徐國強(qiáng) 王偉 孫達(dá)權(quán) 黃小瓊 陳騰祥

(1. 貴州醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室； 2. 貴州醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，貴州 貴陽 550004)

人TIMP-2基因的克隆及其原核表達(dá)

徐國強(qiáng)1王偉1孫達(dá)權(quán)2黃小瓊1陳騰祥1

(1. 貴州醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室； 2. 貴州醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，貴州 貴陽 550004)

目的 構(gòu)建人TIMP-2重組表達(dá)載體，并在大腸桿菌 BL21 (DE3) 中表達(dá)。方法 提取人肝癌細(xì)胞 (Hep G2)總RNA后， 經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增獲得目的片段，插入克隆載體pMD18-T；酶切鑒定和測序后將TIMP-2導(dǎo)入原核表達(dá)載體pGEX-4T-1中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-TIMP-2。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌菌株BL21 (DE3)中，IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)后用SDS-PAGE電泳檢測并用western blot驗(yàn)證(蛋白質(zhì)印跡法)。結(jié)果 成功構(gòu)建原核重組表達(dá)載體 pGEX-TIMP-2，并在原核宿主BL21中大量表達(dá)融合蛋白GST-TIMP-2。結(jié)論 克隆人TIMP-2基因并在原核生物中大量表達(dá)。

基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子2； pGEX-4T-1； 原核表達(dá)； 肝癌

基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子(TIMPs)是基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的天然抑制劑[1]。兩者形成非共價(jià)復(fù)合物從而抑制MMPS的活性，減少細(xì)胞外基質(zhì)的破壞，保持細(xì)胞間連接的完整性，降低腫瘤的轉(zhuǎn)移，改善預(yù)后[2]。細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)由基底膜和間質(zhì)基質(zhì)構(gòu)成，基底膜是ECM的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，它不僅為ECM提供物理支撐，同時還為細(xì)胞提供代謝支持[3]。ECM是腫瘤重要的微環(huán)境之一，能夠影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞間的黏附以及腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移[4]。Ⅳ型膠原是基底膜的主要組成成分，主要位于上皮和內(nèi)皮細(xì)胞的基底層[5]，MMP-2是Ⅳ型膠原酶，能降解Ⅳ型膠原從而破壞ECM形成癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的通道[6]。相比較TIMPs其他家族成員而言，TIMP-2在大多數(shù)正常成人組織間隙有大量表達(dá)，能特異性抑制MMP-2的活性從而減少ECM的降解，降低癌細(xì)胞的遷移能力[5,7]。

越來越多的臨床病理證據(jù)表明，腫瘤組織中TIMP-2的表達(dá)水平較低，這可能與腫瘤的侵襲性增加有關(guān)；相反，TIMP-2表達(dá)水平的增加，能抑制腫瘤的生長以及增強(qiáng)化療藥物的敏感性[7]。如在侵襲性胃癌以及腎透明細(xì)胞癌組織、食管癌、胃癌、非小細(xì)胞肺癌患者的血清中TIMP-2表達(dá)水平均較低[8-9]；腫瘤抑癌基因E-cadherin表達(dá)上調(diào)與TIMP-2的過度表達(dá)有關(guān)，有助于維持細(xì)胞間的黏附及抑制腫瘤的生長[1]。因此有研究表明TIMP-2與腫瘤的發(fā)展有極大關(guān)系。本研究擬構(gòu)建TIMP-2的原核表達(dá)載體pGEX-TIMP-2并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，為后期獲取TIMP-2融合蛋白及探討肝細(xì)胞癌微環(huán)境與肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系提供前期支持。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 高保真酶 Pyrobest DNA Polymerase；兔抗人多克隆抗體TIMP-2，購于Bioworld公司；限制性內(nèi)切酶EcoR I、Xho I、T4 DNA Ligase、1kb DNA Ladder 和200bp DNA Ladder購自TaKaRa公司；Trizol、質(zhì)粒小提試劑盒、DNA回收試劑盒購自天根生物公司；瓊脂糖購自Sigma公司；SDS PAGE制膠試劑盒購自索萊寶生物公司；冰醋酸、濃鹽酸、異丙醇、氯仿等為分析純AR級；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司；引物合成及測序由北京Biomed公司完成。

