聯(lián)合應(yīng)激法建立單純心理應(yīng)激動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷难芯?/h1>
2017-01-10 05:45:09徐東寶王杰于燕妮汪元河黃江戴佳琳夏冰
貴州醫(yī)藥 2016年3期
徐東寶 王杰 于燕妮 汪元河 黃江 戴佳琳 夏冰
(貴州醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)系法醫(yī)司法鑒定中心，貴州 貴陽 550004)
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·論 著·
聯(lián)合應(yīng)激法建立單純心理應(yīng)激動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷难芯?/p>
徐東寶 王杰△于燕妮 汪元河 黃江 戴佳琳 夏冰
(貴州醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)系法醫(yī)司法鑒定中心，貴州 貴陽 550004)
目的 應(yīng)用聯(lián)合應(yīng)激法建立單純心理應(yīng)激動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀７椒?連續(xù)給予心理應(yīng)激(PS)組小鼠隔離應(yīng)激30 d，并每天隨機(jī)給予捕食應(yīng)激或社會失敗應(yīng)激1次，末次應(yīng)激后第2天進(jìn)行曠場實(shí)驗(yàn)，斷頸取血，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測血清中促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、皮質(zhì)醇(CORT)水平，并與正常對照(NC)組進(jìn)行比較。結(jié)果 (1)PS組經(jīng)聯(lián)合心理應(yīng)激后，5 min曠場活動明顯減少(P=0.000)；(2)PS組與NC組比較，血清中CRH、ACTH及CORT水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。結(jié)論 通過聯(lián)合應(yīng)激法，可建立一種可靠的單純心理應(yīng)激動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>
心理應(yīng)激； 動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?捕食應(yīng)激； 社會失敗應(yīng)激； 隔離應(yīng)激
心理因素可誘導(dǎo)多種疾病的發(fā)生，如焦慮、恐懼、孤獨(dú)等情緒改變，甚至可導(dǎo)致死亡。但是，心理-社會因素導(dǎo)致疾病發(fā)生的原因尚不清楚，給治療造成諸多困難，然而社會醫(yī)學(xué)倫理又限制對人體心理疾病的研究，動物模型的應(yīng)用則避免了上述不利因素。本研究旨在通過動物應(yīng)激狀態(tài)對動物行為及內(nèi)分泌的影響，以期獲得一種成熟的心理應(yīng)激動物模型的建立方法。
1 材料和方法
1.1 實(shí)驗(yàn)動物 30只SPF級雄性昆明小鼠，體質(zhì)量28～32 g，家貓1只，購自貴州醫(yī)科大學(xué)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(黔)2012-001；自由進(jìn)食飲水，室溫(23±2) ℃，光照12 h(6：00～18：00)，黑暗12 h(18：00～6：00)，捕食應(yīng)激或社會失敗應(yīng)激時間為9：00～11：00。
1.2 試劑與儀器 小鼠促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、皮質(zhì)醇(CORT)酶聯(lián)免疫分析試劑盒(北京誠林生物技術(shù)有限公司)，ELx800通用型酶標(biāo)儀(美國Bio Tek公司)，佳能數(shù)碼相機(jī)(型號：G12)，曠場實(shí)驗(yàn)箱(自制)。
1.3 方法
1.3.1 隔離應(yīng)激 30只小鼠適應(yīng)環(huán)境1周后，隨機(jī)分為心理應(yīng)激(PS)組和正常對照(NC)組，每組15只。PS組置于安靜的房間進(jìn)行單籠飼養(yǎng)，自由飲食飲水，盡量減少同外界事物的接觸，連續(xù)應(yīng)激30 d；NC組于安靜的房間進(jìn)行群居飼養(yǎng)，自由飲食飲水，連續(xù)飼養(yǎng)30 d。
