以β-actin蛋白條帶作為內(nèi)參照進行Image J灰度分析。

2 結(jié) 果

2.1 染氟大鼠尿氟情況 對照組、低氟組、高氟組大鼠尿氟分別為[(1.63 ±0.11) 、(1.85 ± 0.13)、(2.23 ± 0.10) mg/L] ，與對照組比較，染氟組尿氟含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 氟對大鼠肝功能的影響 與對照組比較，染氟組ALT及AST的活性隨染氟劑量的增加而升高，而ALB含量隨染氟劑量的增加而降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

組別ALT/(U/L)AST/(U/L)ALB/(g/L)對照組38．49±2．98117．98±9．8841．31±4．82低氟組48．66±5．55a142．57±16．21a34．83±2．30a高氟組68．17±8．39ab165．89±28．26ab31．18±2．47a

注：與對照組比較，aP<0.05；與5 mg/L染氟組比較，bP<0.05。

2.3 染氟肝組織的病理學改變 光鏡下見對照組肝細胞排列整齊，以中央靜脈為中心呈放射狀分布；低氟組肝細胞索排列紊亂，肝細胞胞漿呈水樣變性；高氟組肝臟可見肝索紊亂，細胞高度水腫呈氣球樣改變，有的肝細胞膜消失或可見核固縮，見圖1。

2.4 表達情況 免疫組化結(jié)果顯示，Caspase-3及Cleaved-Caspase-3陽性表達信號主要位于中央靜脈和匯管區(qū)周圍的肝細胞胞漿中，呈棕黃色細顆粒。對照組肝組織中Caspase-3及Cleaved-Caspase-3蛋白表達較少，細胞著色淺淡；隨染氟濃度增加Caspase-3及Cleaved-Caspase-3蛋白表達的細胞數(shù)目增多，顏色加深；差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2；Western blot結(jié)果顯示，低、高染氟組肝組織中Caspase-3及Cleaved-Caspase-3蛋白表達較對照組增加，且高氟組高于低氟組，見圖2。

組別nCaspase?3Cleaved?Caspase?3正常組1253．92±6．3659．78±7．54低氟組1284．77±8．73a81．22±9．07a高氟組1298．08±13．08ab106．33±9．14ab

注：與對照組比較，aP<0.05；與5 mg/L染氟組比較，bP<0.05。

3 討 論

氟是一種毒物，主要以化合物形式存在于自然界中。進入機體的氟大部分經(jīng)腎臟排泄，因此尿氟的含量可間接反映機體的氟負荷量。氟中毒時可累及消化、生殖等多個系統(tǒng)，而肝臟是受損的重要臟器。肝臟受損時肝功能異常，主要表現(xiàn)在肝酶及蛋白合成異常。本實驗基于參考文獻[3]，采用5、50 mg/L氟濃度水飼養(yǎng)大鼠6個月后發(fā)現(xiàn)尿氟及AST和ALT活性明顯高于對照組，而ALB含量明顯低于對照組，且染氟肝組織出現(xiàn)變性壞死等病理學改變，此結(jié)果與I.Blaszegk[4]等研究較一致，表明慢性氟中毒肝損傷的模型制備成功。

細胞凋亡學說是研究氟中毒機制重要的學說之一。細胞凋亡是一種多種基因調(diào)控的主動程序化死亡過程，主要由線粒體通路、死亡受體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路構(gòu)成。Caspase家族又稱半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶，可通過線粒體通路、死亡受體通路調(diào)節(jié)細胞凋亡，Caspase-3為核心成員，是調(diào)節(jié)細胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶，因此也被稱為“死亡蛋白酶”，是目前已知的凋亡最后執(zhí)行因子，在腫瘤、缺血再灌注損傷等許多疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[5]。Cleaved-Caspase-3是Caspase-3活化過程中經(jīng)剪切產(chǎn)生的活性片段，其表達程度可反映Caspase-3的活性和細胞凋亡情況。本實驗免疫組化及Western結(jié)果染氟組中Caspase-3及Cleaved-Caspase-3蛋白表達明顯高于正常組，提示氟化物可誘導Caspase-3及Cleaved-Caspase-3蛋白的表達從而促進肝細胞的凋亡，此結(jié)果與相關(guān)報道[6]相一致。研究還發(fā)現(xiàn)Caspase-3與Bcl-2、Bax及與Fas等信號通路存在相互作用[7]，由此推測氟引起肝細胞的凋亡是這些信號通路的共同結(jié)果，其具體的調(diào)節(jié)途徑有待進一步的研究。

