馬竹君 馮紅超 宋宇峰 高瓊 孫昊軒

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽 550004；2.貴陽市口腔醫(yī)院，貴州 貴陽 550002；3.貴州省食品藥品監(jiān)督管理局，貴州 貴陽 550000；4.貴州醫(yī)科大附屬口腔醫(yī)院頜面外科；5.河北省眼科醫(yī)院口腔頜面外科，河北 邢臺 054001)

?

β-catenin在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義

馬竹君1馮紅超2△宋宇峰3高瓊4孫昊軒5

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽 550004；2.貴陽市口腔醫(yī)院，貴州 貴陽 550002；3.貴州省食品藥品監(jiān)督管理局，貴州 貴陽 550000；4.貴州醫(yī)科大附屬口腔醫(yī)院頜面外科；5.河北省眼科醫(yī)院口腔頜面外科，河北 邢臺 054001)

目的 檢測口腔鱗癌中上皮間質(zhì)化(EMT)相關(guān)蛋白和β-連環(huán)素(β-catenin)的表達(dá)初步探討其意義。方法 用免疫組法檢測32例口腔鱗癌組織及正常組織中上皮標(biāo)記物：上皮-鈣黏蛋白(E-cad)及細(xì)胞角蛋白(CK)、β-catenin的表達(dá)。結(jié)果 口腔鱗癌組β-catenin表達(dá)明顯高于正常組織組(P<0.05)，CK及E-cadherin表達(dá)明顯低于正常組織組(P<0.05)；β-catenin在T4+T3組的表達(dá)顯著高于T1+T2組(P<0.05)，E-cadherin的表達(dá)明顯低于T1+T2組(P<0.05)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組β-catenin表達(dá)高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P<0.05)，E-cadherin、CK表達(dá)低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P<0.05)。結(jié)論 口腔鱗癌組織中存在EMT現(xiàn)象，E-cadherin、CK及β-catenin在OSCC與正常組織表達(dá)中有差異，β-catenin可能參與OSCC組織發(fā)生EMT的進(jìn)程，促進(jìn)口腔鱗癌浸潤及轉(zhuǎn)移。

口腔鱗癌； β-連環(huán)素； 細(xì)胞角蛋白； 上皮-鈣黏蛋白； 上皮間質(zhì)化； 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)是口腔最常見的惡性腫瘤，其頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是目前臨床上腫瘤致死的主要因素[1]，嚴(yán)重威脅人類的生命健康。上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，指上皮細(xì)胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有較高侵襲能力的間質(zhì)表型過程[2]。近年來，國內(nèi)外對于EMT的研究開始向腫瘤領(lǐng)域延伸。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組化PV二步法檢測正?？谇唤M織和OSCC組織中β-catenin和EMT標(biāo)記物的表達(dá)，初步探索β-catenin與EMT現(xiàn)象的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 收集貴醫(yī)附院口腔頜面外科2009年7月至2015年7月手術(shù)切除的，術(shù)前未采用任何針對腫瘤的治療(如放療、化療等),經(jīng)組織蠟塊保存完好的口腔鱗癌標(biāo)本。均經(jīng)常規(guī)病理檢查確診為鱗狀細(xì)胞癌患者32例(男23例，女9例)，年齡42～78歲，平均60歲；高分化21例，中低分化11例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移13例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例，無發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者。另設(shè)12例口腔黏膜正常組織作對照。

1.2 試劑 小鼠抗人細(xì)胞角蛋白(廣譜)單克隆抗體、小鼠抗人E-cadherin單克隆抗體及DAB顯色試劑盒、免疫組化PV試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，小鼠抗人β-catenin單克隆抗體購自恩晶生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 免疫組織化學(xué)染色行PV二步法，組織蠟塊經(jīng)厚5 μm連續(xù)切片，脫蠟水化后，檸檬酸抗原修復(fù)液高壓熱處理修復(fù)抗原，3%去離子水封閉內(nèi)源性過氧化物酶分別加入：β-catenin(1∶50)、E-cadherin(1∶100)、細(xì)胞角蛋白(1∶100)一抗工作液、4 ℃孵育過夜。加入生物素化二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封固。PBS代替一抗，做陰性對照。實(shí)驗(yàn)程序嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行。另取一張切片行蘇木精-伊紅(HE)染色。