1.3.2 捕食應(yīng)激 PS組小鼠小心輕柔地放入小鼠籠內(nèi)，連同饑餓1 d的貓一起關(guān)入貓籠內(nèi)，使小鼠與貓可相互看到對方，并能嗅到對方的氣味，但雙方無軀體接觸，利用捕食應(yīng)激使小鼠產(chǎn)生恐懼、驚嚇等心理應(yīng)激，使小鼠出現(xiàn)驚恐性顫動及因驚嚇?biāo)潞粑贝俣焖俦且砩縿拥?。?yīng)激時間為出現(xiàn)鼻翼煽動6～8 min(以保證相同的應(yīng)激強(qiáng)度)。NC組小鼠采用同樣方法放入小鼠籠內(nèi)后再放入空的貓籠內(nèi)，同捕食應(yīng)激小鼠周圍環(huán)境相同，靜置6～8 min。
1.3.3 社會失敗應(yīng)激 每次隨機(jī)將2只PS組小鼠放入同一小鼠籠內(nèi)，待小鼠產(chǎn)生攻擊、防御、逃避、順從等行為，用雙層鐵絲網(wǎng)將二者隔開，保證2只小鼠能看到對方，聽到對方的聲音，聞到對方的氣味，持續(xù)應(yīng)激6～8 min。同籠飼養(yǎng)的NC組隨機(jī)2只放入同一小鼠籠內(nèi)，并用雙層鐵絲網(wǎng)將二者隔開，持續(xù)6～8 min。
1.3.4 曠場實(shí)驗(yàn) 將小鼠置于50 cm×50 cm×50 cm的曠場中心處，任其自由活動5 min。實(shí)驗(yàn)全程使用攝像系統(tǒng)記錄，記錄小鼠5 min內(nèi)的行為變化，包括垂直運(yùn)動(兩前爪騰空或攀附墻壁)、嗅探(連續(xù)嗅聞2 s以上)、水平運(yùn)動(身體一半以上進(jìn)入另一格)次數(shù)。每只小鼠實(shí)驗(yàn)完畢后均用清水對曠場實(shí)驗(yàn)箱進(jìn)行擦拭并徹底干燥，避免殘留氣味對下一只小鼠的影響。實(shí)驗(yàn)完成后找3名對實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)不熟悉的人員進(jìn)行評分，求平均值。
1.3.5 ELISA檢測 所有動物曠場實(shí)驗(yàn)后斷頸處死，取血，全血標(biāo)本室溫靜置2 h后，離心，取上清，-20 ℃凍存。嚴(yán)格按照ELISA檢測試劑盒說明進(jìn)行操作，檢測血清CRH、ACTH、CORT水平。
1.4 評價標(biāo)準(zhǔn) 比照E.T.Nestler等[1]所歸納的抑郁動物模型成功與否的判斷原則，心理應(yīng)激可通過應(yīng)激后能否出現(xiàn)相應(yīng)的應(yīng)激樣行為表現(xiàn)，或出現(xiàn)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)功能失調(diào)引起的一系列相關(guān)激素的變化，來進(jìn)行模型有效性的判斷。具體為：(1)行為學(xué)評分，包括水平運(yùn)動、垂直運(yùn)動和嗅探次數(shù)，較NC組平均值明顯降低；(2)下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPAA)明顯激活，血清CRH、ACTH、CORT較 NC組平均水平明顯升高。
2 結(jié) 果
2.1 小鼠行為學(xué)改變 心理應(yīng)激組較正常組小鼠曠場行為活動(水平運(yùn)動、垂直運(yùn)動、嗅探)均明顯降低，且符合上述納入標(biāo)準(zhǔn)(1)的要求，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)，見表1。
表1 小鼠曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果
2.2 血清中CRH、ACTH、CORT水平的變化 ELISA檢測結(jié)果顯示，PS組較NC組小鼠血清中CRH、ACTH、CORT水平均明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)，見表2。提示心理應(yīng)激組HPAA明顯激活，滿足上述納入標(biāo)準(zhǔn)(2)，說明心理應(yīng)激組小鼠處于應(yīng)激狀態(tài)。
組別nCRH/(ng/L)ACTH/(ng/L)CORT/(μg/L)NC組1526．74±3．6639．02±8．73154．48±23．22PS組1539．97±3．9775．80±6．63209．16±16．80Z值-4．625-4．666-4．564P值0．0000．0000．000
3 討 論
