趙莉娟 鄧辰亮 楊松林

惡性黑色素瘤靶向治療的研究進展

趙莉娟 鄧辰亮 楊松林

惡性黑色素瘤是皮膚黑色素細胞來源的高度惡性腫瘤，發(fā)病機制尚未清楚，黑色素細胞痣惡變、紫外線照射、病毒感染等多種因素均與其發(fā)生有密切關(guān)系。由于其具有轉(zhuǎn)移早、病情隱匿的特點，早診斷、早治療是惡性黑色素瘤治愈的關(guān)鍵。當前各種靶向治療在抗腫瘤領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用，如嵌合抗原抗體及攜帶藥物的重組外泌體與惡性黑色素瘤細胞的靶向結(jié)合，已在體外實驗中取得了顯著效果?，F(xiàn)綜合國內(nèi)外文獻，就嵌合抗原受體修飾T細胞（CAR-T）和外泌體用于治療惡性黑色素瘤的進展綜述如下。

惡性黑色素瘤；靶向治療；嵌合抗原受體修飾T細胞（CAR-T）；人內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒K包膜蛋白（HERV-K）；外泌體

惡性黑色素瘤（malignant melanoma）是起源于胚胎期神經(jīng)嵴的惡性腫瘤，其惡性度極高，預后較差?？砂l(fā)生于皮膚、眼球、消化道、生殖系統(tǒng)等部位，但其中以皮膚惡性黑色素瘤最常見[1]。由于惡性黑色素瘤惡性度高，易于早期轉(zhuǎn)移，即使早期進行根治手術(shù)，患者5年生存率也低于70%[2]。免疫靶向治療與傳統(tǒng)化學療法相比優(yōu)勢明顯，因而日益成為治療惡性腫瘤的新方向。嵌合抗原受體修飾T細胞（chimeric antigen receptors T cell,CAR-T）是免疫靶向治療藥的代表之一，也是當前過繼性細胞治療技術(shù)中的一項新成果，因其能表達人工合成受體并能特異性識別靶細胞，正成為振奮人心的腫瘤治療技術(shù)[3]。據(jù)報道，CD19特異性CAR-T已在B細胞白血病及淋巴瘤的臨床試驗中取得了明顯療效[4-5]，其治療其他腫瘤的效果正進行臨床預試驗。國外實驗報道，經(jīng)人工改造的外泌體及惡性黑色素瘤表面發(fā)現(xiàn)的人內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒K（human endogenous retrovirus,HERV-K）包膜蛋白可為惡性黑色素瘤的免疫治療提供新的臨床思路[6]。

1 CAR-T在惡性黑色素瘤中的應用

1.1 CAR-T 嵌合抗原受體（chimeric antigen receptors,CAR）是一種重組抗原受體，具有結(jié)合抗原并激活T細胞的功能。至目前為止，CAR已有3代設(shè)計模型。1991年有3個實驗室首次報道了CAR的設(shè)計[7]，第1代CAR不含共刺激分子，只能引起T細胞的短暫增殖和低水平的細胞因子分泌，雖不能提供T細胞持續(xù)的抗腫瘤作用，但可使T細胞不依賴于主要組織相容性復合體（major histocompatibilitycomplex,MHC）-I類分子識別靶細胞。隨后Smith-Garvin等[8]構(gòu)造了含有CD28或4-1BB共刺激分子的2代CAR，在臨床前模型中發(fā)現(xiàn)4-1BB對CAR的功效更有益[9]。最近Long等[10]發(fā)現(xiàn)CD28信號是產(chǎn)生有效的臨床T細胞制品的關(guān)鍵，而4-1BB可提高CAR的細胞持久性，于是結(jié)合2個共刺激分子設(shè)計出了第3代CAR。CAR-T是將抗體的抗原結(jié)合部與CD3-δ鏈在體外偶聯(lián)成一個嵌合蛋白，通過基因轉(zhuǎn)導的方法轉(zhuǎn)染患者的T細胞，T細胞經(jīng)“重編碼”后，可生成大量的腫瘤特異性CAR-T。CAR-T的大體治療過程分為4步：⑴抽取患者外周血，并分離提取出免疫T細胞；⑵通過基因工程給T細胞加入一個能識別腫瘤細胞并能同時激活T細胞的嵌合抗體，生成CAR-T；⑶體外培養(yǎng)，大量擴增CAR-T細胞；⑷將擴增好的CAR-T回輸?shù)交颊唧w內(nèi)。整個“提取——修飾——擴增”過程大約需要2周。與傳統(tǒng)的T細胞識別抗原相比，經(jīng)CAR識別抗原不受MHC的限制，同時第2、3代CAR可通過共刺激分子信號加強T細胞的抗腫瘤效果。

