徐國強(qiáng) 王偉 孫達(dá)權(quán) 黃小瓊 陳騰祥
(1. 貴州醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室; 2. 貴州醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,貴州 貴陽 550004)
人TIMP-2基因的克隆及其原核表達(dá)
徐國強(qiáng)1王偉1孫達(dá)權(quán)2黃小瓊1陳騰祥1
(1. 貴州醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室; 2. 貴州醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,貴州 貴陽 550004)
目的 構(gòu)建人TIMP-2重組表達(dá)載體,并在大腸桿菌 BL21 (DE3) 中表達(dá)。方法 提取人肝癌細(xì)胞 (Hep G2)總RNA后, 經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增獲得目的片段,插入克隆載體pMD18-T;酶切鑒定和測序后將TIMP-2導(dǎo)入原核表達(dá)載體pGEX-4T-1中,構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-TIMP-2。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌菌株BL21 (DE3)中,IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)后用SDS-PAGE電泳檢測并用western blot驗(yàn)證(蛋白質(zhì)印跡法)。結(jié)果 成功構(gòu)建原核重組表達(dá)載體 pGEX-TIMP-2,并在原核宿主BL21中大量表達(dá)融合蛋白GST-TIMP-2。結(jié)論 克隆人TIMP-2基因并在原核生物中大量表達(dá)。
基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子2; pGEX-4T-1; 原核表達(dá); 肝癌
基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子(TIMPs)是基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的天然抑制劑[1]。兩者形成非共價(jià)復(fù)合物從而抑制MMPS的活性,減少細(xì)胞外基質(zhì)的破壞,保持細(xì)胞間連接的完整性,降低腫瘤的轉(zhuǎn)移,改善預(yù)后[2]。細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)由基底膜和間質(zhì)基質(zhì)構(gòu)成,基底膜是ECM的關(guān)鍵結(jié)構(gòu),它不僅為ECM提供物理支撐,同時還為細(xì)胞提供代謝支持[3]。ECM是腫瘤重要的微環(huán)境之一,能夠影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為,包括調(diào)節(jié)細(xì)胞間的黏附以及腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移[4]。Ⅳ型膠原是基底膜的主要組成成分,主要位于上皮和內(nèi)皮細(xì)胞的基底層[5],MMP-2是Ⅳ型膠原酶,能降解Ⅳ型膠原從而破壞ECM形成癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的通道[6]。相比較TIMPs其他家族成員而言,TIMP-2在大多數(shù)正常成人組織間隙有大量表達(dá),能特異性抑制MMP-2的活性從而減少ECM的降解,降低癌細(xì)胞的遷移能力[5,7]。
越來越多的臨床病理證據(jù)表明,腫瘤組織中TIMP-2的表達(dá)水平較低,這可能與腫瘤的侵襲性增加有關(guān);相反,TIMP-2表達(dá)水平的增加,能抑制腫瘤的生長以及增強(qiáng)化療藥物的敏感性[7]。如在侵襲性胃癌以及腎透明細(xì)胞癌組織、食管癌、胃癌、非小細(xì)胞肺癌患者的血清中TIMP-2表達(dá)水平均較低[8-9];腫瘤抑癌基因E-cadherin表達(dá)上調(diào)與TIMP-2的過度表達(dá)有關(guān),有助于維持細(xì)胞間的黏附及抑制腫瘤的生長[1]。因此有研究表明TIMP-2與腫瘤的發(fā)展有極大關(guān)系。本研究擬構(gòu)建TIMP-2的原核表達(dá)載體pGEX-TIMP-2并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),為后期獲取TIMP-2融合蛋白及探討肝細(xì)胞癌微環(huán)境與肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系提供前期支持。
1.1 材料
1.1.1 試劑 高保真酶 Pyrobest DNA Polymerase;兔抗人多克隆抗體TIMP-2,購于Bioworld公司;限制性內(nèi)切酶EcoR I、Xho I、T4 DNA Ligase、1kb DNA Ladder 和200bp DNA Ladder購自TaKaRa公司;Trizol、質(zhì)粒小提試劑盒、DNA回收試劑盒購自天根生物公司;瓊脂糖購自Sigma公司;SDS PAGE制膠試劑盒購自索萊寶生物公司;冰醋酸、濃鹽酸、異丙醇、氯仿等為分析純AR級;反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司;引物合成及測序由北京Biomed公司完成。
