白雪蕊， 聶麥茜， 謝錚勝， 宋勃軒， 聶紅云

西安建筑科技大學(xué)環(huán)境與市政工程學(xué)院， 陜西 西安 710055

共存碳源對克雷伯氏菌NIII2發(fā)酵蔗糖產(chǎn)絮凝劑的影響

白雪蕊， 聶麥茜*， 謝錚勝， 宋勃軒， 聶紅云

西安建筑科技大學(xué)環(huán)境與市政工程學(xué)院， 陜西 西安 710055

研究了共存碳源對克雷伯氏菌NIII2以蔗糖為主要碳源發(fā)酵產(chǎn)絮凝劑的影響。實驗結(jié)果表明：檸檬酸為共存碳源時，克雷伯氏菌NIII2分泌絮凝劑過程中容易產(chǎn)酸，使得絮凝劑的產(chǎn)量和碳源轉(zhuǎn)化率都較低。當(dāng)丁二酸、乙酸、乳酸為共存碳源時，發(fā)酵液pH均高于7.5，絮凝劑產(chǎn)量有所提高，最高可達10.87g/L，碳源轉(zhuǎn)化率也較高，為43.48%。與檸檬酸為共存碳源相比，當(dāng)投加丁二酸時，克雷伯氏菌NIII2所產(chǎn)微生物絮凝劑中蛋白質(zhì)與糖含量比值提高了33%，絮凝劑的Zeta電位值由-60.00 mV升高至-28.07 mV，絮凝劑分子粒徑廣泛分布在0～300 μm之間且大粒徑分子所占比例增加，聚合度加大，絮凝劑表面形貌呈現(xiàn)結(jié)塊團狀無定型結(jié)構(gòu)，從而提高絮凝劑的活性和性能。該微生物絮凝劑投加量為4.0 mg/L，對2 g/L高嶺土的SS去除率可達97.3%。

共存碳源； 克雷伯氏菌NIII2； 微生物絮凝劑； 碳源轉(zhuǎn)化率

微生物絮凝劑是微生物分泌的次生大分子代謝產(chǎn)物[1,2]，主要有蛋白質(zhì)類、多糖類、DNA、糖蛋白類[3-6]，具有絮凝活性高、生物降解性好、無毒、無二次污染等優(yōu)勢，因此在采油廢水、食品工業(yè)、發(fā)酵工程等領(lǐng)域有著很大的應(yīng)用前景。但因其活性官能團數(shù)量和種類眾多、分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜多變，且在發(fā)酵產(chǎn)品的生產(chǎn)中，微生物絮凝劑的生產(chǎn)和應(yīng)用成本高，目前仍未見大規(guī)模的工業(yè)化產(chǎn)品。

發(fā)酵和基因工程生產(chǎn)生物制品時，共因子操作(manipulation of co-factor)[7]是一種常用的獲得目標(biāo)產(chǎn)物并提高其產(chǎn)量的重要方法，其在微生物發(fā)酵產(chǎn)絮凝劑的研究中，尚未全面和系統(tǒng)地被研究。本論文選取糖代謝過程中的中間產(chǎn)物作為共存碳源，利用共因子操作方法研究共存碳源的可利用性及其比例對克雷伯氏菌NIII2發(fā)酵產(chǎn)絮凝劑特性的影響，以期利用該菌株高產(chǎn)高活性絮凝劑，同時獲得穩(wěn)定的發(fā)酵工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源

克雷伯氏菌NIII2由實驗課題組從城市生活污水處理廠的活性污泥中分離篩選，利用16S rDNA序列分析鑒定并保存[8]。

1.1.2 培養(yǎng)基的配制

種子液培養(yǎng)基：3 g牛肉膏，10 g蛋白胨，5 g NaCl，1 L蒸餾水，調(diào)節(jié)pH至7.5，用高壓水蒸氣鍋121 ℃滅菌45 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：20 g蔗糖，2.5 g NaNO3，0.2 mL 1 mol/L CaCl2，2 mL 1 mol/L MgSO4，2 mL 1 mol/L微量元素溶液，30 mL 1mol/L磷酸鹽緩沖溶液，1 L蒸餾水。分別加入丁二酸、檸檬酸、乙酸、乳酸，調(diào)節(jié)pH 至7.5，用高壓水蒸氣鍋121 ℃滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 種子液制備