目前，較常用的應(yīng)激動物模型構(gòu)建方法有束縛應(yīng)激、強(qiáng)迫游泳、懸吊刺激、創(chuàng)傷應(yīng)激等，但均對軀體因素的影響較大[2]。本研究選用對軀體因素影響較小的聯(lián)合應(yīng)激法構(gòu)建應(yīng)激動物模型，最大限度地降低了軀體因素的影響。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[3-6]報道，每種應(yīng)激方法單一或其中兩種相結(jié)合均有明顯的心理應(yīng)激效果，如活動減少、焦慮、抑郁、社會逃避、探索活動降低等行為表現(xiàn)以及HPAA出現(xiàn)不同程度的激活，但存在不同的缺點(diǎn)，如長期捕食應(yīng)激過程中CORT水平呈先升高后降低的雙向變化，可能為對應(yīng)激的適應(yīng)所致；隔離應(yīng)激所需的建模時間較長(3～6個月)，過長又可對應(yīng)激效果產(chǎn)生影響；隔離應(yīng)激和社會失敗應(yīng)激早期應(yīng)激效果明顯，但隨著時間的延長逐漸降低，可能為對刺激的適應(yīng)或應(yīng)激抗性所致。
本研究通過對國內(nèi)常用昆明種小鼠單純心理應(yīng)激實(shí)驗(yàn)動物模型的構(gòu)建進(jìn)行研究分析，參照國內(nèi)外已報道[2,7]的應(yīng)激動物模型，選用隔離應(yīng)激，并每天隨機(jī)給予捕食應(yīng)激或社會失敗應(yīng)激，這種聯(lián)合應(yīng)激的方法可有效避免實(shí)驗(yàn)動物因適應(yīng)而對應(yīng)激效果產(chǎn)生影響，最大限度地保證了每天所給予應(yīng)激的效果，亦可避免單一因素缺乏模擬應(yīng)激客觀性的缺點(diǎn)。在效果評價方面，有研究[8]報道，主要通過運(yùn)用應(yīng)激后動物生理、行為變化(如應(yīng)激激素水平增高、抑郁樣行為增多等)，神經(jīng)生物學(xué)的變化(如海馬和內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)體積和細(xì)胞增殖降低、樹突狀核形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化)，以及應(yīng)用抗抑郁藥物抑郁樣行為能否被逆轉(zhuǎn)。但神經(jīng)生物學(xué)評價方法在臨床應(yīng)用中存在較大的困難，尤其是腦組織標(biāo)本的采集即不符合倫理的要求，同時采集較困難[9]；抗抑郁藥物的作用機(jī)制至今尚未完全闡明，不能排除其對腦及其它器官組織的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生影響。因此，本研究通過行為學(xué)和神經(jīng)內(nèi)分泌的方法對實(shí)驗(yàn)動物應(yīng)激后的心理狀態(tài)進(jìn)行評價，成本低、操作簡便，并且可減小不同個體應(yīng)激易感性和遺傳因素差異的影響，同時引用實(shí)驗(yàn)室的檢查指標(biāo)相對客觀、準(zhǔn)確。
根據(jù)達(dá)爾文的生物進(jìn)化理論，人和動物在相同的心理狀態(tài)下表現(xiàn)出相同的行為反映，因此心理應(yīng)激動物模型的行為學(xué)評估具有重要的價值，并且對心理應(yīng)激致人類疾病的研究具有重要的作用。曠場實(shí)驗(yàn)是一個較成熟的行為學(xué)評估方法，可以很好地監(jiān)測實(shí)驗(yàn)動物的心理狀態(tài)[10]。如水平運(yùn)動可反映動物運(yùn)動活性，代表其興奮性狀態(tài)；垂直運(yùn)動和嗅探可反映動物探索活性，代表其認(rèn)知能力。本實(shí)驗(yàn)心理應(yīng)激30 d后，小鼠的運(yùn)動探索行為明顯降低，水平運(yùn)動降低40.5%，垂直運(yùn)動降低53.2%，嗅探降低48.6%，總行為評分(三者之和)降低42.8%，表現(xiàn)出抑郁、焦慮、恐懼及對周圍事物興趣性降低等行為學(xué)特征，與長期慢性心理應(yīng)激后實(shí)驗(yàn)動物心理行為學(xué)表現(xiàn)結(jié)果一致[11]，可說明本實(shí)驗(yàn)小鼠聯(lián)合應(yīng)激后處于應(yīng)激狀態(tài)。
