錢建瑛， 丁振中， 朱玉霞， 李 恒， 史勁松*

1江南大學(xué)藥學(xué)院，江蘇無(wú)錫 214122； 2揚(yáng)州日興生物科技股份有限公司，江蘇揚(yáng)州 225601

殼寡糖對(duì)大腸桿菌抑菌活性研究

錢建瑛1， 丁振中2， 朱玉霞1， 李 恒1， 史勁松1*

1江南大學(xué)藥學(xué)院，江蘇無(wú)錫 214122； 2揚(yáng)州日興生物科技股份有限公司，江蘇揚(yáng)州 225601

分析殼寡糖對(duì)大腸桿菌抑菌效果的影響因素。采用搖瓶法和ELISA板法對(duì)不同濃度的殼寡糖進(jìn)行抑菌試驗(yàn)；比較不同pH、不同脫乙酰度的殼寡糖對(duì)大腸桿菌抑菌效果的差異；比較不同聚合度的單一聚合度殼寡糖抑菌效果的差異。 殼寡糖濃度大于5 mg/mL時(shí)抑菌效果與同濃度苯甲酸鈉相近； pH為4時(shí)，0.156 mg/mL的殼寡糖溶液抑菌活性即能超過(guò)90%；pH為7時(shí)，5 mg/mL的殼寡糖才能達(dá)到90%抑菌活性。脫乙酰度為95%時(shí)，5 mg/mL的殼寡糖溶液抑菌活性能超過(guò)97%；脫乙酰度為45%時(shí)，40 mg/mL的殼寡糖溶液抑菌活性僅有56%；聚合度大于4的單一聚合度殼寡糖40 mg/mL時(shí)抑菌活性能達(dá)到99%。結(jié)果表明：提高殼寡糖溶液濃度、降低pH、提高脫乙酰度，能提高殼寡糖的抑菌活性，單一聚合度殼寡糖聚合度越高，對(duì)大腸桿菌的抑制作用越強(qiáng)。此外，采用ELISA板的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，即節(jié)省試藥又方便快捷。

殼寡糖； 單體； 抑菌活性

殼寡糖(Chitosan oligosaccharide，COS)也稱幾丁寡糖，學(xué)名β-1,4-寡糖-葡萄糖胺，是殼聚糖經(jīng)物理、化學(xué)或酶降解而成的水溶性好、生物活性高、聚合度為2～10的低分子量殼聚糖[1]。殼寡糖是自然界中唯一含有正電荷的堿性氨基寡糖，綠色天然、無(wú)副作用，作為一類新的生理活性物質(zhì)，除了具有增強(qiáng)免疫、抗腫瘤抗癌、降低膽固醇、降血壓、降血糖、加速體內(nèi)鈣和鐵的吸收以及關(guān)節(jié)組織的修復(fù)等功能外[2]，還具有防腐抑菌等作用，且抑菌作用較殼聚糖更強(qiáng)[3]，這也是殼寡糖區(qū)別于其他寡糖的重要特征。