無菌條件下，從NIII2菌保存平板上挑取單克隆于100 mL已滅菌的種子液培養(yǎng)基中，150 r/min，30 ℃條件下恒溫振蕩培養(yǎng)24 h，備用。

1.2.2 絮凝劑發(fā)酵與提取

無菌條件下，將2%(V/V)NIII2菌種子液接種于100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，150 r/min，30 ℃條件下恒溫振蕩72 h后，在4 ℃，10 000 r/min的條件下高速冷凍離心10 min并且除去沉淀。按1∶3(V/V)將所得發(fā)酵液與無水乙醇迅速混合均勻，收集上浮絮體即為微生物絮凝劑。將其冷凍干燥后研成粉末，分裝保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 分析方法

1.3.1 絮凝劑產(chǎn)量和碳源轉(zhuǎn)化率的測定

將所得絮凝劑凍干后進行稱量，以g/L發(fā)酵培養(yǎng)基計算絮凝劑產(chǎn)量；碳源轉(zhuǎn)化率[9]的計算：

CCR=a/(b+c)×100%

式中：CCR為碳源轉(zhuǎn)化率；a為絮凝劑產(chǎn)量(g/L)；b為蔗糖投加量(g/L)；c為共存碳源投加量(g/L)。

1.3.2 絮凝劑結(jié)構(gòu)組分的測定

糖含量的測定：采用苯酚-硫酸法測定所產(chǎn)絮凝劑的糖含量。

蛋白含量的測定：采用Folin-酚法測定所產(chǎn)絮凝劑的蛋白質(zhì)含量。

粒徑分布的測定：取1mL 5 g/L絮凝劑水溶液，使用激光粒度分布測定儀(LS230/SVM+型，美國貝克曼庫爾特)測定所產(chǎn)絮凝劑的粒徑分布。

荷電特性的測定：取1mL 80 mg/L絮凝劑水溶液，使用Zeta電位測定儀(Zeta Size Nano-ZS，馬爾文儀器有限公司)多次測量測定其Zeta電位并取平均值。

紅外光譜的測定：將絮凝劑粉末與KBr以1∶100(mg∶mg)混勻研成粉末并進行壓片，使用傅里葉紅外光譜分析儀(IR Prestige-21，日本島津出品)測定所產(chǎn)絮凝劑純品的紅外光譜。

外貌形態(tài)的分析：取約10 mg提純后的微生物絮凝劑固體粉末，置于樣品柱上噴金(Bal-Tec SCD005 Sputter Coater)，然后在JSM 6510LV 掃描電鏡上進行表面掃描。

絮凝活性的測定：對高嶺土SS的絮凝率：取40 mL 2 g/L高嶺土乳濁液于50 mL比色管中，加入0.2 mL 0.1 mol/L的CaCl2溶液，0.2 mL 2 g/L絮凝劑水溶液，定容至50 mL。以0.2 mL蒸餾水作對照實驗，快速混合均勻，靜置5 min，測1 cm處上清液的OD550。絮凝活性用絮凝率表示：

FR=(A0-A末)/A0×100%

式中：FR為絮凝率；A0、A末分別為對照和樣品的OD550。

2 結(jié)果與討論

2.1 共存碳源對NIII2菌發(fā)酵產(chǎn)絮凝劑特性的影響

2.1.1 共存碳源對NIII2菌發(fā)酵產(chǎn)絮凝劑產(chǎn)量的影響

以蔗糖為主要碳源，外加如圖1所示的共存碳源，72 h后測定發(fā)酵液最終pH和產(chǎn)量，結(jié)果如圖1所示。從圖1可看出，P值(0.041)<0.05，共存碳源存在下，NIII2菌產(chǎn)絮凝劑有顯著性差異。當(dāng)檸檬酸共存時，發(fā)酵過程易產(chǎn)酸性物質(zhì)，且收獲絮凝劑時，發(fā)酵液pH由初始7.5降至6.08，同時使NIII2菌所得絮凝劑產(chǎn)量較低，僅約為6.5 g/L。而以丁二酸、乙酸、乳酸共存時，發(fā)酵液pH均高于7.5，尤其是丁二酸共存時，發(fā)酵液pH由初始7.5升至8.25，發(fā)酵過程明顯產(chǎn)堿性化合物，絮凝劑產(chǎn)量也可高達并穩(wěn)定在9.5～10.9 g/L范圍內(nèi)。該產(chǎn)量是目前報道的NIII2菌分泌微生物絮凝劑的最高穩(wěn)定產(chǎn)量。與前期利用NIII2菌發(fā)酵單一碳源相比，絮凝劑的產(chǎn)量提高約4 g/L。從圖1還可看出，NIII2菌利用碳源發(fā)酵產(chǎn)絮凝劑過程中酸性基團(羧基、酚羥基等)的產(chǎn)生不僅會使發(fā)酵液pH降低，而且會抑制NIII2菌分泌絮凝劑，而堿性基團的形成則有利于NIII2菌分泌次生代謝產(chǎn)物絮凝劑。