在應(yīng)激反應(yīng)中HPAA是研究較廣泛的一個關(guān)鍵系統(tǒng)，應(yīng)激時被激活，從而發(fā)揮其調(diào)節(jié)作用。同時，HPAA的功能狀態(tài)亦可間接反映機(jī)體的應(yīng)激狀態(tài)。研究[12]表明，長期的心理及軀體應(yīng)激對人體健康的損害程度同HPAA功能的持續(xù)亢進(jìn)有密切的關(guān)系。當(dāng)動物遇到對機(jī)體有威脅的信號時，HPAA激活使機(jī)體對應(yīng)激產(chǎn)生抵抗或逃避反應(yīng)，但當(dāng)應(yīng)激長期持續(xù)存在時導(dǎo)致HPAA功能持續(xù)亢進(jìn)，即可產(chǎn)生不良后果，使應(yīng)激激素的負(fù)效應(yīng)增強(qiáng)，如極度疲勞以及失眠、焦慮等抑郁癥的表現(xiàn)。目前，對HPAA功能狀態(tài)的評估方法主要有以下幾種[13]：內(nèi)分泌激素水平監(jiān)測、行為學(xué)變化、覺醒狀態(tài)、藥理學(xué)研究等。CRH、ACTH及CORT作為HPAA中三種重要的內(nèi)分泌激素，被認(rèn)為是研究應(yīng)激狀態(tài)的最經(jīng)典、最重要的指標(biāo)之一[14]。因此，本實(shí)驗(yàn)研究通過血清中CRH、ACTH、CORT三種內(nèi)分泌激素水平變化監(jiān)測HPAA的功能狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)應(yīng)激模型組心理應(yīng)激后三種激素濃度均明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)，三種激素濃度分別升高49.5%、94.3%、35.4%(表2，ELISA檢測)，表明HPAA被激活，可間接說明實(shí)驗(yàn)動物處于應(yīng)激狀態(tài)，這同國內(nèi)外報道[14-15]相一致。
因此，本實(shí)驗(yàn)的研究分析表明，通過聯(lián)合應(yīng)激的方法成功地建立了單純心理應(yīng)激動物模型，曠場活動及血清中CRH、ACTH、CORT水平變化能有效反映動物的應(yīng)激狀態(tài)，是一種可靠的評價應(yīng)激動物模型的方法。
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Experimental Study on A Pure Psychological Stress Animal Model Established by Combined Application Stress
XuDongbao,WangJie,YuYanni,WangYuanhe,HuangJiang,DaiJialin,XiaBing.
DepartmentofForensicMedicine，GuizhouMedicalUniversity，Guiyang550004，China.
Objective To build the animal model of pure psychological stress based on combined stress. Methods Mice were randomly divided into psychological stress and control group (n=15/group). After 1-week acclimation, animals were subjected to social isolation stress (30days), and randomized to predator stress (1/day) or social defeat stress (1/day). Open-field test was performed at 24h after the last psychological stress. Then, the average contents of CRH, ACTH and CORT detected by enzyme-linked immuno-sorbent assays were compared with control groups. Results The psychological stress (PS) group mice reduced activity significantly in open-field test (P=0.000). The average contents of CRH, ACTH and CORT were significantly higher in PS mice compared with NC mice (P=0.000). Conclusion The animal model through combined stress is a credible method to establish pure psychological stress.