1.2 CAR-T靶向治療惡性黑色素瘤 為了早期診斷惡性黑色素瘤，學者們在尋求免疫標志物方面做出了許多努力。有學者采用免疫組化檢測S-100、HMB-45、Tyrosinasa等多種標志物在惡性黑色素瘤及良性痣中的表達[11]，發(fā)現(xiàn)這些標志物在敏感性及特異性上都存在不足之處，更難以成為免疫治療的靶向。人內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒K（human endogenous retroviruses-K,HERV-K）包膜蛋白是多種腫瘤細胞表面的相關(guān)性抗原[6,12-17]，包括乳腺癌、卵巢癌、惡性黑色素瘤等，其在正常細胞表面均不表達。HERV-K與惡性黑色素瘤的早期轉(zhuǎn)移潛能呈正相關(guān)性，Krishnamurthy等[6]利用HERV-K的腫瘤特異性，于T細胞表面設(shè)計相關(guān)CAR，發(fā)現(xiàn)CAR-T可特異性識別HERV-K并與其結(jié)合，發(fā)揮抗腫瘤作用。惡性黑色素瘤早期即可通過血液轉(zhuǎn)移，傳統(tǒng)的手術(shù)切除、化學療法、放射療法的效果不佳，預臨床試驗數(shù)據(jù)顯示，嵌合HERV-K受體的T細胞（CAR-T）可準確作用于表達HERV-K的腫瘤細胞表面，并殺傷腫瘤細胞。由于HERV-K在正常細胞表面無表達，其特異性表達于HIV、白血病及多種腫瘤細胞表面，因此，嵌合HERV-K受體的T細胞可用于多種腫瘤的治療。

此外，黑色素瘤細胞分化的抗原糖蛋白（glycoprotein,gp）100有較強的免疫原性，并在惡性黑色素瘤中過度表達，可作為惡性黑色素瘤靶向治療的靶點之一[18]。Johnson等[19]將對gp100有特異性反應的T細胞分離后，將T細胞抗原受體轉(zhuǎn)染給惡性黑色素瘤患者的淋巴細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)19%患者的腫瘤體積發(fā)生減小。有學者將GPA7作為胞外區(qū)，結(jié)合T細胞的胞內(nèi)區(qū)設(shè)計出CAR-T細胞，經(jīng)轉(zhuǎn)染后的T細胞能特異性識別惡性黑色素瘤表面的gp100[20]。隨后將等量的CAR-T細胞與普通T細胞分別注射到惡性黑色素瘤小鼠模型中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射CAR-T細胞小鼠的腫瘤體積比注射普通T細胞小鼠的腫瘤體積明顯縮小。黏附分子L1-CAM在多種實體瘤，如惡性黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌中均有過度表達，有學者依據(jù)這類細胞表面標志物特性設(shè)計相應的CAR-T，在試驗中取得了明顯的抗腫瘤效果[21]。

理論上靶向抗原應該是特異性表達于惡性黑色素瘤細胞表面，在正常細胞和組織表面不表達，但實際上這種特異性靶向抗原非常少。例如Gp100、S-100、HMB-45、Tyrosinasa等在良性痣及白癜風組織中均有表達，如果基于類似抗原設(shè)計CAR-T，很可能對正常組織產(chǎn)生攻擊作用，即脫靶效應。HERV-K雖在多種實體瘤表面均有表達，但在正常細胞組織無表達，是目前治療惡性黑色素瘤最為理想的靶點。