1.4 結(jié)果判定 免疫組織化學(xué)及原位雜交每例切片隨機(jī)選擇10個視野(放大200倍)拍照。參考相關(guān)文獻(xiàn)，以Imagepro-plus圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行平均光密度(MOD)分析，分析中進(jìn)行了光密度校準(zhǔn)及空間標(biāo)定，按照陽性表達(dá)在照片中的范圍在照片中畫出測量區(qū)域，即總面積(Area Sum)，讀取積分光密度(IOD)數(shù)值，作為這張照片的累積光密度值。MOD計(jì)算方法為MOD=IOD/Area(Sum)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)，β-catenin、E-cad、CK光密度不滿足正態(tài)分布，參數(shù)檢驗(yàn)(P>0.05)，故采用中位數(shù)及四分位間距M(P25，P75)表示。正常組織與口腔鱗癌組織光密度的差異及不同臨床特征下β-catenin、E-cad、CK光密度比較，采用Mann-Whitney非參數(shù)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05，P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 β-catenin、E-cadherin、CK在OSCC及正常組織中的表達(dá) β-catenin在正?？谇击[狀上皮組織細(xì)胞質(zhì)中少量或幾乎無表達(dá)(圖1A)，在OSCC組織細(xì)

胞質(zhì)中表達(dá)增多，呈棕黃色或棕褐色顆粒，在有的OSCC組織中存在細(xì)胞核的表達(dá)(圖1B)。E-cad陽性信號主要定位于正常組織上皮細(xì)胞(圖1C)，在OSCC組織中多表達(dá)于有細(xì)胞極性的鱗狀上皮部分，少數(shù)呈淡黃色的不均質(zhì)點(diǎn)狀分布，多數(shù)癌巢組織無著色表現(xiàn)(圖1D)；CK主要定位于細(xì)胞質(zhì)，與正常組織表達(dá)相比(圖1E)，在癌巢部位的表達(dá)較低(圖1F)。

圖1 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 (SP×20)

2.2 β-catenin、E-cad、CK在OSCC與正常組織表達(dá)的MOD值 β-catenin、E-cad、CK在OSCC與正常組織表達(dá)的MOD值見表1，在OSCC組織中，E-cad及CK的表達(dá)明顯低于正常組織(P<0.05)。

表1 β-catenin、E-cad、CK在OSCC與正常組織表達(dá)的MOD值

2.3 OSCC組織中β-catenin、E-cad、CK表達(dá)與臨床病理資料的關(guān)系 OSCC組織中β-catenin、E-cad、CK表達(dá)與臨床病理資料的關(guān)系見表2。β-catenin、E-cad在有淋巴轉(zhuǎn)移組中高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P1=0.013，P2<0.01)，在T1+T2分期中表達(dá)低于T3+T4分期(P1=0.013,P2=0.004)；CK在有淋巴轉(zhuǎn)移組中高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P=0.048)，以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；β-catenin、E-cad、表達(dá)在不同分化組中無明顯差異；CK的表達(dá)在不同腫瘤分期中無明顯差異(P>0.05)。見表2。

表2 OSCC組織中β-catenin、E-cad、CK表達(dá)與臨床病理資料的關(guān)系

3 討 論

Wnt/β-catenin信號通路，是一類進(jìn)化非常保守的信號通路，它通過激活有關(guān)靶基因以控制細(xì)胞生長、分化、凋亡等方式，參與機(jī)體胚胎發(fā)育增殖、分化等過程[3]。在成熟細(xì)胞中處于關(guān)閉狀態(tài)。近年來研究[4]顯示，當(dāng)Wnt/β-cat信號通路被異常激活時，其可參與腫瘤的形成，同時其與腫瘤EMT的發(fā)生，尤其是上皮源性腫瘤的EMT發(fā)生密切相關(guān)。