Psychological stress； Experimental animal models； Predator stress； Social defeat stress； Social isolation stress
國家自然科學(xué)基金(81341130)；貴州省高校工程技術(shù)研究中心項(xiàng)目[黔科合KY字(2013)114號]；貴州省教育廳產(chǎn)學(xué)研基金項(xiàng)目[黔教合KY字(2012)031號]；貴州省科技攻關(guān)項(xiàng)目[黔科合NY字(2010)3090]
R-331
A
1000-744X(2016)03-0227-03
2015-11-12)
△通信作者,E-mail:wj6400@gmc.edu.cn
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心理因素可誘導(dǎo)多種疾病的發(fā)生，如焦慮、恐懼、孤獨(dú)等情緒改變，甚至可導(dǎo)致死亡。但是，心理-社會因素導(dǎo)致疾病發(fā)生的原因尚不清楚，給治療造成諸多困難，然而社會醫(yī)學(xué)倫理又限制對人體心理疾病的研究，動物模型的應(yīng)用則避免了上述不利因素。本研究旨在通過動物應(yīng)激狀態(tài)對動物行為及內(nèi)分泌的影響，以期獲得一種成熟的心理應(yīng)激動物模型的建立方法。
1 材料和方法
1.1 實(shí)驗(yàn)動物 30只SPF級雄性昆明小鼠，體質(zhì)量28～32 g，家貓1只，購自貴州醫(yī)科大學(xué)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(黔)2012-001；自由進(jìn)食飲水，室溫(23±2) ℃，光照12 h(6：00～18：00)，黑暗12 h(18：00～6：00)，捕食應(yīng)激或社會失敗應(yīng)激時間為9：00～11：00。
1.2 試劑與儀器 小鼠促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、皮質(zhì)醇(CORT)酶聯(lián)免疫分析試劑盒(北京誠林生物技術(shù)有限公司)，ELx800通用型酶標(biāo)儀(美國Bio Tek公司)，佳能數(shù)碼相機(jī)(型號：G12)，曠場實(shí)驗(yàn)箱(自制)。
1.3 方法
1.3.1 隔離應(yīng)激 30只小鼠適應(yīng)環(huán)境1周后，隨機(jī)分為心理應(yīng)激(PS)組和正常對照(NC)組，每組15只。PS組置于安靜的房間進(jìn)行單籠飼養(yǎng)，自由飲食飲水，盡量減少同外界事物的接觸，連續(xù)應(yīng)激30 d；NC組于安靜的房間進(jìn)行群居飼養(yǎng)，自由飲食飲水，連續(xù)飼養(yǎng)30 d。
1.3.2 捕食應(yīng)激 PS組小鼠小心輕柔地放入小鼠籠內(nèi)，連同饑餓1 d的貓一起關(guān)入貓籠內(nèi)，使小鼠與貓可相互看到對方，并能嗅到對方的氣味，但雙方無軀體接觸，利用捕食應(yīng)激使小鼠產(chǎn)生恐懼、驚嚇等心理應(yīng)激，使小鼠出現(xiàn)驚恐性顫動及因驚嚇?biāo)潞粑贝俣焖俦且砩縿拥?。?yīng)激時間為出現(xiàn)鼻翼煽動6～8 min(以保證相同的應(yīng)激強(qiáng)度)。NC組小鼠采用同樣方法放入小鼠籠內(nèi)后再放入空的貓籠內(nèi)，同捕食應(yīng)激小鼠周圍環(huán)境相同，靜置6～8 min。
1.3.3 社會失敗應(yīng)激 每次隨機(jī)將2只PS組小鼠放入同一小鼠籠內(nèi)，待小鼠產(chǎn)生攻擊、防御、逃避、順從等行為，用雙層鐵絲網(wǎng)將二者隔開，保證2只小鼠能看到對方，聽到對方的聲音，聞到對方的氣味，持續(xù)應(yīng)激6～8 min。同籠飼養(yǎng)的NC組隨機(jī)2只放入同一小鼠籠內(nèi)，并用雙層鐵絲網(wǎng)將二者隔開，持續(xù)6～8 min。