1.1.2 菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基 用于分子克隆的宿主E. coli DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存,用于表達(dá)的宿主 E. coli BL21(DE3)購自天根生物公司??寺≥d體pMD18-T vector和原核表達(dá)載體pGEX-4T-1本實(shí)驗(yàn)室保存。YT液體培養(yǎng)基(細(xì)菌培養(yǎng)用胰蛋白胨16 g/L,細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物 10 g/L,氯化鈉5 g/L);LB液體培養(yǎng)基(細(xì)菌培養(yǎng)用胰蛋白胨10 g/L,細(xì)菌培養(yǎng)用酵母浸粉 5 g/L,氯化鈉10 g/L, 固體培養(yǎng)基添加瓊脂粉15 g/L)用于大腸桿菌的培養(yǎng)。
1.2 方法
1.2.1 目的基因的獲取 根據(jù)GenBank中人TIMP-2的基因序列(NM_003255)和pGEX-4T-1原核表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)合成一對引物。上游引物5’端加入EcoR I酶切位點(diǎn),下游引物5’端加入Xho I酶切位點(diǎn)。引物序列見表1。
表1 TIMP-2上下游PCR引物
1.2.2 RT-PCR獲取目的片段與T載體的構(gòu)建 提取人肝癌細(xì)胞(Hep G2)總RNA,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄的方法合成人源性cDNA第一鏈,以cDNA第一鏈為模板,以表1中核苷酸片段為引物,PCR擴(kuò)增TIMP-2目的基因片段。瓊脂糖凝膠電泳鑒定后,割膠回收目的片段,與pMD18-T 4 ℃過夜連接,產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞并接種于含氨芐青霉素(Amp 100 mg/mL)的LB平板,篩選出陽性菌落,LB液體培養(yǎng)基37 ℃振蕩培養(yǎng)10 h,抽提質(zhì)粒后酶切(EcoR I、Xoh I)分析,1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,并將該菌落送至北京Biomed公司進(jìn)行測序,測序結(jié)果與GenBank中 (NM_003255) 人TIMP-2基因序列比對,并命名為pMD18-TIMP-2保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建 將測序正確的pMD18-TIMP-2質(zhì)粒雙酶切,割膠回收TIMP-2基因片段與同樣雙酶切的原核表達(dá)載體pGEX-4T-1用T4連接酶4 ℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞,涂于含Amp的LB平板,37 ℃過夜培養(yǎng)后,挑取單菌落接種于含Amp的LB液體培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)10 h。抽提質(zhì)粒后雙酶切分析,1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,并對菌落進(jìn)行序列測定,結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)(NM_003255) 人TIMP-2基因序列比對。將陽性克隆子命名為pGEX-TIMP-2。
1.2.4 GST-TIMP-2蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將重組質(zhì)粒pGEX-TIMP-2轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,涂于含Amp的LB平板,37 ℃培養(yǎng)過夜,篩選出陽性菌落,接種于LB液體培養(yǎng)基,37 ℃、200r/min振搖培養(yǎng)過夜。按1∶500的比例取上述菌液接種于20 mL YT培養(yǎng)基中,37 ℃、200r/min振搖培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.6時,加入終濃度為0.2 mmol/L 異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG), 24 ℃ 220 rpm/min誘導(dǎo)表達(dá)3 h,并取未加IPTG誘導(dǎo)的菌液3 mL留作對照。分別取各組菌液2 mL離心12 000r/min,5 min,收集菌體,PBS緩沖液重懸后加入 5×SDS上樣緩沖液加熱變性,12%的SDS-PAGE檢測融合蛋白。