圖1 共存碳源對NIII2菌分泌絮凝劑產(chǎn)量的影響

2.1.2 共存碳源對NIII2菌產(chǎn)絮凝劑時碳源轉(zhuǎn)化率的影響

通過碳源物料比(共存碳源與蔗糖投加量的比值)分別計算所產(chǎn)絮凝劑的碳源轉(zhuǎn)化率，結(jié)果如表1所示，P值(0.001)<0.05，共存碳源存在下，NIII2菌產(chǎn)絮凝劑的碳源轉(zhuǎn)化率有顯著性差異。由表1結(jié)果看，當(dāng)檸檬酸共存時，NIII2菌將總碳源合成轉(zhuǎn)化為絮凝劑的效率均低于30.20%(與單一碳源發(fā)酵相近)；當(dāng)乙酸和乳酸為共存碳源時，碳源轉(zhuǎn)化率有所提高；而當(dāng)丁二酸共存時，可使碳源轉(zhuǎn)化率明顯提高，可達43.48%。因此，NIII2菌能快速利用糖代謝過程的中間產(chǎn)物丁二酸分泌合成絮凝劑，從而使碳源轉(zhuǎn)化為絮凝劑的效率大幅提高，生產(chǎn)和應(yīng)用成本的降低，更加有利于微生物絮凝劑的工業(yè)化生產(chǎn)。

表1 共存碳源對NIII2菌合成絮凝劑時碳源轉(zhuǎn)化率的影響

2.2 共存碳源對NIII2菌所產(chǎn)絮凝劑結(jié)構(gòu)及其組分的影響

2.2.1 共存碳源對NIII2菌所產(chǎn)絮凝劑組分的影響

按文獻[9]的方法對所產(chǎn)絮凝劑進行成分分析，測定絮凝劑中蛋白質(zhì)與糖的含量，并計算蛋白質(zhì)與糖含量的比值，結(jié)果如圖2所示，P值(0.824)>0.05，共存碳源存在下，NIII2菌產(chǎn)絮凝劑蛋白與糖含量無顯著性差異，NIII2菌所產(chǎn)絮凝劑中蛋白質(zhì)和糖的比值與所使用共存碳源種類密切相關(guān)，而共存碳源的投加量則影響較小。由圖2結(jié)果看，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中投加檸檬酸鈉時，NIII2菌所產(chǎn)絮凝劑蛋白含量較低，其蛋白質(zhì)與糖含量比值約為0.55。當(dāng)乙酸和乳酸共存時，所產(chǎn)絮凝劑的蛋白質(zhì)含量則提高，蛋白質(zhì)與糖含量的比值分別約為0.71和0.68。而丁二酸為共存碳源時，絮凝劑中蛋白含量提高明顯，使蛋白質(zhì)與糖含量的比值最高可達0.88。因此，NIII2菌能快速利用丁二酸啟動蛋白質(zhì)合成胞外分泌物，蛋白質(zhì)與糖含量的提高，增加了微生物絮凝劑中大分子官能團的數(shù)量，絮凝劑的產(chǎn)量隨之提高，絮凝活性也得到提高。