1.3.4 曠場實(shí)驗(yàn) 將小鼠置于50 cm×50 cm×50 cm的曠場中心處，任其自由活動5 min。實(shí)驗(yàn)全程使用攝像系統(tǒng)記錄，記錄小鼠5 min內(nèi)的行為變化，包括垂直運(yùn)動(兩前爪騰空或攀附墻壁)、嗅探(連續(xù)嗅聞2 s以上)、水平運(yùn)動(身體一半以上進(jìn)入另一格)次數(shù)。每只小鼠實(shí)驗(yàn)完畢后均用清水對曠場實(shí)驗(yàn)箱進(jìn)行擦拭并徹底干燥，避免殘留氣味對下一只小鼠的影響。實(shí)驗(yàn)完成后找3名對實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)不熟悉的人員進(jìn)行評分，求平均值。
1.3.5 ELISA檢測 所有動物曠場實(shí)驗(yàn)后斷頸處死，取血，全血標(biāo)本室溫靜置2 h后，離心，取上清，-20 ℃凍存。嚴(yán)格按照ELISA檢測試劑盒說明進(jìn)行操作，檢測血清CRH、ACTH、CORT水平。
1.4 評價標(biāo)準(zhǔn) 比照E.T.Nestler等[1]所歸納的抑郁動物模型成功與否的判斷原則，心理應(yīng)激可通過應(yīng)激后能否出現(xiàn)相應(yīng)的應(yīng)激樣行為表現(xiàn)，或出現(xiàn)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)功能失調(diào)引起的一系列相關(guān)激素的變化，來進(jìn)行模型有效性的判斷。具體為：(1)行為學(xué)評分，包括水平運(yùn)動、垂直運(yùn)動和嗅探次數(shù)，較NC組平均值明顯降低；(2)下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPAA)明顯激活，血清CRH、ACTH、CORT較 NC組平均水平明顯升高。
2 結(jié) 果
2.1 小鼠行為學(xué)改變 心理應(yīng)激組較正常組小鼠曠場行為活動(水平運(yùn)動、垂直運(yùn)動、嗅探)均明顯降低，且符合上述納入標(biāo)準(zhǔn)(1)的要求，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)，見表1。
表1 小鼠曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果
2.2 血清中CRH、ACTH、CORT水平的變化 ELISA檢測結(jié)果顯示，PS組較NC組小鼠血清中CRH、ACTH、CORT水平均明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)，見表2。提示心理應(yīng)激組HPAA明顯激活，滿足上述納入標(biāo)準(zhǔn)(2)，說明心理應(yīng)激組小鼠處于應(yīng)激狀態(tài)。
組別nCRH/(ng/L)ACTH/(ng/L)CORT/(μg/L)NC組1526．74±3．6639．02±8．73154．48±23．22PS組1539．97±3．9775．80±6．63209．16±16．80Z值-4．625-4．666-4．564P值0．0000．0000．000
3 討 論
目前，較常用的應(yīng)激動物模型構(gòu)建方法有束縛應(yīng)激、強(qiáng)迫游泳、懸吊刺激、創(chuàng)傷應(yīng)激等，但均對軀體因素的影響較大[2]。本研究選用對軀體因素影響較小的聯(lián)合應(yīng)激法構(gòu)建應(yīng)激動物模型，最大限度地降低了軀體因素的影響。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[3-6]報道，每種應(yīng)激方法單一或其中兩種相結(jié)合均有明顯的心理應(yīng)激效果，如活動減少、焦慮、抑郁、社會逃避、探索活動降低等行為表現(xiàn)以及HPAA出現(xiàn)不同程度的激活，但存在不同的缺點(diǎn)，如長期捕食應(yīng)激過程中CORT水平呈先升高后降低的雙向變化，可能為對應(yīng)激的適應(yīng)所致；隔離應(yīng)激所需的建模時間較長(3～6個月)，過長又可對應(yīng)激效果產(chǎn)生影響；隔離應(yīng)激和社會失敗應(yīng)激早期應(yīng)激效果明顯，但隨著時間的延長逐漸降低，可能為對刺激的適應(yīng)或應(yīng)激抗性所致。