(本文圖1，圖2見封三)

[1] 樓迪棟，張凱琳，秦雙立，等. 慢性氟中毒對大鼠肝、腎和腦皮質(zhì)細胞線粒體DNA 4.8 Kb的影響[J]. 中華地方病學雜志，2013，32(2)：121-124.

[2] 朱志堅，于燕妮. JAK/STAT信號通路在地氟病肝損害中的機制研究[J]. 貴州醫(yī)藥，2015， 39(9)：854-856.

[3] Zhao L, Yu Y, Deng C. Protein and mRNA expression of Shh, Smo and Gli1 and inhibition by cyclopamine in hepatocytes of rats with chronic fluorosis[J]. Toxicol Lett,2014,225(2):318-324.

[4] Blaszeyk I, Birkner E, Kasperczyk S. Influence of methionine on toxicity of fluoride in the liver of rats[J]. Biol Trace Elem Res,2011,139(3):325-331.

[5] Kang SJ，Sanchez I,Jing N，et a1. Dissociation between neurodegeneration and caspase-1 1-mediated activation of caspase-1 and caspase-3 in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis[J]. Neurosci，2003，23(13)：5455-5460.

[6] Bin Fan, Yanni Yu, Ying Zhang.PI3K-Akt1 expression and its significance in liver tissues with chronic fluorosis[J].Int J Clin Exp Pathol，2015，8(2):1226-1236.

[7] 賀凌飛，鄒志輝，鐘苑芳，等. 氟對大鼠切牙細胞Fas信號通路的作用研究[J]. 中華口腔醫(yī)學雜志，2011,46(6)：347-350.

The expression of Caspase-3 and Cleaved-Caspase-3 in liver of the fluorosis rats

LiYongning,XiaoJingjing,ZhaoJianyong.

DepartmentofHepatobiliarySurgery，GuizhouMedicalUniversity，Guiyang550004，China.

Objective To explore the role of Caspase-3 and Cleaved-Caspase-3 in rats liver damaged by excessive fluorine. Methods Thirty-six healthy Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into three groups which were control group (drunk water containing NaF<1 mg/L), low and high fluorosis groups (drunk water containing NaF of 5 mg/L and 50 mg/L). After 6 months of experiment treatment, the fluorine contents of urine were detected by fluorin-ion electrode method. The rats liver function determined by automatic blood chemical analyzer. The protein expression of Caspase-3 and Cleaved-Caspase-3 were detected by immunohistochemistry (IHC) and protein imprinting (western blot). Results The fluorine contents of urine in low and high-dose fluoride groups [(1.85±0.13), (2.23±0.10) mg/L] was higher than control group [(1.63±0.11) mg/L] (P<0.05). The activity of serum ALT and AST in low and high-dose fluorosis group [(48.66±5.55), (68.17±8.39) U/L and (142.57±16.21), (165.89±28.26)U/L] was higher than control group [(38.49±2.98), (117.98±9.88) U/L] (P<0.05). The protein expression of Caspase-3 and Cleaved-Caspase-3 [(98.08±13.08), (106.3±9.14)] in high-dose fluorosis group were significantly increased than control group [(53.92±6.36), (59.78±7.54)] (P<0.05). Conclusion Caspase-3 and Cleaved-Caspase-3 may become the pathogenesis of liver damage in chronic fluorosis.

Fluorosis； Caspase-3； Cleaved-caspase-3； Apoptosis； Liver

貴陽市科學技術(shù)計劃項目上[(2010)筑科農(nóng)合字第1-社-19號]

R392.11

A

1000-744X(2016)03-0239-02

2015-11-22)

△通信作者，E-mail:18985018365@qq.com