熊強(qiáng)，王延斌，韓浩

(南京工業(yè)大學(xué) 食品與輕工學(xué)院，江蘇 南京，210009)

雙歧桿菌的分子生物學(xué)鑒定方法的比較

熊強(qiáng)*，王延斌，韓浩

(南京工業(yè)大學(xué) 食品與輕工學(xué)院，江蘇 南京，210009)

利用實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的雙歧桿菌特異性引物，采用降落聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)的方法對(duì)供試菌株的16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增，比較細(xì)菌分別通用引物和雙歧桿菌特異性引物對(duì)雙歧桿菌屬不同菌株及參考菌株擴(kuò)增效果的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)菌通用引物對(duì)不同雙歧桿菌進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增出來(lái)的條帶不清晰，而用雙歧桿菌特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增出來(lái)的條帶清晰。因此，該方法可以準(zhǔn)確地鑒定雙歧桿菌，為雙岐桿菌的鑒定提供了理論依據(jù)。

雙歧桿菌；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；分子生物學(xué)；鑒定

雙歧桿菌是1899年巴斯德研究院的TISSIER博士首先在以母乳喂養(yǎng)的嬰兒糞便中發(fā)現(xiàn)并分離出來(lái)的[1]。它是常見(jiàn)的人體腸道菌群中的重要成員[2]，作為一類(lèi)重要的益生菌，雙歧桿菌在人體內(nèi)可以維持腸道內(nèi)正常微生物的菌群平衡，防止致病菌的入侵與定植；作為B類(lèi)維生素的良好來(lái)源，可以在腸道中合成VB1、VB2、VB6、VK等多種維生素和各種氨基酸；其的生理和代謝特征可以在癌癥腸道疾病、糖尿病、肥胖病以及其他疾病的治療方面起到良好的效果[3-7]。

以微生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理生化特征等表型特征為依據(jù)的傳統(tǒng)微生物分類(lèi)鑒定方法存在步驟繁瑣、耗時(shí)且準(zhǔn)確度不高的問(wèn)題。20世紀(jì)90年代出現(xiàn)了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)擴(kuò)增16S rRNA分析的技術(shù)，16S rRNA中有多個(gè)區(qū)段具有保守性，可以根據(jù)這些保守區(qū)設(shè)計(jì)細(xì)菌通用引物，此外16S rRNA具有適宜的長(zhǎng)度、良好的進(jìn)化保守性，所以成為了細(xì)菌分子鑒定的標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)識(shí)序列[8-11]。

本研究利用實(shí)驗(yàn)室自主設(shè)計(jì)的雙歧桿菌特異性引物，采用降落聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法對(duì)供試菌株的16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增，比較了細(xì)菌通用引物和雙歧桿菌特異性引物對(duì)雙歧桿菌屬不同菌株及參考菌株擴(kuò)增效果的影響，為雙岐桿菌分子生物學(xué)鑒定提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

長(zhǎng)雙歧桿菌(CICC6068)、短雙歧桿菌(CICC6079)、兩歧雙歧桿菌(CICC6168)、青春雙歧桿菌(CICC6070)，購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；雙歧桿菌B4，B13，B17，B21，B23，B24及大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、乳酸菌、放線(xiàn)菌、乳雙歧桿菌為實(shí)驗(yàn)室保存；細(xì)菌通用引物購(gòu)自南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司；ExTaqDNA聚合酶，DNA Marker，基因組抽提試劑盒，膠回收試劑盒，質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自大連寶生物(TaKaRa)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PCR反應(yīng)體系(25 μL)

基因組模板2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，dNTP(10 mmol/L)2 μL，MgCl2(25 mmol/L)1.5 μL，10×ExTaqbuffer(Mg2+free) 2.5 μL，ExTaq0.3 μL，ddH2O 15.7 μL。