2 外泌體在惡性黑色素瘤中的應用

外泌體作為一種可以包裹藥物的載體，近年來也被用于腫瘤的靶向治療。外泌體是經(jīng)細胞分泌產(chǎn)生的一種自然產(chǎn)物[22]，它具有低免疫原性、無毒副作用[23]；且來源廣，具有磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，易于與靶細胞的細胞膜融合[24]；分子結(jié)構(gòu)小，分子量為納米級（10～100 nm），可避免單核細胞的吐噬作用，且易于穿透腫瘤組織毛細血管向深層組織浸潤[25]?，F(xiàn)有試驗發(fā)現(xiàn)，由內(nèi)皮細胞及干細胞分泌的外泌體作為抗腫瘤藥物的載體，其優(yōu)勢明顯、不良反應小[26]。經(jīng)未成熟樹突狀細胞（imDCs） 分泌的外泌體因缺乏 CD40、CD86、MHC-I、MHC-II等表面標志物[26]，免疫原性低，且imDCs-外泌體表面表達糖蛋白（Lamp2b），這種表面蛋白融合了iRGD靶向蛋白，可特異性識別腫瘤細胞表面的αⅤ整合素。目前，臨床上許多抗腫瘤藥物因劑量依賴性而應用受限，如阿霉素對多種腫瘤均有抑制作用，但因其對心血管具有劑量依賴性而限制其應用[27]。劑量依賴性產(chǎn)生的原因主要是藥物缺乏特異性作用于腫瘤細胞的載體，而廣泛作用于正常細胞引起。利用外泌體的靶向結(jié)合作用，可以將阿霉素等藥物直接作用于腫瘤細胞，從而減少對正常細胞造成的損傷。通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)過表達iRGD就可以得到大量攜帶iRGD的外泌體?；谶@一原理，Tian等[26]設(shè)計小鼠模型，將阿霉素整合到imDCs-外泌體中，發(fā)現(xiàn)融合iRGD靶向蛋白的外泌體能特異性作用于表達αⅤ整合素的乳腺腫瘤細胞，使外泌體通過胞吐釋放阿霉素，在體內(nèi)充分發(fā)揮抗腫瘤作用，并且通過切片觀察發(fā)現(xiàn)，并未損傷小鼠正常組織。還有實驗發(fā)現(xiàn)，融合iRGD靶向蛋白的外泌體對αⅤ整合素具有高度的特異性識別與親和力，在小鼠的乳腺癌模型中發(fā)揮顯著的靶向治療作用[27]。iRGD靶向蛋白不僅可以直接結(jié)合腫瘤細胞表面的αⅤ整合素，還可以促使抗腫瘤藥物向腫瘤組織血管內(nèi)滲透[28]。αⅤ整合素在多種腫瘤細胞表面均有表達，其中惡性黑色素瘤細胞表面也特異性表達這類整合素，雖然目前無實驗驗證外泌體作為藥物載體治療惡性黑色素瘤的有效性，但是，小鼠的乳腺癌模型為外泌體治療惡性黑色素瘤提供了臨床思路。

3 展望

惡性黑色素瘤是一種惡性程度較高的皮膚腫瘤，發(fā)生轉(zhuǎn)移后很難通過傳統(tǒng)治療得到有效的治療效果，繼手術(shù)、化學治療、放射治療手段后，免疫治療日益成為研究熱點。目前惡性黑色素瘤靶向治療的瓶頸在于尚未發(fā)現(xiàn)理想的靶向標志物， HERV-K這類細胞表面標志物存在于多種實體瘤表面，特異性相對較差，現(xiàn)國內(nèi)外學者正積極尋找惡性黑色素瘤的特異性抗原，相信這一新突破將為惡性黑色素瘤患者帶來福祉。

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2016-07-24）

10.3969/j.issn.1673-7040.2017.01.017.

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上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院 整形外科，上海 200233

楊松林,Email:yangsonglin1961@vip.qq.com

本文引用格式：趙莉娟，鄧辰亮，楊松林.惡性黑色素瘤靶向治療的研究進展[J].中國美容整形外科雜志,2017,28(1):57-59.