近年來(lái)殼寡糖的抑菌特性受到國(guó)內(nèi)外研究者的關(guān)注，以殼寡糖作為食品防腐劑和保鮮劑，對(duì)延長(zhǎng)食品保質(zhì)期、減少化學(xué)防腐劑的使用具有積極意義，因其天然、安全和優(yōu)良的生物相容性，其潛在的應(yīng)用領(lǐng)域包括食品、乳制品、飲料以及冷鏈環(huán)境下的水產(chǎn)、畜禽肉制品的保鮮[4-5]。殼寡糖的抑菌活性不僅與殼寡糖的分子量、溶液的pH值、殼寡糖的乙?；潭扔嘘P(guān)，還與殼寡糖的特定分子結(jié)構(gòu)、制備方法及菌種等有關(guān)[6]。夏文水等[7]比較了分子量分別為1 500、3 000、5 000、8 000的4種殼寡糖對(duì)大腸桿菌的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)分子量為1 500的殼寡糖抑菌效果最強(qiáng)，且隨著分子量上升抑菌效果逐漸下降。而Jeon等[8]比較了高、中、低三種分子量的殼寡糖對(duì)四種革蘭陰性菌(E.coli,E.coliO-157,Salmonellatyphi,Pseudomonasaeruginosa)、五種革蘭陽(yáng)性菌(Streptococcusmutans,Micrococcusluteus,S.aureus,Staphylococcusepidermidis,Bacillussubtilis)和四種乳酸菌(Lactobacillusbulgaricus,Lactobacilluscasei,Lactobacillusfermentum,Streptococcusfaecalis)的抑菌活性，得出高分子量的殼寡糖抑菌效果更好，指出相對(duì)分子量是殼寡糖抑制微生物生長(zhǎng)的最重要因素。陳建國(guó)[9]研究認(rèn)為，抑菌效果因殼聚糖酶的酶切方式、殼寡糖的質(zhì)量濃度和供試菌種而異，由殼聚糖內(nèi)切酶降解制備的數(shù)均分子質(zhì)量為3 726的殼寡糖對(duì)幾種植物病原菌的抑菌效果明顯優(yōu)于由混合酶降解制備的數(shù)均分子質(zhì)量為2 133的殼寡糖，由殼聚糖外切酶降解制備的殼寡糖分子量較小基本沒有抑菌活性。Seyfarth等[10]研究了脫乙酰度為84%和52%的殼寡糖溶液對(duì)蠟樣芽胞桿菌(B.cereus)，大腸桿菌(E.coli)，沙門氏菌(salmonella)和三個(gè)脂多糖突變的大腸桿菌和沙門氏菌的抑制作用，通過(guò)細(xì)胞膜的完整性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，脫乙酰度為84%的殼寡糖的比脫乙酰度為52%的殼寡糖抑菌效果好。不同聚合度的殼寡糖分子量分布不同，生產(chǎn)方法不同，抑菌效果差異極大，在評(píng)價(jià)寡糖抑菌性能方面，不能單純以分子量、脫乙酰度、pH等因素來(lái)衡量殼寡糖的活性，其抑菌的濃度也隨殼寡糖本身的性質(zhì)及菌種的種類而不同，不能做統(tǒng)一定論。為了方便動(dòng)態(tài)觀察殼寡糖的抑菌效果，本實(shí)驗(yàn)采用了在ELISA板中對(duì)大腸桿菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)的方法，將其與傳統(tǒng)的搖瓶法進(jìn)行了比較，并將不同pH、不同脫乙酰度的殼寡糖抑菌活性進(jìn)行了比較，將自制的單一聚合度殼寡糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)驗(yàn)證后分別進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，能夠全面表征殼寡糖對(duì)大腸桿菌的抑菌活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

殼寡糖：脫乙酰度> 95%，平均分子量700左右，淮海工學(xué)院制備并提供；氨基葡萄糖：sigma公司；聚丙烯酰胺凝膠(Bio-Gel P-2)：美國(guó) Bio-Rad 公司；FPT015型ELISA板：碧云天生物技術(shù)研究所；胰蛋白胨、酵母浸膏：分析純，上海生工生物工程有限公司；苯甲酸鈉、瓊脂：生化試劑，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈉、吡啶、乙酸、乙酸酐、氨水、無(wú)水乙醇等均為分析純：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈：色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；大腸桿菌菌種由江南大學(xué)藥學(xué)院提供。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters Acquity 超高效液相色譜儀，SYNAPT QTOF MS(配有電噴霧電離源，ESI)質(zhì)譜儀：美國(guó)Waters公司；Ascent 酶標(biāo)儀：賽默飛世爾科技公司；玻璃層析柱(1 500 mm×25 mm)：蘇州科盛實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；BSZ-30自動(dòng)部分收集器：上海滬西分析儀器有限公司；FD-ID冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52A：上海亞榮生化儀器廠；高壓滅菌鍋MLS-3020CH：上海涵今儀器儀表有限公司；超凈工作臺(tái)：上海華線醫(yī)用核子儀器廠；EL 204電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；SPX-100B-Z型生化培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 搖瓶法與ELISA板法測(cè)定殼寡糖抑菌活性的比較