1.1.2 菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基 用于分子克隆的宿主E. coli DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存，用于表達(dá)的宿主 E. coli BL21(DE3)購自天根生物公司?？寺≥d體pMD18-T vector和原核表達(dá)載體pGEX-4T-1本實(shí)驗(yàn)室保存。YT液體培養(yǎng)基(細(xì)菌培養(yǎng)用胰蛋白胨16 g/L，細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物 10 g/L，氯化鈉5 g/L)；LB液體培養(yǎng)基(細(xì)菌培養(yǎng)用胰蛋白胨10 g/L，細(xì)菌培養(yǎng)用酵母浸粉 5 g/L，氯化鈉10 g/L， 固體培養(yǎng)基添加瓊脂粉15 g/L)用于大腸桿菌的培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的獲取 根據(jù)GenBank中人TIMP-2的基因序列(NM_003255)和pGEX-4T-1原核表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)合成一對引物。上游引物5’端加入EcoR I酶切位點(diǎn)，下游引物5’端加入Xho I酶切位點(diǎn)。引物序列見表1。

表1 TIMP-2上下游PCR引物

1.2.2 RT-PCR獲取目的片段與T載體的構(gòu)建 提取人肝癌細(xì)胞(Hep G2)總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄的方法合成人源性cDNA第一鏈，以cDNA第一鏈為模板，以表1中核苷酸片段為引物，PCR擴(kuò)增TIMP-2目的基因片段。瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，割膠回收目的片段，與pMD18-T 4 ℃過夜連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞并接種于含氨芐青霉素(Amp 100 mg/mL)的LB平板，篩選出陽性菌落，LB液體培養(yǎng)基37 ℃振蕩培養(yǎng)10 h，抽提質(zhì)粒后酶切(EcoR I、Xoh I)分析，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并將該菌落送至北京Biomed公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果與GenBank中 (NM_003255) 人TIMP-2基因序列比對，并命名為pMD18-TIMP-2保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建 將測序正確的pMD18-TIMP-2質(zhì)粒雙酶切，割膠回收TIMP-2基因片段與同樣雙酶切的原核表達(dá)載體pGEX-4T-1用T4連接酶4 ℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂于含Amp的LB平板，37 ℃過夜培養(yǎng)后，挑取單菌落接種于含Amp的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)10 h。抽提質(zhì)粒后雙酶切分析，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并對菌落進(jìn)行序列測定，結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)(NM_003255) 人TIMP-2基因序列比對。將陽性克隆子命名為pGEX-TIMP-2。

1.2.4 GST-TIMP-2蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將重組質(zhì)粒pGEX-TIMP-2轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂于含Amp的LB平板，37 ℃培養(yǎng)過夜，篩選出陽性菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、200r/min振搖培養(yǎng)過夜。按1∶500的比例取上述菌液接種于20 mL YT培養(yǎng)基中，37 ℃、200r/min振搖培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.6時，加入終濃度為0.2 mmol/L 異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)， 24 ℃ 220 rpm/min誘導(dǎo)表達(dá)3 h，并取未加IPTG誘導(dǎo)的菌液3 mL留作對照。分別取各組菌液2 mL離心12 000r/min，5 min，收集菌體，PBS緩沖液重懸后加入 5×SDS上樣緩沖液加熱變性，12%的SDS-PAGE檢測融合蛋白。

1.2.5 Western Blot鑒定 取誘導(dǎo)及未誘導(dǎo)的菌液1 mL，離心后搜集菌體，分別向菌體沉淀中加入PBS、5×SDS上樣緩沖液振蕩混勻，加熱變性后12%的SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，經(jīng)Westrn blotting封閉液封閉后依次加入兔多克隆一抗、羊抗兔二抗，最后用ECL-Plus化學(xué)發(fā)光試劑顯色，于化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)采集圖像保存。