本研究通過對國內(nèi)常用昆明種小鼠單純心理應(yīng)激實(shí)驗(yàn)動物模型的構(gòu)建進(jìn)行研究分析，參照國內(nèi)外已報道[2,7]的應(yīng)激動物模型，選用隔離應(yīng)激，并每天隨機(jī)給予捕食應(yīng)激或社會失敗應(yīng)激，這種聯(lián)合應(yīng)激的方法可有效避免實(shí)驗(yàn)動物因適應(yīng)而對應(yīng)激效果產(chǎn)生影響，最大限度地保證了每天所給予應(yīng)激的效果，亦可避免單一因素缺乏模擬應(yīng)激客觀性的缺點(diǎn)。在效果評價方面，有研究[8]報道，主要通過運(yùn)用應(yīng)激后動物生理、行為變化(如應(yīng)激激素水平增高、抑郁樣行為增多等)，神經(jīng)生物學(xué)的變化(如海馬和內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)體積和細(xì)胞增殖降低、樹突狀核形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化)，以及應(yīng)用抗抑郁藥物抑郁樣行為能否被逆轉(zhuǎn)。但神經(jīng)生物學(xué)評價方法在臨床應(yīng)用中存在較大的困難，尤其是腦組織標(biāo)本的采集即不符合倫理的要求，同時采集較困難[9]；抗抑郁藥物的作用機(jī)制至今尚未完全闡明，不能排除其對腦及其它器官組織的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生影響。因此，本研究通過行為學(xué)和神經(jīng)內(nèi)分泌的方法對實(shí)驗(yàn)動物應(yīng)激后的心理狀態(tài)進(jìn)行評價，成本低、操作簡便，并且可減小不同個體應(yīng)激易感性和遺傳因素差異的影響，同時引用實(shí)驗(yàn)室的檢查指標(biāo)相對客觀、準(zhǔn)確。
根據(jù)達(dá)爾文的生物進(jìn)化理論，人和動物在相同的心理狀態(tài)下表現(xiàn)出相同的行為反映，因此心理應(yīng)激動物模型的行為學(xué)評估具有重要的價值，并且對心理應(yīng)激致人類疾病的研究具有重要的作用。曠場實(shí)驗(yàn)是一個較成熟的行為學(xué)評估方法，可以很好地監(jiān)測實(shí)驗(yàn)動物的心理狀態(tài)[10]。如水平運(yùn)動可反映動物運(yùn)動活性，代表其興奮性狀態(tài)；垂直運(yùn)動和嗅探可反映動物探索活性，代表其認(rèn)知能力。本實(shí)驗(yàn)心理應(yīng)激30 d后，小鼠的運(yùn)動探索行為明顯降低，水平運(yùn)動降低40.5%，垂直運(yùn)動降低53.2%，嗅探降低48.6%，總行為評分(三者之和)降低42.8%，表現(xiàn)出抑郁、焦慮、恐懼及對周圍事物興趣性降低等行為學(xué)特征，與長期慢性心理應(yīng)激后實(shí)驗(yàn)動物心理行為學(xué)表現(xiàn)結(jié)果一致[11]，可說明本實(shí)驗(yàn)小鼠聯(lián)合應(yīng)激后處于應(yīng)激狀態(tài)。
在應(yīng)激反應(yīng)中HPAA是研究較廣泛的一個關(guān)鍵系統(tǒng)，應(yīng)激時被激活，從而發(fā)揮其調(diào)節(jié)作用。同時，HPAA的功能狀態(tài)亦可間接反映機(jī)體的應(yīng)激狀態(tài)。研究[12]表明，長期的心理及軀體應(yīng)激對人體健康的損害程度同HPAA功能的持續(xù)亢進(jìn)有密切的關(guān)系。當(dāng)動物遇到對機(jī)體有威脅的信號時，HPAA激活使機(jī)體對應(yīng)激產(chǎn)生抵抗或逃避反應(yīng)，但當(dāng)應(yīng)激長期持續(xù)存在時導(dǎo)致HPAA功能持續(xù)亢進(jìn)，即可產(chǎn)生不良后果，使應(yīng)激激素的負(fù)效應(yīng)增強(qiáng)，如極度疲勞以及失眠、焦慮等抑郁癥的表現(xiàn)。目前，對HPAA功能狀態(tài)的評估方法主要有以下幾種[13]：內(nèi)分泌激素水平監(jiān)測、行為學(xué)變化、覺醒狀態(tài)、藥理學(xué)研究等。CRH、ACTH及CORT作為HPAA中三種重要的內(nèi)分泌激素，被認(rèn)為是研究應(yīng)激狀態(tài)的最經(jīng)典、最重要的指標(biāo)之一[14]。因此，本實(shí)驗(yàn)研究通過血清中CRH、ACTH、CORT三種內(nèi)分泌激素水平變化監(jiān)測HPAA的功能狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)應(yīng)激模型組心理應(yīng)激后三種激素濃度均明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)，三種激素濃度分別升高49.5%、94.3%、35.4%(表2，ELISA檢測)，表明HPAA被激活，可間接說明實(shí)驗(yàn)動物處于應(yīng)激狀態(tài)，這同國內(nèi)外報道[14-15]相一致。