E-cad，是一種重要黏附分子，最經(jīng)典的上皮細(xì)胞標(biāo)志物。在細(xì)胞膜上，E-cad與β-catenin形成復(fù)合體，維持細(xì)胞連接并參與信號傳導(dǎo)。目前研究[5]發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌等腫瘤中發(fā)現(xiàn)E-cad的表達(dá)下調(diào)，認(rèn)為E-cad的減少或丟失是上皮來源的腫瘤細(xì)胞侵襲的前提條件，是發(fā)生EMT的重要標(biāo)志。CK 是上皮細(xì)胞特征性標(biāo)記物，具有多個亞型，根據(jù)上皮細(xì)胞類型及分化階段的不同，可有不同亞型的CK表達(dá)[6]。本研究結(jié)果顯示，E-cad、CK在OSCC組織中表達(dá)低于正常組織，這與多數(shù)研究結(jié)果相似，提示OSCC中上皮標(biāo)記物減少；本研究結(jié)果顯示，E-cad、CK在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組表達(dá)較有轉(zhuǎn)移組高，提示OSCC發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與E-cad和CK的異常表達(dá)密切相關(guān)，OSCC瘤細(xì)胞可能失去上皮細(xì)胞表型而向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，發(fā)生EMT現(xiàn)象。

β-catenin是一種可溶性蛋白，具有雙重作用。一方面與E-鈣粘素形成復(fù)合體，維持上皮極性和完整性；另一方面，作為Wnt通路的關(guān)鍵蛋白在機(jī)體發(fā)育時期調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖。 β-catenin在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)增高及細(xì)胞核表達(dá)是Wnt/β-cat信號通路激活的重要標(biāo)志，在成熟機(jī)體中，β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)較少甚至幾乎無表達(dá)，β-catenin異常表達(dá)增高是此信號通路參與腫瘤進(jìn)程的關(guān)鍵[7]，已有研究[8-9]發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌，原發(fā)性肝細(xì)胞癌中，β-catenin出現(xiàn)高表達(dá)，在已完成EMT轉(zhuǎn)化的結(jié)腸癌中，細(xì)胞質(zhì)中的β-catenin積累水平較高。本研究結(jié)果顯示，β-catenin在OSCC中表達(dá)較正常組織高(P<0.05)，在T1+T2 期表達(dá)較T3+T4低(P<0.05)，這一研究結(jié)果與大多數(shù)臨床研究結(jié)果相似，提示在OSCC中β-catenin發(fā)生了異常高表達(dá)，隨著腫瘤累及越大，β-catenin的表達(dá)越高；本研究顯示，β-catenin在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組表達(dá)較未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高，提示β-catenin的異常高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，E-cad、CK、β-catenin在OSCC中異常表達(dá)，OSCC可能存在EMT現(xiàn)象，β-catenin在OSCC細(xì)胞出現(xiàn)異常高表達(dá)。我們認(rèn)為，Wnt/β-cat信號通路可能被異常激活，使瘤細(xì)胞得以增殖、分化失控，分化失控有可能使瘤細(xì)胞由上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，獲得遷移能力，促進(jìn)EMT發(fā)生[10]，使OSCC發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

本實(shí)驗(yàn)通過研究E-cad、CK、β-catenin在OSCC中的表達(dá)，證實(shí)在人OSCC中存在EMT現(xiàn)象。通過分析各因子與臨床病理資料之間關(guān)系，我們認(rèn)為Wnt/β-cat通路可能參與OSCC中EMT的發(fā)生，β-catenin是其中的重要因子，與EMT的發(fā)生有關(guān)。β-catenin不僅是Wnt/β-cat信號通路的關(guān)鍵蛋白，也與E-cad一起維持細(xì)胞間連接的穩(wěn)定，干擾β-catenin在瘤組織中的表達(dá)水平，并維持其與E-cad復(fù)合體的穩(wěn)定，從而維持細(xì)胞間緊密連接，降低細(xì)胞移動的趨勢，有可能成為控制腫瘤發(fā)生EMT，降低腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移率的新的研究方向。

[1] 馮紅超，宋宇峰，魏宏琳，等.巨噬細(xì)胞移動抑制因子和基質(zhì)金屬蛋白酶2在口腔癌生長和轉(zhuǎn)移中的作用[J].現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)雜志，2009，23(2):135-137.

