潘 佳,李艷華,程傳耀,王亞秋，周 芳,王建

河南大學(xué)淮河醫(yī)院 腫瘤科，河南 開封 475000

熱療對小鼠骨肉瘤的療效及腫瘤組織HSP 70基因表達

河南大學(xué)淮河醫(yī)院 腫瘤科，河南 開封 475000

〔目的〕 探索熱療對原代細胞系及耐藥骨肉瘤細胞系成瘤體積的影響，并用免疫組化方法檢測不同細胞系熱療后HSP 70基因表達?！卜椒ā?原代細胞系和耐藥細胞系接種小鼠16只，按體積相似分成4組。實驗組用熱療43 ℃ 30 min對照組未進行熱療處理，根據(jù)腫瘤體積大小及生存時間繪制曲線。用免疫組化方法測定熱療后不同細胞系成瘤的組織在HSP 70的基因表達情況?！步Y(jié)果〕 熱療處理后腫瘤生長與對照組相比有明顯的差異(P<0. 05)。耐藥組與原代組比較未見明顯差異(P>0. 05)；熱療后實驗組腫瘤組織HSP 70蛋白表達明顯高于未熱療處理組實驗小鼠組織(P<0.05),Saos-2細胞系成瘤鼠組和Saos-2/MTX4.4細胞系成瘤鼠組熱處理和無熱處理組間未見明顯差異(P>0.05)。〔結(jié)論〕 熱療對耐藥細胞系和原代細胞系成瘤均有殺傷作用。熱療后兩種細胞系都表現(xiàn)出HSP 70表達升高。

動物實驗；骨肉瘤；熱療；HSP 70

骨肉瘤是發(fā)生在青少年骨的常見腫瘤，疾病引起患者肢體功能障礙，嚴重的危及患者的生命。由于手術(shù)治療和化療的綜合方法應(yīng)用，治療效果明顯改善，但是由于耐藥問題的存在，療效不能進一步提高，需要尋找新的治療方法和途徑是解決問題的關(guān)鍵。熱療在骨肉瘤治療中進行了臨床應(yīng)用，并提高了治療效果。我們試圖通過局部熱療的方法，觀察對成瘤原代細胞系和成瘤耐藥細胞系的熱療效果，并用免疫組化方法檢測HSP基因在成瘤原代細胞系及成瘤耐藥細胞系不同表達，探索可能影響熱療效果的因素。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及實驗細胞系

Saos-2原代細胞系購自中國科學(xué)院上海細胞生物所。Saos-2/MTX4.4細胞系，我們實驗室在原代細胞系逐漸升高藥物濃度，沖擊法培養(yǎng)成功，液氮環(huán)境下保存后，實驗前復(fù)蘇細胞系，并檢測具備耐藥細胞系特點。

實驗動物C57BL6小鼠16只，雄性，周齡8周，體重(20±2) g，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所提供，清潔級飼養(yǎng)。所有動物實驗均參照我國《實驗動物管理條例》中有關(guān)動物福利的條規(guī)進行。

1.2 實驗試劑

HSP 70一抗(Sino,Bidogical Inc )辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG二抗，購自北京博奧森生物技術(shù)公司，免疫化學(xué)試劑盒(ACE-0037)購自福州邁新公司。

1.3 實驗儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱，美國Therm公司；OLYMPUS IX-70倒置相差顯微鏡，日本奧林巴斯株式會社；TGHM型電熱光聚焦加熱燈(日本Olympus公司;溫度測量及記錄系統(tǒng)(美國Physitemp公司)。

1.4 細胞培養(yǎng)及處理

骨肉瘤Saos-2細胞系及Saos-2/MTX4.4細胞系。常規(guī)37 ℃體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用1 640培養(yǎng)溶液與體積分數(shù)10%的胎牛血清，細胞株生長至對數(shù)期實驗備用。

1.5 體內(nèi)實驗

1.5.1 動物模型制備 取對數(shù)生長期的Saos-2細胞系及Saos-2/MTX4.4細胞系，用2.5 g/L胰酶消化，重懸于PBS中。調(diào)節(jié)細胞濃度至1×107個/mL，兩種細胞系分別接種于16只實驗小鼠背部皮下，0.2 mL/只。接種1周，腫瘤直徑達到5 mm左右；選Saos-2細胞系與Saos-2/MTX4.4細胞系腫瘤大小一致的4只小鼠分別做1實驗組和對照1組實驗、實驗2組和對照2組實驗。