2 結(jié) 果

2.1 人TIMP-2基因的獲取及重組載體pMD18-TIMP-2的構(gòu)建與鑒定 (1)目的基因的獲?。禾崛∪烁伟┘?xì)胞(Hep G2)總RNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲取TIMP-2基因片段，產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，在約663 bp處有明顯條帶(圖1)，與預(yù)期的TIMP-2基因片段大小一致。(2)T載體的構(gòu)建：將pMD18-TIMP-2載體陽性菌落，質(zhì)粒抽提后用EcoR I、Xoh I進(jìn)行雙酶切，1%的瓊脂糖凝膠電泳，鑒定為陽性克隆(圖2)。(3)測序鑒定：將瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確的陽性菌落擴(kuò)大培養(yǎng)12 h后，取1 mL送北京Biomed公司進(jìn)行測序，經(jīng)測序表明pMD18-TIMP-2中TIMP2的堿基序列與GenBank公布的(NM_003255)人TIMP-2基因序列一致，即TIMP-2基因成功克隆到pMD18-T載體。

2.2 人TIMP-2重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-TIMP-2的構(gòu)建 (1)人TIMP-2重組表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定：原核表達(dá)載體pGEX-TIMP-2的質(zhì)粒酶切結(jié)果見圖3，結(jié)果中有兩條帶，在約4900 bp處的表達(dá)載體及663 bp處的目的蛋白，由此可初步鑒定人TIMP-2重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。(2)測序鑒定：將初步鑒定的陽性菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后，菌液送至北京Biomed公司進(jìn)行測序鑒定，原核表達(dá)載體pGEX-TIMP-2中TIMP-2的基因序列與GenBank公布的(NM_003255)人TIMP-2基因序列一致，表明原核表達(dá)載體pGEX-TIMP-2構(gòu)建成功。

注：A為瓊脂糖凝膠電泳檢測人總RNA；B為TIMP-2基因的PCR產(chǎn)物，M：200 bp ladder marker；1：人TIMP-2基因cDNA片段。圖1 RT-PCR擴(kuò)增人TIMP-2 cDNA

注：M：200 bp ladder marker； 1：pMD18T空載體； 2和3：pMD18T-TIMP-2用EcoR I、Xho I雙酶切產(chǎn)物。圖2 瓊脂糖凝膠電泳鑒定重組質(zhì)粒pMD18T-TIMP-2

注；M：1000 bp ladder marker；1和2：pGEX-TIMP-2用EcoR I、Xho I進(jìn)行雙酶切產(chǎn)物。圖3 瓊脂糖凝膠電泳鑒定重組原核表達(dá)質(zhì)粒

2.3 融合蛋白TIMP-2的誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定 (1)誘導(dǎo)表達(dá)：將誘導(dǎo)表達(dá)的pGEX-TIMP-2菌體沉淀經(jīng)12%的SDS-PAGE鑒定，pGEX-TIMP-2菌液樣品在約48 kD處出現(xiàn)明顯的目的蛋白條帶，而未加IPTG誘導(dǎo)的菌體樣品在48 kD處無明顯條帶。結(jié)果表明TIMP-2蛋白被成功誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果見圖4。(2)Western Blot鑒定GST-TIMP-2融合蛋白：一抗為TIMP-2多克隆抗體，二抗為羊抗兔IgG，進(jìn)行Western Blotting免疫印跡分析，化學(xué)發(fā)光顯色后結(jié)果見圖5，GST-TIMP-2融合蛋白與兔多克隆抗體呈陽性反應(yīng)，在約48 kD處有特異性蛋白反應(yīng)條帶。

注：M：預(yù)染marker； 1、2、3均為在IPTG為0.2 mm/L時pGEX-TIMP-2菌株的表達(dá)產(chǎn)物；4、5、6均為未加IPTG誘導(dǎo)的pGEX-TIMP-2菌株。圖4 考馬斯亮藍(lán)R-250檢測融合蛋白TIMP-2