(1)搖瓶法[11]

稱取一定量的殼寡糖溶解于LB液體培養(yǎng)基中，配成pH為5、質(zhì)量濃度為10 g/L、5 g/L、2.5 g/L、1.25 g/L和0.625 g/L的含殼寡糖的培養(yǎng)基，加入搖瓶中，然后加入0.1 mL活化好的大腸桿菌的菌懸液(菌濃度為1×108CFU/mL)，以5 mg/mL苯甲酸鈉溶液為陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)設(shè)置一個(gè)空白對(duì)照，試驗(yàn)組每個(gè)濃度、陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照均平行設(shè)置3瓶，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)，每隔2 h取樣測(cè)定其在630 nm下的吸光度值。以取樣時(shí)間為橫坐標(biāo)，每次測(cè)定的吸光度平均值與0點(diǎn)時(shí)的吸光值的差值為縱坐標(biāo)繪制殼寡糖對(duì)大腸桿菌的抑制曲線。

(2)ELISA板法

在ELISA板中每孔加入pH 5的LB液體培養(yǎng)基170 μL,10 μL大腸桿菌菌懸液(菌濃度為1×108cfu/mL)，并加入20 μL不同濃度的殼寡糖溶液使殼寡糖的終濃度為10 mg/mL、5 mg/mL、2.5 mg/mL、1.25 mg/mL和0.625 mg/mL，以5 mg/mL苯甲酸鈉溶液為陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)設(shè)置一個(gè)空白對(duì)照，試驗(yàn)組每個(gè)濃度、陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照均平行設(shè)置3個(gè)孔，37 ℃培養(yǎng)，每隔2 h測(cè)定其在630 nm下的吸光度值，結(jié)果取平均數(shù)。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的吸光度平均值與0點(diǎn)時(shí)的吸光度值之差為縱坐標(biāo)繪制殼寡糖對(duì)大腸桿菌的抑制曲線。

根據(jù)以下公式(1)計(jì)算抑菌活性[12]：

(1)

U：抑菌活性；

A0：空白對(duì)照測(cè)得的吸光度平均值；

A：試驗(yàn)組測(cè)得的吸光度平均值，當(dāng)A>A0時(shí)，不計(jì)算抑菌活性。

1.3.2 不同pH下殼寡糖對(duì)大腸桿菌的抑菌活性測(cè)定

在ELISA板中每孔加入10 μL大腸桿菌菌懸液(菌濃度為1×108CFU/mL)、190 μL pH分別為4、5、6和7的含有殼寡糖(脫乙酰度為95%)的LB液體培養(yǎng)基，使殼寡糖溶液的終濃度為40 mg/mL、20 mg/mL、10 mg/mL、5 mg/mL、2.5 mg/mL、1.25 mg/mL、0.625 mg/mL、0.316 5 mg/mL、0.156 4 mg/mL和0.078 2 mg/mL，以5 mg/mL苯甲酸鈉溶液為陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)設(shè)置一個(gè)空白對(duì)照，試驗(yàn)組每個(gè)濃度、陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照均平行設(shè)置3個(gè)孔，37 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定其在630 nm的吸光度值，結(jié)果取平均數(shù)。按公式(1)計(jì)算不同pH條件下，不同濃度殼寡糖溶液對(duì)大腸桿菌的抑菌活性。

1.3.3 不同脫乙酰度殼寡糖對(duì)大腸桿菌的抑菌效果觀察

稱取一定量的殼寡糖溶于水中配成質(zhì)量濃度為0.1 g/mL的水溶液，用甲醇鈉調(diào)節(jié)pH為9，加入一定量的乙酸酐，室溫下反應(yīng)3 h～5 h，透析除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)，旋轉(zhuǎn)濃縮，40 ℃真空干燥得不同脫乙酰度殼寡糖樣品，用雙突躍電位滴定法測(cè)定脫乙酰度[13]。制得乙?；潭葹?5%和55%的殼寡糖，即脫乙酰度分別為65%和45%的樣品，將其與殼寡糖原料即脫乙酰度95%的殼寡糖進(jìn)行抑菌效果的觀察。