1.5.2 荷瘤小鼠熱療 10 g/L戊巴比妥鈉(0.1～0.16 mL/只)麻醉小鼠后，以TGHM型電熱光聚焦加熱燈對荷瘤小鼠移植瘤進行局部加熱。加熱3～5 min后溫度達預(yù)定值(43 ℃)后開始計時，并通過隨時調(diào)節(jié)光圈使溫度保持在預(yù)定溫度±1 ℃;同時用2個熱電偶分別插入腫瘤中心和直腸，對腫瘤中心溫度及全身溫度(直腸溫度)進行監(jiān)測;分別給予實驗組小鼠43 ℃ 30 min熱療，然后將熱電偶取下，待其蘇醒后常規(guī)飼養(yǎng)。每只小鼠間隔24 h接受1次熱療，共接受3次。對照組除不加熱外其余步驟同實驗組。

1.5.3 觀察腫瘤生長情況 熱療后動態(tài)觀察小鼠整體狀態(tài)，以及腫瘤體積的改變。熱療后0,7,14,21 d測量腫瘤大小。小鼠腫瘤體積=1/2(長徑×短徑×短徑)。

1.5.4 免疫組化測定腫瘤組織HSP表達 第21天不同細胞系實驗組和對照組小鼠斷頸處死，切取不同實驗組腫瘤組織，常規(guī)方法固定處理，制作病理切片，用不加一抗組織片作陰性對照，用陽性組織切片作陽性對照。HSP 70一抗(Sino,Bidogical Inc )，免疫組化用鏈菌素-親生物素過氧化物酶法(S-P)方法，操作按試劑盒要求進行，試劑盒來購自福州邁新公司。

1.6統(tǒng)計方法

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件處理，計量數(shù)據(jù)以t檢驗表示，組間比較采用單因素方差分析和LSD,P<0.05，視為有顯著性差異。

2 實驗結(jié)果

2.1 熱療對腫瘤生長抑制情況

對腫瘤體積的動態(tài)測量結(jié)果(圖1)顯示，43 ℃持續(xù)30 min的熱療，3次熱療后對小鼠成瘤的生長顯示出抑制作用，腫瘤生長與對照組相比有明顯的差異(P<0. 05)。耐藥組與原代組比較未見明顯差異(P>0. 05)，熱療與無熱療小鼠結(jié)果見圖2與圖3。

圖1 成瘤實驗小鼠腫瘤體積與生存時間曲線圖

2.2 成瘤鼠腫瘤組織HSP 70免疫組化表達

實驗小鼠于21 d處死，取腫瘤組織做實驗，每組做3個平行實驗，用不加一抗組織片作陰性對照，用陽性組織切片作陽性對照。HSP 70一抗(Sino,Bidogical Inc )，免疫組化用鏈菌素-親生物素過氧化物酶法(S-P)，操作按試劑盒要求進行，按染色程度進行評分:無著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，淺褐色為3分，深褐色為4分。以陽性細胞所占百分比進行評分:陽性細胞比例占25%為1分，陽性細胞占26%～50%為2分，陽性細胞占51%～75%為3分，陽性細胞占所占76%～100%為4分。以上述兩項評分之和表示最后得分。實驗重復(fù)3次，結(jié)果見圖4、圖5)。熱療后實驗組腫瘤組織HSP 70蛋白表達明顯高于未熱療處理實驗小鼠組織(P<0.05),Saos-2細胞系成瘤鼠組和Saos-2/MTX4.4細胞系成瘤鼠組熱處理和無熱處理組間未見明顯差異(P>0.05)。