1.2.2 大腸桿菌感受態(tài)E.coilDH 5α的制備

將活化后的大腸桿菌E.coilDH 5α培養(yǎng)液按0.1%的接種量接入到新鮮的LB培養(yǎng)基中，37 ℃劇烈振蕩培養(yǎng)1～3 h；將培養(yǎng)的OD600值小于0.5的菌液分裝到1.5 mL的離心管中，放置于冰上約10 min，然后在4 ℃、12 000 r/min條件下離心2 min回收細(xì)菌；除盡離心管中的上清，然后每管中加入1 mL預(yù)冷的CaCl2(0.1 mol/L)洗滌細(xì)菌，混懸，并在冰上放置30 min，再次離心后回收細(xì)菌；往回收的細(xì)菌中加入0.2 mL的0.1 mol/L的CaCl2懸浮細(xì)胞振蕩，冰浴20 min后就將制備的感受態(tài)細(xì)胞懸液保存于-70 ℃的冰箱中備用。

1.2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞

向盛有50 μL感受態(tài)細(xì)胞懸液的離心管中加入5 μL的目的DNA，輕輕混勻后在冰中靜置30 min；將上述離心管放置到42 ℃的水浴中60～90 s，然后快速將離心管轉(zhuǎn)移到冰浴中2～3 min；向離心管中加入900 μL的無(wú)菌LB液體培養(yǎng)基(不含抗生素)，混勻后在37 ℃的搖床中以150 r/min振蕩培養(yǎng)45 min；培養(yǎng)結(jié)束后吸取100 μL的培養(yǎng)物涂布于含有抗生素的LB固體培養(yǎng)上，37 ℃，倒置培養(yǎng)12～16 h。

1.2.4 TA克隆

在冰盒上，將膠回收得到的PCR產(chǎn)物4 μL、溶液Ⅰ5 μL與pMD18-T 1 μL混合均勻，然后在Thermomixer comfort混勻器上16 ℃連接過(guò)夜，然后將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞E.coilDH 5α涂布于A(yíng)mp抗性平板上，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～16 h，挑出單菌落在含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒DNA并測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果輸入NCBI中用Blast工具進(jìn)行同源性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 利用細(xì)菌通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增

利用通用引物對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌和本實(shí)驗(yàn)室篩出的雙歧桿菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)對(duì)PCR反應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化，選擇退火溫度為55 ℃，延伸溫度和時(shí)間分別為72 ℃、1 min，通用引物的序列為：27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3′ ；1429R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，通用引物由南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司合成，擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1。

1-長(zhǎng)雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株；2-青春雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株；3-兩歧雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株；4-短雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株；5～7-分別為菌株B4、B13、B17；M-DL2000Marker圖1 利用細(xì)菌通用引物進(jìn)行PCR的結(jié)果Fig.1 The result of the Bacterial universal primers for PCR

結(jié)果表明，細(xì)菌通用引物應(yīng)不適合雙歧桿菌的特異性擴(kuò)增，即使提高退火溫度，延長(zhǎng)延伸時(shí)間，將ExTaq換為保真性更高的Prime STAR HS DNA Polymerase, PCR結(jié)果仍然不理想，這可能和雙歧桿菌的基因序列有關(guān)：雙歧桿菌16S rRNA基因序列的高度相似之處[12]，利用細(xì)菌通用引物容易發(fā)生錯(cuò)配。因此在利用PCR方法鑒定雙歧桿菌時(shí)應(yīng)根據(jù)其16S 區(qū)域或16S～23S的保守序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。

2.2 雙歧桿菌特異性引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI中已知的雙歧桿菌的16S rDNA特異性序列，參考文獻(xiàn)并利用軟件Primer Premier 5.0[13-14]，根據(jù)擴(kuò)增預(yù)期結(jié)果在550 bp和1 400 bp處分別設(shè)計(jì)了相應(yīng)的引物：上游引物L(fēng)m3r：5′-CGGGTGCTACCCACTTTCATG-3′，下游引物Im26：5′-GATCCTGGCTCAGGATGAACG-3′；上游引物g-Bifid-R：5′-GGTGTTCTTCCCGATATCTACA-3′，下游引物g-Bifid-F：5′-CTCCTGGAAACGGGTGG-3′；引物由南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司合成。

2.3 利用雙歧桿菌特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增

2.3.1 PCR退火溫度的確定

利用長(zhǎng)雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(CICC6068)進(jìn)行梯度PCR以選擇最適退火溫度，將退火溫度分別設(shè)為49、51、53、55、57、59 ℃，其余的條件不變進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖2。