抑菌試驗(yàn)方法同1.3.1的ELISA板法，試驗(yàn)組采用不同脫乙酰度的殼寡糖溶液。按公式(1)計(jì)算抑菌活性。

1.3.4 單一聚合度殼寡糖的制備及純度檢測(cè)方法

將0.5 g殼寡糖溶于10 mL水中，完全溶解后過(guò)濾，濾液上樣于活化好的Bio-Gel P-2凝膠層析柱中，柱子內(nèi)徑25 mm，柱高1 500 mm，實(shí)裝凝膠高度為1 200 mm。用雙蒸水洗脫，流速為1 mL/min，自動(dòng)收集器每30 min收集一次[14]。用薄層層析法[15]分析各管中糖的種類，根據(jù)層析結(jié)果，合并相同的組分，分別旋蒸濃縮，冷凍干燥得單一聚合度殼寡糖。

單一聚合度殼寡糖的檢測(cè)采用UPLC/MS，分析條件如下[16]：色譜柱：BEH Amide(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)；樣品濃度：1 mg/mL；進(jìn)樣量：1 μL；流動(dòng)相：乙腈-水，0 min～15 min：80%乙腈-20%乙腈梯度洗脫；流速：0.3 mL/min；柱溫：45 ℃。質(zhì)譜分析采用電噴霧離子源(ESI+)，離子源溫度：100 ℃；脫溶劑氣溫度：300 ℃；毛細(xì)管電壓：3.5 kV；錐脫溶劑氣流量：500 L/h；錐孔電壓：30 V；錐孔氣流量： 50 L/h；四級(jí)桿范圍m/z：100～1 200；碰撞能量：6 V。

1.3.5 單一聚合度殼寡糖對(duì)大腸桿菌的抑菌效果觀察

方法同1.3.1的ELISA板法，試驗(yàn)組為純化后的殼二糖、殼三糖、殼四糖、殼五糖、殼六糖和氨基葡萄糖。按公式(1)計(jì)算抑菌活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 搖瓶法和ELISA板法測(cè)定殼寡糖抑菌活性的差別

殼寡糖對(duì)大腸桿菌的抑制作用在搖瓶法和ELISA板法上的結(jié)果見圖1。通過(guò)比較吸光度值的大小，來(lái)判斷微生物生長(zhǎng)情況：吸光度值越高，即大腸桿菌生長(zhǎng)越旺盛，抑菌活性越差。由圖1(A)搖瓶法抑菌曲線可見，當(dāng)殼寡糖濃度為0.625 mg/mL、1.25 mg/mL和2.5 mg/mL時(shí)0 h～4 h內(nèi)大腸桿菌生長(zhǎng)情況與空白對(duì)照相差無(wú)幾，培養(yǎng)時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)后菌體生長(zhǎng)才受到一定的抑制，這與閆海俠等[17]采用平板計(jì)數(shù)大腸桿菌活菌數(shù)的結(jié)果一致，他們發(fā)現(xiàn)0 h～4 h內(nèi)低濃度殼寡糖試驗(yàn)組活菌數(shù)反而比空白對(duì)照組多，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，活菌數(shù)量才逐漸減少。ELISA板法的結(jié)果顯示，所有實(shí)驗(yàn)組在前12 h均可完全抑制菌體的生長(zhǎng)，抑菌效果優(yōu)于搖瓶法，因?yàn)榇竽c桿菌為好氧菌，搖瓶的供氧條件優(yōu)于ELISA板，因此大腸桿菌生長(zhǎng)更旺盛，抑菌效果不如ELISA板。不管是搖瓶法還是ELISA板法，當(dāng)殼寡糖濃度大于5 mg/mL時(shí)都可完全抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)，抑菌效果與同濃度苯甲酸鈉相近。由此可見抑菌能力隨殼寡糖濃度增大而增強(qiáng)，因?yàn)闅す烟欠肿又写嬖凇狽H2基團(tuán)，隨著濃度增加，溶液中—NH2的濃度也增加，從而增強(qiáng)抑菌效果[18]。