圖2 熱療后成瘤鼠

圖3 無熱療成瘤鼠

3 討論

熱療在骨肉瘤的臨床治療方面進行了應(yīng)用，用局部消融和微波治療方法，提高了治療效果，提高了保肢率[1-2]，但是臨床實踐[3-4]發(fā)現(xiàn),在治療時，局部熱療溫度不好控制，因此，沒有被廣泛推廣應(yīng)用。我們實驗用原代細胞系和耐藥細胞系建立荷瘤小鼠模型，用電熱光聚焦加熱燈對荷瘤小鼠移植瘤進行局部加熱，溫度達預(yù)定值(43 ℃)后開始計時30 min，每24 h熱療1次，共進行3次。觀察腫瘤體積變化，發(fā)現(xiàn)熱療對原代(Saos-2)細胞系成瘤鼠腫瘤和對耐藥細胞系(Saos-2/MTX4.4)均有明顯的抗腫瘤作用，且對兩種成瘤細胞系腫瘤殺傷效果未見明顯差別。提示：熱療可能是克服耐藥骨肉瘤的一種治療方法。Takemoto等[5]在動物實驗骨肉瘤模型上對多種藥物也進行了熱化療實驗，試驗溫度為41.5 ℃、時間30 min，得出結(jié)論：熱療對骨肉瘤腫瘤有提高療效的作用，烷化劑在高溫下可能是多種腫瘤的首選藥物。熱休克蛋白是生物受到環(huán)境中物理、化學(xué)、生物、精神等刺激時發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)而合成的蛋白質(zhì)。加熱可以提高熱休克蛋白的表達，熱體克蛋白種類有HSP 100家族 ，HSP 90家族, HSP 70家族, HSP 60家族，小分子量HSP家族,通過對原代細胞系成瘤鼠腫瘤組和耐藥細胞系成瘤鼠腫瘤組的熱療與未熱療組織，用免疫組化方法對HSP 70基因表達進行檢測，熱療后實驗組腫瘤組織HSP 70蛋白表達明顯高于未熱療處理組實驗小鼠組織,Saos-2細胞系成瘤鼠組和Saos-2/MTX4.4細胞系成瘤鼠組熱處理組和無熱處理組間未見明顯差異。說明熱療后細胞產(chǎn)生生理保護機制，促進細胞產(chǎn)生耐熱的生物活性，所以，防止耐熱活性的產(chǎn)生需要在短時間內(nèi)對腫瘤組組進行殺傷，殺傷方案可以提高熱療溫度，也可以提高每次熱療的時間，防止耐熱腫瘤細胞系產(chǎn)生，我們實驗結(jié)果與Trieb[6]做出的結(jié)果相似。

圖4 陽性實驗組組織切片

圖5 陰性實驗組組織切片

[1] Fan Q, Ma B, Guo A. Zhonghua wai ke za zhi .Treatment of malignant or aggressive bone tumors with microwave induced hyperthermia[J]. Chinese journal of surgery, 1997,35 (8):484-487.

[2] Tateishi A, Miki H, Imamura T, Cho S, et al. Hyperthermic isolated regional perfusion for the treatment of osteosarcoma in the lower extremity[J].Nakano H, 1999,178(1):27-32.

[3] Lu S , Wang J, Hu Y. Microwave heating and neoadjuvant chemotherapy for malignant bone tumor[J]. Chinese journal of surgery,1997,35(4):196-199.

[4] van Ginkel R J, Schraffordt Koops H, de Vries E G, et al. Hyperthermic isolated limb perfusion with cisplatin in four patients with sarcomas of soft tissue and bone[J]. Eur J Surg Oncol，1996,22(5):528-531.

[6] Trieb K1, Lechleitner T, Lang S, et al. Heat shock protein 72 expression in osteosarcomas correlates with good response to neoadjuvant chemotherapy[J]. Hum Pathol, 1998,29(10):1050-1055.

[責任編輯 李武營]

Effect of hyperthermia on osteosarcoma in mice and the expression of HSP 70 gene in tumor tissue

Oncology Department of Huaihe Hospital of Henan University， Kaifeng 475000, China

〔Objective〕The antiosteosarcoma effects of hyperthermia were explored by detecting tumor cell volume and HSP 70 gene expression in different cell lines.〔Methods〕Sixteen mice were inoculated into the primary cell line and drug resistant cell line. These mice were divided into 4 groups according to their volume. The hyperthermia treatment group was treated at 43 ℃ for 30 min. The expression of HSP 70 gene in different tumor cell lines was determined using immunohistochemistry.〔Results〕Compared with the control group, the tumor growth was significantly different after hyperthermia treatment (P<0.05) in the experimental group. The expression of HSP 70 protein in the experimental group was significantly higher than that in the untreated group (P<0.05), but the difference was not significant (P>0.05) (P<0.05), and there was no significant difference between heat treated group and non-heat-treated group (P>0.05). 〔Conclusion〕Hyperthermia has the killing effect on the tumor cell lines and the primary cell lines. The hyperthermia treatment can increase the HSP 70 expression i in the same cell line.

Animal experiment; Osteosarcoma; Hyperthermia; HSP70

1672-7606(2016)04-0232-04

2016-10-17

河南省科技攻關(guān)項目(162102310394)

潘佳(1973-)，河南開封人，主治醫(yī)師，從事臨床腫瘤疾病的診治工作。

R783.1

A

王建軍(1968-)，河南開封人，副教授，從事臨床腫瘤學(xué)的的研究及教學(xué)工作。