圖2 共存碳源對NIII2菌所產(chǎn)絮凝劑蛋白質(zhì)與糖含量比值的影響

2.2.2 共存碳源對NIII2菌產(chǎn)絮凝劑紅外光譜的影響

測定共存碳源存在下所產(chǎn)絮凝劑的紅外光譜，結(jié)果如圖3所示。由圖3結(jié)果看，～3 240 cm-1處中等強度、且較寬的吸收帶為-OH和-NH伸縮振動峰，絮凝劑中有分子間和分子內(nèi)氫鍵存在，其中羥基主要來自于糖環(huán)，氨基主要來自于蛋白質(zhì)；與檸檬酸、乙酸、乳酸共存時相比，丁二酸為共存碳源時此峰最為明顯，即蛋白質(zhì)含量最高。 ～2 920 cm-1處吸收帶為C-H不對稱的伸縮振動吸收峰，并且吸收峰較小，說明發(fā)酵所產(chǎn)絮凝劑分子中C-H鍵的數(shù)量較少。～1638 cm-1處寬峰是由仲酰胺基(-NHC=O-)的C=O 鍵伸縮振動造成的，可以看出絮凝劑分子中蛋白肽鏈主要為無規(guī)則卷曲和螺旋狀；～1 373 cm-1、～1 232 cm-1所看到的不太尖的吸收峰是C—H 的變角振動；～1 076 cm-1、～1 031 cm-1處較強的吸收峰，說明共存碳源存在下所產(chǎn)絮凝劑為以O(shè)-鏈接的糖蛋白結(jié)構(gòu)；當(dāng)乙酸、丁二酸為共存碳源時此峰較大，說明絮凝劑分子中糖的含量有所提高。紅外光譜圖測定結(jié)果與圖2中所測蛋白質(zhì)與糖的含量結(jié)果吻合。

圖3 共存碳源對NIII2菌產(chǎn)絮凝劑紅外吸收特性的影響

2.2.3 共存碳源對NIII2菌產(chǎn)絮凝劑粒徑分布的影響

共存碳源存在下所得絮凝劑的粒徑分布如圖4所示，可得出，共存碳源對NIII2菌分泌所產(chǎn)絮凝劑粒徑有顯著影響。檸檬酸共存時，90%的絮凝劑分子粒徑在25 μm以下，大粒徑分子較少。丁二酸、乙酸、乳酸為共存碳源時，絮凝劑分子粒徑明顯變大且分布廣泛，大粒徑所占比例增加而小粒徑所占比例大大減少，表明聚合度較大的絮凝劑比例提高。尤其是丁二酸共存時，65%的絮凝劑分子粒徑分布在150 μm ～300 μm，僅有28%分布在0 μm ～115 μm，而25 μm以下所占比例僅約10%。因此，投加共存碳源可使NIII2菌所產(chǎn)絮凝劑粒徑分布廣泛，絮凝劑聚合度明顯變大，且大粒徑分子比例的增大使其有足夠的空間位點和較強的網(wǎng)捕作用，更加徹底有效地除去膠粒。

圖4 共存碳源對NIII2菌產(chǎn)絮凝劑粒徑分布的影響

2.2.4 共存碳源對NIII2菌所產(chǎn)絮凝劑活性及荷電特性的影響

分別測定共存碳源存在下所產(chǎn)絮凝劑的絮凝活性和Zeta電位[10]，結(jié)果如圖5所示，P值(0.006)<0.05，共存碳源存在下，NIII2菌產(chǎn)絮凝劑絮凝活性存在顯著性差異。由圖5結(jié)果看，當(dāng)投加檸檬酸時，所產(chǎn)絮凝劑Zeta電位較低，低于-60.0 mV，可能由于所產(chǎn)絮凝劑中含有羧基或其他酸性官能團，當(dāng)乙酸和乳酸為共存碳源時，所產(chǎn)絮凝劑Zeta電位值有小幅提高，而丁二酸為共存碳源時，所產(chǎn)絮凝劑Zeta電位明顯提高，約為-28.07 mV。同時，該絮凝劑活性也是最高。與檸檬酸、乙酸、乳酸等共存碳源相比，前者所產(chǎn)絮凝劑處理高嶺土所產(chǎn)生的SS時，絮體形成和沉淀速度快，處理后水樣很快澄清透明?？梢?，共存碳源不僅影響絮凝劑中蛋白質(zhì)含量，同時對所產(chǎn)絮凝劑荷電特性影響較大，進而影響絮凝活性。圖5中絮凝活性與圖2中所測蛋白質(zhì)與糖含量的比值結(jié)果一致，所以絮凝劑活性隨蛋白質(zhì)與糖含量的比值的增高而變大。