ELISA板法和傳統(tǒng)的搖瓶法相比，節(jié)省試劑試藥，操作更簡(jiǎn)便，無(wú)需取樣，酶標(biāo)儀一次可以同一板上所有數(shù)據(jù)，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用ELISA板法。

2.2 pH對(duì)抑菌效果的影響

從表1中可以看出，pH為4時(shí)，各濃度實(shí)驗(yàn)組均能有效抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)，0.078 mg/mL的殼寡糖抑菌活性即可接近90%，這可能與過(guò)酸的環(huán)境導(dǎo)致菌體不生長(zhǎng)或生命力較低，使得殼寡糖對(duì)其抑制作用比較明顯。而當(dāng)pH增加到7時(shí)，5 mg/mL的殼寡糖才能達(dá)到90%的抑菌活性，是前者的64倍。pH增大，殼寡糖生成質(zhì)子化胺減少，低濃度的實(shí)驗(yàn)組沒有抑菌效果，反而作為碳源被細(xì)菌利用，促進(jìn)了細(xì)菌生長(zhǎng)[19-20]。

(A)

(B)

○：空白對(duì)照；■：殼寡糖0.625 mg/mL；×：殼寡糖1.25 mg/mL；△：殼寡糖2.5 mg/mL；◇：殼寡糖5 mg/mL；●：殼寡糖10 mg/mL；□：苯甲酸鈉5 mg/mL。

(A：搖瓶法；B：ELISA板法)

圖1 殼寡糖對(duì)大腸桿菌的抑制作用

2.3 脫乙酰度對(duì)抑菌效果的影響

從表2中可以看出，脫乙酰度越高，抑菌效果越好。脫乙酰度為95%的殼寡糖濃度極低時(shí)就表現(xiàn)出抑菌活性，5 g/L時(shí)就可完全抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)；而脫乙酰度為45%的殼寡糖在濃度為10 mg/mL時(shí)才表現(xiàn)出抑菌作用，40 mg/mL也不能完全抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)，抑菌活性只有56%。因?yàn)橐志饔玫陌l(fā)揮，主要是靠游離氨基，脫乙酰度增加，游離氨基含量增加，其抑菌活性越高[21]。

表1 不同pH下各濃度殼寡糖的抑菌活性

注：—表示菌體生長(zhǎng)情況超過(guò)空白對(duì)照，無(wú)法計(jì)算抑菌活性。

表2 不同脫乙酰度殼寡糖對(duì)大腸桿菌的抑制作用

注：—表示菌體生長(zhǎng)情況超過(guò)空白對(duì)照，無(wú)法計(jì)算抑菌活性。

2.4 不同單一聚合度殼寡糖的抑菌性能

根據(jù)液質(zhì)聯(lián)用來(lái)確認(rèn)分離得到的單一聚合度殼寡糖，根據(jù)液相圖譜確定單體純度，根據(jù)質(zhì)譜圖確認(rèn)單體的聚合度[22]。從圖2、3的液相圖中可以看出，殼二糖和殼三糖的純度均在96%以上，對(duì)應(yīng)時(shí)間的質(zhì)譜圖顯示，m/z分為341.2和502.2，確認(rèn)為殼二糖和殼三糖的分子離子峰。圖4的液相圖中出現(xiàn)兩個(gè)峰，根據(jù)對(duì)應(yīng)時(shí)間的質(zhì)譜圖判斷m/z為663.3的主要為殼四糖，并混有少量的殼三糖。圖5中m/z為824.4的主要為殼五糖，并混有少量殼三糖、殼四糖、殼六糖及更高聚合度的糖；圖6中m/z為985.5的主要為殼六糖，并混有少量的殼三糖、殼四糖、殼五糖及更高聚合度的糖。