1.2.5 Western Blot鑒定 取誘導(dǎo)及未誘導(dǎo)的菌液1 mL,離心后搜集菌體,分別向菌體沉淀中加入PBS、5×SDS上樣緩沖液振蕩混勻,加熱變性后12%的SDS-PAGE凝膠電泳,將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上,經(jīng)Westrn blotting封閉液封閉后依次加入兔多克隆一抗、羊抗兔二抗,最后用ECL-Plus化學(xué)發(fā)光試劑顯色,于化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)采集圖像保存。
2.1 人TIMP-2基因的獲取及重組載體pMD18-TIMP-2的構(gòu)建與鑒定 (1)目的基因的獲?。禾崛∪烁伟┘?xì)胞(Hep G2)總RNA,經(jīng)PCR擴(kuò)增獲取TIMP-2基因片段,產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,在約663 bp處有明顯條帶(圖1),與預(yù)期的TIMP-2基因片段大小一致。(2)T載體的構(gòu)建:將pMD18-TIMP-2載體陽性菌落,質(zhì)粒抽提后用EcoR I、Xoh I進(jìn)行雙酶切,1%的瓊脂糖凝膠電泳,鑒定為陽性克隆(圖2)。(3)測序鑒定:將瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確的陽性菌落擴(kuò)大培養(yǎng)12 h后,取1 mL送北京Biomed公司進(jìn)行測序,經(jīng)測序表明pMD18-TIMP-2中TIMP2的堿基序列與GenBank公布的(NM_003255)人TIMP-2基因序列一致,即TIMP-2基因成功克隆到pMD18-T載體。
2.2 人TIMP-2重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-TIMP-2的構(gòu)建 (1)人TIMP-2重組表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定:原核表達(dá)載體pGEX-TIMP-2的質(zhì)粒酶切結(jié)果見圖3,結(jié)果中有兩條帶,在約4900 bp處的表達(dá)載體及663 bp處的目的蛋白,由此可初步鑒定人TIMP-2重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。(2)測序鑒定:將初步鑒定的陽性菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后,菌液送至北京Biomed公司進(jìn)行測序鑒定,原核表達(dá)載體pGEX-TIMP-2中TIMP-2的基因序列與GenBank公布的(NM_003255)人TIMP-2基因序列一致,表明原核表達(dá)載體pGEX-TIMP-2構(gòu)建成功。
注:A為瓊脂糖凝膠電泳檢測人總RNA;B為TIMP-2基因的PCR產(chǎn)物,M:200 bp ladder marker;1:人TIMP-2基因cDNA片段。圖1 RT-PCR擴(kuò)增人TIMP-2 cDNA
注:M:200 bp ladder marker; 1:pMD18T空載體; 2和3:pMD18T-TIMP-2用EcoR I、Xho I雙酶切產(chǎn)物。圖2 瓊脂糖凝膠電泳鑒定重組質(zhì)粒pMD18T-TIMP-2
注;M:1000 bp ladder marker;1和2:pGEX-TIMP-2用EcoR I、Xho I進(jìn)行雙酶切產(chǎn)物。圖3 瓊脂糖凝膠電泳鑒定重組原核表達(dá)質(zhì)粒
2.3 融合蛋白TIMP-2的誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定 (1)誘導(dǎo)表達(dá):將誘導(dǎo)表達(dá)的pGEX-TIMP-2菌體沉淀經(jīng)12%的SDS-PAGE鑒定,pGEX-TIMP-2菌液樣品在約48 kD處出現(xiàn)明顯的目的蛋白條帶,而未加IPTG誘導(dǎo)的菌體樣品在48 kD處無明顯條帶。結(jié)果表明TIMP-2蛋白被成功誘導(dǎo)表達(dá),結(jié)果見圖4。(2)Western Blot鑒定GST-TIMP-2融合蛋白:一抗為TIMP-2多克隆抗體,二抗為羊抗兔IgG,進(jìn)行Western Blotting免疫印跡分析,化學(xué)發(fā)光顯色后結(jié)果見圖5,GST-TIMP-2融合蛋白與兔多克隆抗體呈陽性反應(yīng),在約48 kD處有特異性蛋白反應(yīng)條帶。
注:M:預(yù)染marker; 1、2、3均為在IPTG為0.2 mm/L時pGEX-TIMP-2菌株的表達(dá)產(chǎn)物;4、5、6均為未加IPTG誘導(dǎo)的pGEX-TIMP-2菌株。圖4 考馬斯亮藍(lán)R-250檢測融合蛋白TIMP-2
圖5 Western Blot鑒定GST-TIMP-2蛋白
不同的TIMPs對MMPs的親和力不同且每一種TIMPs都可以與幾種MMPs以非共價(jià)鍵形式生成1∶1的復(fù)合物,保持著相對的平衡狀態(tài),對組織的修復(fù)、重塑、胚胎的插入、腫瘤細(xì)胞的浸潤及轉(zhuǎn)移中有重要的意義[10]。 MMPs可通過調(diào)節(jié)ECM的合成與分解,使膠原的合成與降解處于平衡狀態(tài),當(dāng)平衡遭到破壞,將導(dǎo)致ECM修復(fù)與重塑異常[11]。ECM的堆積容易造成組織纖維化,有研究[12-13]顯示在肝臟TIMP-2 能抑制 MMP2的活性,阻止ECM的降解,促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生,隨著肝纖維化的發(fā)展,MMPs的表達(dá)下降而TIMP-1和TIMP-2的表達(dá)升高,致使MMPs/TIMPs值降低,膠原降解減少,結(jié)果使總體ECM總量較正常肝臟增加3~8倍從而加劇了肝纖維化。肝動脈化療栓塞術(shù)(TACE)是目前肝癌治療中除手術(shù)切除外最常用的治療方法。有研究[14]顯示在肝動脈化療栓塞術(shù)術(shù)后,血清中MMP-2高表達(dá)水平和MMP-2 / TIMP-2的比值,能預(yù)測預(yù)后較差的TACE,由此表明MMP-2以及MMP-2/TIMP-2水平對肝癌預(yù)后有重要意義。