1～6-菌株B4的退火溫度分別為49、51、53、55、57、59 ℃；M-DL2000Marker圖2 長(zhǎng)雙歧桿菌梯度PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 The result of the gradient PCR Methods of B.longum

結(jié)果顯示，長(zhǎng)雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，退火溫度在57 ℃和59 ℃能夠擴(kuò)增出片段，而且片段長(zhǎng)度在1 400 bp左右，大小與預(yù)期結(jié)果一致，因此選擇57 ℃為后續(xù)PCR試驗(yàn)的退火溫度。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株的PCR擴(kuò)增

分別通過(guò)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度在550 bp和1 400 bp的雙歧桿菌特異性引物對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、乳酸菌、放線(xiàn)菌、雙歧桿菌B4、長(zhǎng)雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、短雙歧桿菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖3。

1-大腸桿菌；2-枯草芽孢桿菌；3-乳酸菌；4-放線(xiàn)菌；5-乳雙歧桿菌；6-長(zhǎng)雙歧桿菌；7-青春雙歧桿菌；8-兩歧雙歧桿菌；9-短雙歧桿菌； M-DL2000Marker圖3 利用雙歧桿菌特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果Fig.3 The result of the Bifidobacterium specific primers for PCR

如圖3所示，已知的4種雙岐桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株以及乳雙歧桿菌，分別在550 bp和1 400 bp處PCR擴(kuò)增出明亮條帶，而大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、乳酸菌、放線(xiàn)菌擴(kuò)增出來(lái)的條帶不明顯或沒(méi)有條帶，表明兩對(duì)引物對(duì)雙歧桿菌屬的菌株具有特異性。同時(shí)，各標(biāo)準(zhǔn)菌株在1 400 bp處擴(kuò)增出的條帶更加清晰，因此選用1 400 bp處的引物對(duì)待測(cè)菌株進(jìn)行后續(xù)的PCR擴(kuò)增。

2.3.3 待測(cè)菌株的PCR擴(kuò)增

利用本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的雙歧桿菌特異性引物分別對(duì)菌株B4、B13、B17、B21、B23、B24以及乳桿菌、大腸桿菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從擴(kuò)增結(jié)果(圖4)來(lái)分析：菌株B13、B17、B20、B23、B24和長(zhǎng)雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株在同一位置1 400 bp處均出現(xiàn)清晰條帶，實(shí)驗(yàn)選取的對(duì)照組乳桿菌和大腸桿菌均無(wú)目的條帶的產(chǎn)生，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物對(duì)雙歧桿菌具有一定的特異性。菌株B4沒(méi)有擴(kuò)增出預(yù)期條帶，可能是菌株本身或PCR條件的原因。

1～6-分別為菌株B4、B13、B17、B21、B23、B24；7-長(zhǎng)雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株；M-DL2000Marker；8-乳桿菌；9-大腸桿菌圖4 在57 ℃條件對(duì)菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果Fig.4 The result of the strains for PCR in 57℃

2.3.4 利用降落PCR(touch-down PCR，TD-PCR)對(duì)菌株B4進(jìn)行擴(kuò)增

在常規(guī)的PCR中，若所選擇的退火溫度較低，就會(huì)造成引物與模板之間的錯(cuò)配，使引物與位點(diǎn)的結(jié)合不正確，難以獲得理想的擴(kuò)增效果，利用TD-PCR可以減少這種錯(cuò)配，因此，在無(wú)法得到目標(biāo)產(chǎn)物時(shí)可以選擇TD-PCR進(jìn)行擴(kuò)增[15-17]。由于菌株B4在梯度PCR時(shí)無(wú)法擴(kuò)增出目的基因片段，本文嘗試用降落PCR對(duì)菌株B4進(jìn)行擴(kuò)增。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)引物的Tm值在50 ℃左右，在進(jìn)行TD-PCR時(shí)退火溫度可以從55 ℃開(kāi)始設(shè)置，降落到43 ℃，每2個(gè)循環(huán)降1 ℃，最后在43 ℃上做10個(gè)循環(huán)。

1-長(zhǎng)雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株； 2-菌株B4； 3-乳桿菌；4-大腸桿菌； M-DL2000Marker圖5 利用TD-PCR的方法對(duì)菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增Fig.5 The result of the strains for the TD-PCR