圖5 Western Blot鑒定GST-TIMP-2蛋白

3 討 論

不同的TIMPs對MMPs的親和力不同且每一種TIMPs都可以與幾種MMPs以非共價(jià)鍵形式生成1∶1的復(fù)合物，保持著相對的平衡狀態(tài)，對組織的修復(fù)、重塑、胚胎的插入、腫瘤細(xì)胞的浸潤及轉(zhuǎn)移中有重要的意義[10]。 MMPs可通過調(diào)節(jié)ECM的合成與分解，使膠原的合成與降解處于平衡狀態(tài)，當(dāng)平衡遭到破壞，將導(dǎo)致ECM修復(fù)與重塑異常[11]。ECM的堆積容易造成組織纖維化，有研究[12-13]顯示在肝臟TIMP-2 能抑制 MMP2的活性，阻止ECM的降解，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生，隨著肝纖維化的發(fā)展，MMPs的表達(dá)下降而TIMP-1和TIMP-2的表達(dá)升高，致使MMPs/TIMPs值降低，膠原降解減少，結(jié)果使總體ECM總量較正常肝臟增加3～8倍從而加劇了肝纖維化。肝動脈化療栓塞術(shù)(TACE)是目前肝癌治療中除手術(shù)切除外最常用的治療方法。有研究[14]顯示在肝動脈化療栓塞術(shù)術(shù)后，血清中MMP-2高表達(dá)水平和MMP-2 / TIMP-2的比值，能預(yù)測預(yù)后較差的TACE，由此表明MMP-2以及MMP-2/TIMP-2水平對肝癌預(yù)后有重要意義。

本研究通過提取肝癌細(xì)胞(Hep G2)總RNA，設(shè)計(jì)TIMP-2引物，擴(kuò)增含CDS的共663 bp的基因片段，將該片段進(jìn)行T-A克隆，經(jīng)測序表明pMD18-TIMP-2中TIMP-2的基因序列與GenBank公布的(NM_003255)人TIMP-2基因序列一致。將測序正確的TIMP-2成功構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEX-TIMP-2，測序結(jié)果與上述一致。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，pGEX-TIMP-2在IPTG濃度為0.2 mmol/L 24 ℃ 220 rpm/min誘導(dǎo)表達(dá)3 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)帶有GST標(biāo)簽的目的蛋白在48 kD處得到大量表達(dá)。此外，由于表達(dá)載體上帶有GST標(biāo)簽，有利于后期目的蛋白的純化。本研究中pGEX-TIMP-2原核表達(dá)載體的成功構(gòu)建對后期系統(tǒng)性的研究TIMP-2基因和蛋白功能奠定基礎(chǔ)，并為后期探討TIMP-2對肝癌發(fā)生、發(fā)展的研究提供數(shù)據(jù)支持。

[1] Dimitra Bourboulia，HuiYing Han，Stetler-Stevenson，et al. TIMP-2 modulates cancer cell transcriptional profile and enhances E-cadherin/beta-catenin complex expression in A549 lung cancer cells[J]. Oncotarget，2013，4(1)：163-173.

[2] Lin Zhu，Hong Yu，Shi-Yuan Liu，et al. Prognostic value of tissue inhibitor of metalloproteinase-2 expression in patients with non-small cell lung cancer：a systematic review and meta analysis[J]. Plos one，2015，10(4)：e0124230.

[3] Remillard T C，Bratslavsky G，Stetler-Stevenson W G，et al. Molecular mechanisms of tissue inhibitor of metalloproteinase 2 in the tumor microenvironment[J]. Molecular and Cellular Therapies，2014，2(1)：17.

[4] Kumar A，El-Osta A，Hussain AA，et al. Increased sequestration of matrix metalloproteinases in ageing human Bruch’s membrane：Implications for ECM turnover[J]. Investig Ophthalmol Vis Sci，2010，51(5)：2664-2670.