圖5 共存碳源對NIII2菌所產(chǎn)絮凝劑活性及荷電特性的影響

2.3 共存碳源對NIII2菌所產(chǎn)絮凝劑表面形貌的影響

利用掃描電鏡拍攝共存碳源存在下絮凝劑的表面結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖6所示。由圖6結(jié)果看，不同種類的共存碳源存在下，NIII2菌所產(chǎn)絮凝劑表面形貌不同。當(dāng)檸檬酸鈉共存時(如圖6b)，NIII2菌所產(chǎn)絮凝劑的表面存在大量的細小結(jié)晶狀，這與絮凝劑蛋白含量少，小分子粒徑所占比例越大有關(guān)。乳酸共存時(如圖6d)，NIII2菌所產(chǎn)絮凝劑表面形態(tài)與檸檬酸為共存碳源時相似，只是線狀結(jié)晶含量減少，出現(xiàn)少量顆粒狀結(jié)晶。乙酸共存時(如圖6c)，NIII2菌所產(chǎn)絮凝劑表面線狀結(jié)晶消失，均為顆粒狀結(jié)晶。而丁二酸共存時(如圖6a)，NIII2菌所產(chǎn)絮凝劑由于蛋白含量較高，大分子粒徑所占比例越大，因此微生物絮凝劑的表面呈現(xiàn)無定型的塊團狀分布。

a.丁二酸 b.檸檬酸 c.乙酸 d.乳酸
圖6 共存碳源對NIII2菌產(chǎn)絮凝劑掃描電鏡圖

3 結(jié)論

3.1 當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中投加檸檬酸時，發(fā)酵液pH降低，同時使所得絮凝劑產(chǎn)量和碳源轉(zhuǎn)化率較低。而NIII2菌以丁二酸、乙酸、乳酸為共存碳源時，72 h后發(fā)酵液pH均提高，絮凝劑產(chǎn)量也可高達并穩(wěn)定在9.5～10.9 g/L范圍內(nèi)。尤其是丁二酸為碳源時，最終pH由7.50升至8.25，絮凝劑產(chǎn)量可達最高10.87 g/L，碳源轉(zhuǎn)化率高達43.48%。

3.2 與檸檬酸共存相比，丁二酸、乙酸、乳酸為共存碳源時，能使絮凝劑中蛋白質(zhì)與糖含量比值分別提高33 %、16 %、13 %，并提高絮凝劑的荷電特性，使絮凝劑分子粒徑廣泛分布于0～300 μm范圍內(nèi)，且小粒徑分子所占比例減小，大粒徑分子所占比例提高，聚合度增大，絮凝劑表面呈現(xiàn)不規(guī)則分布，塊團狀無定型結(jié)構(gòu)，從而穩(wěn)定絮凝劑活性和性能。當(dāng)該絮凝劑投加量為4.0 mg/L時，可使2 g/L高嶺土的SS去除率達到97.3%。

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Effects of co-carbon source compounds on production of bioflocculant by Klebsiella sp. NIII 2 with sucrose

BAI Xue-rui, NIE Mai-qian, XIE Zheng-sheng, SONG Bo-xuan, NIE Hong-yun

School of Environmental and Municipal Engineering, Xi’an University of Architecture and Technology, Xi’an 710055, China

Effects of co-carbon source compounds on the production of bioflocculant byKlebsiellasp.NIII2 with sucrose were investigated. The results showed that with citrate as co-carbon source compounds in fermentation medium,NIII2 was easy to produce acid, which often resulted in decrease of the bioflocculant yield and carbon conversion rate. With succinic acid, acetate or lactate as co-carbon source, the values of pH were higher than 7.5, the yield could reach the highest of 10.87 g/L and the carbon conversion rate was as high as 43.48%. Compared with citrate as co-carbon source, succinate as co-carbon source could make the ratio of protein and saccharide increase by 33%; Zeta potential flocculation activity was improved from -60.00 mV to -28.07 mV; the particle size of bioflocculant widely distributed in the range of 0～300 μm and the proportion of large particle size was augmented. With the increasing high degree polymerization of the bioflocculant and with flocculation surface rendering agglomerate amorphous structure, it improved the flocculation activity and performance. With a 4.0 mg/L dose of such bioflocculant, the removal rate of the suspended solid in kaolin solution (2 g/L) was up to 97.3%.

co-carbon source;Klebsiellasp.NIII2; microbial flocculant; carbon conversion rate

10.3969/j.issn.1001-6678.2016.06.007

陜西省重點科技創(chuàng)新團隊建設(shè)計劃(編號：2013KCT-13)；國家自然科學(xué)基金(編號：51278405)。

白雪蕊(1989～)，女，碩士研究生，研究方向為微生物絮凝劑的研究與應(yīng)用工作。E-mail：Beryl0280@163.com。

*通信作者: 聶麥茜，女，博導(dǎo)，教授。E-mail：niemaiqian@xauat.edu.cn。