本研究通過提取肝癌細(xì)胞(Hep G2)總RNA,設(shè)計(jì)TIMP-2引物,擴(kuò)增含CDS的共663 bp的基因片段,將該片段進(jìn)行T-A克隆,經(jīng)測序表明pMD18-TIMP-2中TIMP-2的基因序列與GenBank公布的(NM_003255)人TIMP-2基因序列一致。將測序正確的TIMP-2成功構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEX-TIMP-2,測序結(jié)果與上述一致。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),pGEX-TIMP-2在IPTG濃度為0.2 mmol/L 24 ℃ 220 rpm/min誘導(dǎo)表達(dá)3 h,結(jié)果發(fā)現(xiàn)帶有GST標(biāo)簽的目的蛋白在48 kD處得到大量表達(dá)。此外,由于表達(dá)載體上帶有GST標(biāo)簽,有利于后期目的蛋白的純化。本研究中pGEX-TIMP-2原核表達(dá)載體的成功構(gòu)建對后期系統(tǒng)性的研究TIMP-2基因和蛋白功能奠定基礎(chǔ),并為后期探討TIMP-2對肝癌發(fā)生、發(fā)展的研究提供數(shù)據(jù)支持。
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Gene clone and expression of human tissue inhibitor of matrix metalloproteinases2 in Escherichia coli
XuGuoqiang1,WangWei1,SunDaquan2,HuangXiaoqiong1,ChenTengxiang1.
1.DepartmentofPhysiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China. 2.DepartmentofBiochemicalandMolecularBiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China.
Objective To construct the recombinant prokaryotic vector of human TIMP-2 (Tissue inhibitor of matrix metalloproteinases 2, TIMP-2), and then express it in E. coli BL21 (DE3). Methods Total RNA was extracted from human hepatoma cell line (Hep G2), and the TIMP-2 cDNA was obtained with RT-PCR. Then, the amplified TIMP-2 coding region by PCR technology was cloned into pMD18-T. After identification and sequence, the TIMP-2 DNA fragment was inserted into the prokaryotic expression vector of pGEX-4T-1, and the recombinant was transformed into E. coli BL21 (DE3) for expression. After induced by IPTG, the recombinant GST-TIMP-2 had been expressed and its molecular weight was approximately 48kD and identified by western blot. Results TIMP-2 gene coding region was cloned from Hep G2 cell and the recombinant plasmid of pGEX-TIMP-2 was successfully constructed and expressed fusion protein GST-TIMP-2 in BL21 induced by IPTG. Conclusion The pGEX-TIMP-2 recombinant vector was successfully constructed.
TIMP-2; pGEX-4T-1; Prokaryotic expression; Hepatocellular carcinoma
貴州省科學(xué)技術(shù)基金[黔科合LG字(2012)007];貴州省科學(xué)技術(shù)基金[黔科合J字(2014)2025]
R329.2+5
A
1002-6975(2016)04-0344-04
2015-09-25)