因此，本實(shí)驗(yàn)的研究分析表明，通過聯(lián)合應(yīng)激的方法成功地建立了單純心理應(yīng)激動物模型，曠場活動及血清中CRH、ACTH、CORT水平變化能有效反映動物的應(yīng)激狀態(tài)，是一種可靠的評價應(yīng)激動物模型的方法。
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Experimental Study on A Pure Psychological Stress Animal Model Established by Combined Application Stress
XuDongbao,WangJie,YuYanni,WangYuanhe,HuangJiang,DaiJialin,XiaBing.
DepartmentofForensicMedicine，GuizhouMedicalUniversity，Guiyang550004，China.
Objective To build the animal model of pure psychological stress based on combined stress. Methods Mice were randomly divided into psychological stress and control group (n=15/group). After 1-week acclimation, animals were subjected to social isolation stress (30days), and randomized to predator stress (1/day) or social defeat stress (1/day). Open-field test was performed at 24h after the last psychological stress. Then, the average contents of CRH, ACTH and CORT detected by enzyme-linked immuno-sorbent assays were compared with control groups. Results The psychological stress (PS) group mice reduced activity significantly in open-field test (P=0.000). The average contents of CRH, ACTH and CORT were significantly higher in PS mice compared with NC mice (P=0.000). Conclusion The animal model through combined stress is a credible method to establish pure psychological stress.
Psychological stress； Experimental animal models； Predator stress； Social defeat stress； Social isolation stress
國家自然科學(xué)基金(81341130)；貴州省高校工程技術(shù)研究中心項(xiàng)目[黔科合KY字(2013)114號]；貴州省教育廳產(chǎn)學(xué)研基金項(xiàng)目[黔教合KY字(2012)031號]；貴州省科技攻關(guān)項(xiàng)目[黔科合NY字(2010)3090]
R-331
A
1000-744X(2016)03-0227-03
2015-11-12)
△通信作者,E-mail:wj6400@gmc.edu.cn
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