[2] 鄒丹丹，湯顯斌.上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化與腫瘤干細(xì)胞[J].中華病理雜志，2013,42(1)：62-65.

[3] Dan Huang,Xiang Du.Crosstalk between tumor cells and microenvironment via Wnt pathway in colorectal cancer dissemination[J].World J Gastroenterol，2008，14(12);1823-1827.

[4] Miguel Angel Chiurillo.Role of the Wnt/b-catenin pathway in gastric cancer: An indepth literature review[J].World J Exp Med，2015，5(2): 84-102.

[5] Elena Scarpa, Andra s Szabo.Cadherin Switch during EMT in Neural Crest Cells Leads to Contact Inhibition of Locomotion via Repolarization of Forces[J].Developmental Cell 34, 2015,34(4):421-434.

[6] Chu PG, Weiss LM.Keratin expression in human tissues and neoplasms.Histopathology 2002 ;40:403-439.

[7] Hans Clevers,Roel Nusse.Wnt/β-catenin Signaling and Disease[J].Cell,2012,149:1192-1205.

[8] 何紹亞，向陽生.不同結(jié)腸組織中β-catenin和TGF-β1表達(dá)與臨床病理的關(guān)系研究[J].貴州醫(yī)藥，2015，39(9)：831-832

[9] 程云娟，羅新華，程明亮.人原發(fā)性肝癌組織中AEG-1、β-catenin和C-myc的表達(dá)及其意義[J].貴州醫(yī)藥2015，39(11)：967-969.

[10] McDonald PC，Dedhar S.The Role of Epithelial-Mesenchymal Transition in Cancer Metastasis[J]. Principles of Stem Cell Biology and Cancer, Future Applications and Therapeutics, 2015: 101-121.

Expression and significance of β-cateinin in OSCC

MaZujun,FengHongchao,SongYufeng,GaoQiong,SunHaoxuan.

1.GuizhouMedicialUniversity,Guiyang550004,China. 2.GuiyangStomatologicalHospital,Guiyang550004,China. 3.FoodandDrugAdministrationBureauinGuizhouProvince,Guiyang550004,China. 4.DepartmentofOralandMaxillofacialSurgery,GuizhouMedicialUniversity,Guiyang550004,China. 5.DepartmentofOralandMaxillofacialSurgery,HospitalinHebeiProvince,Xintai054001,China.

Objective To investigate the expression and clinical significance of β-catenin and EMT correlated protein. Methods 32 cases of OSCC and 10 cases of nomal human were detected by IHC to explore the expression of β-catenin and epithelial drived markers which were E-codherin and Cytokeratin. Results The expression of β-catenin in is significantly higher than that in the normal group (P<0.05); and the expression of Cytokeratin and E-cadherin is significantly lower than those in the normal group (P<0.05); the expression of β-catenin in T3+T4 group is higher than T1+T2 group (P<0.05)，The expression of E-cadherinis significantly lower than T1+T2 Group (P<0.05). The expression of β-catenin is higher than the group without lymph node metastasis (P< 0.05). The expression of E-cadherin, Cytokeratin and is lower than the group without lymph node metastasis (P< 0.05). Conclusion EMT takes place in OSCC. E-codherin, Cytokeratin and β-catenin are differently expressed in OSCC and normal epithelial tissue. β-catenin may involve the progression of EMT in OSCC, promote infiltraton and metastasis of OSCC.

OSCC； β-catenin； E-cadherin； Cytokeratin； EMT； LNM

貴陽市衛(wèi)生局科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目 (2014筑衛(wèi)科技合同字第15號); 貴州省科技計(jì)劃課題任務(wù)(黔科合LG字[2011]001號)

R730.2

A

1000-744X(2016)03-0236-03

2015-12-06)

△通信作者，E-mail：hongchaof@126.com