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖5)來(lái)看，利用TD-PCR長(zhǎng)雙歧桿菌和菌株B4在1 400 bp處均能擴(kuò)增出明亮的條帶，與預(yù)期一致，而大腸桿菌和乳桿菌均未能擴(kuò)增出相應(yīng)的條帶。

2.3.5 質(zhì)重組子的獲得及質(zhì)粒的提取與測(cè)序分析

將膠回收產(chǎn)物與pMD18-T在16 ℃連接過(guò)夜，第2天連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coilDH 5α，涂布于有Amp的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)12～16 h，挑取單菌落于盛有1 mL LB液體培養(yǎng)基的無(wú)菌離心管中進(jìn)行增殖培養(yǎng)12 h，隨機(jī)挑取重組子提取質(zhì)粒，送至南京金斯瑞公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果輸入NCBI用blast工具進(jìn)行分析，結(jié)果表明：菌株B4、B13、B17、B23與動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種的同源性高達(dá)99%，菌株B21與長(zhǎng)雙歧桿菌的同源性達(dá)到98%，B24與兩歧雙歧桿菌的同源性也達(dá)98%。菌株B4與動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種的同源性高達(dá)99%。其中，菌株B21和B24已經(jīng)申請(qǐng)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)進(jìn)行專(zhuān)利保藏，保藏編號(hào)為M2014467和M2014468。因此，該方法可以用作雙歧桿菌屬間的分子生物學(xué)鑒定。

3 討論

由于傳統(tǒng)的生理生化鑒定容易受培養(yǎng)條件、培養(yǎng)環(huán)境等影響，對(duì)于微生物的鑒定存在一些誤差，因此可以結(jié)合分子生物學(xué)的手段，對(duì)微生物進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

(1)雙歧桿菌屬16S rRNA區(qū)域具有高度相似性，在利用通用引物對(duì)雙歧桿菌16S rRNA區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，由于通用引物對(duì)雙歧桿菌16S rRNA區(qū)域沒(méi)有特異性，因此，在擴(kuò)增的過(guò)程中容易發(fā)生錯(cuò)配的現(xiàn)象，導(dǎo)致PCR結(jié)果不理想，目的條帶不明確，無(wú)法得到目的DNA。

(2)利用新合成的雙歧桿菌特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，梯度PCR和降落PCR相結(jié)合的方法能夠快速擴(kuò)增出目的片段，而作為比對(duì)的大腸桿菌和乳桿菌不能擴(kuò)增出任何條帶，這說(shuō)明了我們所設(shè)計(jì)的引物對(duì)雙歧桿菌具有特異性。將擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD18-T載體相連接，進(jìn)行克隆提取質(zhì)粒測(cè)序，結(jié)果證明了所篩選出的菌株均為雙歧桿菌，同源性均在98%以上。

(3)利用雙岐桿菌特異性引物對(duì)已知菌株和待測(cè)菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)在550 bp和1 400 bp的條帶比對(duì)可以快速、準(zhǔn)確的鑒定雙歧桿菌，為雙岐桿菌分子生物學(xué)鑒定提供了依據(jù)。

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The molecular identification of bifidobacterium

XIONG Qiang*, WANG Yan-bin, HAN Hao

(College of Food Science and Light Industry, Nanjing Tech University, Nanjing 211800，China)

In this paper, the specific primers for bfidobacterium designed by our laboratory was combined the touch-down PCR to amplify 16S rDNA of test strains. The amplification effects of the universal primers for bacteria and the specific primers for bifidobacterium on different strains of the genus bifidobacterium and reference strains were compared. The experimental results showed that the amplification of sample from different bifidobacteria using universal primers for bacteria resulted in unclear bands, while amplification with specific primers for bifidobacterium gave rise to very bright bands. Therefore, this method can accurately identify the bifidobacterium and our work provides a theoretical basis for the identification of bifidobacterium.

bifidobacterium; Polymerase Chain Reaction(PCR); molecular biology; identification

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201612008

副教授(本文通訊作者,E-mail:xiongqiang@njtech.edu.cn)。

2016-07-18，改回日期：2016-08-28