[5] Breitkreutz D，Koxholt I，Thiemann K，et al. Skin basement membrane: the foundation of epidermal integrity-BM functions and diverse roles of bridging molecules nidogen and perlecan[M]. Biomed Res Int， 2013：179784.

[6] Page-Mccaw A，Ewald AJ，Werb Z. Matrix metalloproteinases and the regulation of tissue remodeling[J]. Nat Rev Mol Cell Bio，2007，8(3)：221-233.

[7] William G，Stetler-Stenenson,Noah Veis Gavil.Normalization of the tumor microenvironment:evidence for tissue inhibitor of metalloproteinase-2 as a cancer therapeutic[J].Connect Tissue Res,2014,55(1):13-19.

[8] Lu H,Yang Z,Zhang H,et al.The expression and clinical significance of matrix metalloproteinase 7 and tissue inhibitor of matrix metalloproteinases 2 in clear cell renal cell carcinoma[J].Exp Ther Med,2013,5(5):890-896.

[9] Groblewska M,Mroczko B,Kozlowski M,et al.Serum matrix metalloproteinase 2 and tissue inhibitor of matrix metalloproteinases 2 in esophageal cancer patients[J].Folia Histochem Cytobiol,2012,50(4):590-598.

[10] 石磊.西紅花酸體內(nèi)外抗氧化作用的研究[J].中國醫(yī)藥指南，2012，10(15)：118-120.

[11] Cox TR,Erler JT.Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix:implications for fibrotic diseases and cancer[J].Dis Model Mech，2011,4(2):165-178.

[12] 廖明，李彥，舒?zhèn)?Genistein 對大鼠肝星狀細(xì)胞的增殖及TGF-β1、MMP-2和TIMP-2表達(dá)的影響[J].世界華人消化雜志，2010，18(3)：229-233.

[13] 張斌.肝纖維化的發(fā)病機(jī)理研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代診斷與治療，2004，15(6)：354-359.

[14] Daniele A,Divella R,Quaranta M,et al.Clinical and prognostic role of circulating MMP-2 and its inhibitor TIMP-2 in HCC patients prior to and after trans-hepatic arterial chemo-emb olization[J].Clinical Biochemistry,2014,47(3):184-190.

Gene clone and expression of human tissue inhibitor of matrix metalloproteinases2 in Escherichia coli

XuGuoqiang1,WangWei1,SunDaquan2,HuangXiaoqiong1,ChenTengxiang1.

1.DepartmentofPhysiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China. 2.DepartmentofBiochemicalandMolecularBiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China.

Objective To construct the recombinant prokaryotic vector of human TIMP-2 (Tissue inhibitor of matrix metalloproteinases 2, TIMP-2), and then express it in E. coli BL21 (DE3). Methods Total RNA was extracted from human hepatoma cell line (Hep G2), and the TIMP-2 cDNA was obtained with RT-PCR. Then, the amplified TIMP-2 coding region by PCR technology was cloned into pMD18-T. After identification and sequence, the TIMP-2 DNA fragment was inserted into the prokaryotic expression vector of pGEX-4T-1, and the recombinant was transformed into E. coli BL21 (DE3) for expression. After induced by IPTG, the recombinant GST-TIMP-2 had been expressed and its molecular weight was approximately 48kD and identified by western blot. Results TIMP-2 gene coding region was cloned from Hep G2 cell and the recombinant plasmid of pGEX-TIMP-2 was successfully constructed and expressed fusion protein GST-TIMP-2 in BL21 induced by IPTG. Conclusion The pGEX-TIMP-2 recombinant vector was successfully constructed.

TIMP-2； pGEX-4T-1； Prokaryotic expression； Hepatocellular carcinoma

貴州省科學(xué)技術(shù)基金[黔科合LG字(2012)007]；貴州省科學(xué)技術(shù)基金[黔科合J字(2014)2025]

R329.2+5

A

1002-6975(2016)04-0344-04

2015-09-25)