將制備得到的單一聚合度殼寡糖和氨基葡萄糖分別進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，根據(jù)表3的結(jié)果可以看出，氨基葡萄糖非但沒有抑菌作用，反而作為碳源促進(jìn)了菌體生長(zhǎng)，隨著單一聚合度殼寡糖聚合度的提高，抑菌效果越來(lái)越好；這與李克成等[23]利用單一聚合度的殼寡糖對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符，根據(jù)他們的報(bào)道，對(duì)于金黃色葡萄球菌而言，聚合度大于5的殼寡糖分子結(jié)構(gòu)是抑菌活性所必須的。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)，對(duì)于大腸桿菌，當(dāng)殼寡糖聚合度大于4、濃度為40 mg/mL時(shí)，抑菌活性能達(dá)到99%以上。

圖2 殼二糖的UPLC-MS圖譜

圖3 殼三糖的UPLC-MS圖譜

圖4 殼四糖的UPLC-MS圖譜

圖5 殼五糖的UPLC-MS圖譜

圖6 殼六糖組分6的UPLC-MS圖譜

殼寡糖濃度/(mg/mL)氨基葡萄糖殼二糖殼三糖殼四糖殼五糖殼六糖0．078------0．156----15．0815．080．313---0．0015．0826．110．625---15．0815．0836．931．25--0．0016．5133．7145．232．5-10．6616．5121．3242．6454．365-18．4622．8636．9352．2276．8710-26．1133．7156．4162．1681．1820-36．9352．2265．7166．5798．8640-45．2365．7199．7799．7799．77

注：-表示菌體生長(zhǎng)情況超過(guò)空白對(duì)照，無(wú)法計(jì)算抑菌活性。

3 結(jié) 論

不管是搖瓶法還是ELISA板法，當(dāng)殼寡糖濃度大于5 mg/mL時(shí)抑菌效果與同濃度苯甲酸鈉相近；采用ELISA板的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，即節(jié)省試藥又方便快捷。pH為4時(shí)，0.156 mg/mL的殼寡糖溶液抑菌活性即能超過(guò)90%；pH為7時(shí)，5 mg/mL的殼寡糖才能達(dá)到90%抑菌活性。脫乙酰度為95%時(shí)，5 mg/mL的殼寡糖溶液抑菌活性能超過(guò)97%；脫乙酰度為45%時(shí)，40 mg/mL的殼寡糖溶液抑菌活性僅有56%；ELISA板法顯示，聚合度越高抑菌活性越好，聚合度大于4的單一聚合度殼寡糖40 mg/mL時(shí)抑菌活性能達(dá)到99%。殼寡糖因含有質(zhì)子化銨，能與細(xì)菌帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜作用，干擾細(xì)菌細(xì)胞膜功能，造成細(xì)菌體內(nèi)細(xì)胞質(zhì)流失，干擾細(xì)胞的正常生理代謝，從而達(dá)到殺菌的目的[24]。因此，如降低pH、提高脫乙酰度、提高殼寡糖溶液濃度等能增加質(zhì)子化銨的措施，都能提高殼寡糖的抑菌活性。

[1] 竺國(guó)芳，趙魯杭.幾丁寡糖和殼寡糖的研究進(jìn)展[J].中國(guó)海洋藥物，2000，73(1)：43-46.

[2] Xia WSh, Liu P, Zhang JL,etal. Biological activities of chitosan and chitooligosaccharides[J]. Food Hydrocolloids, 2011, 25(2): 170-179.

[3] 常江波，余曉斌，譚秀花. 綠色木霉粗纖維素酶解液水解殼聚糖的研究[J].工業(yè)微生物，2011,41(4)：26-30.

[4] 趙希榮，夏文水.食品級(jí)殼聚糖乳酸鹽的制備、表征和抗菌活性[J].中國(guó)乳品工業(yè)，2005,33(8)：24-26.

[5] 王光華，張燕婉.脫乙酰殼多糖醋酸混合液對(duì)含氧包裝鮮豬肉中細(xì)菌生長(zhǎng)的影響[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，1992，(2)：1-8.

[6] Mellegard H, Strand SP, Christensen BE,etal. Antibacterial activity of chemically defined chitosans: Influence of molecular weight, degree of acetylation and test organism[J]. Int J Food Microbiol, 2011, 148(1): 48-54.

[7] 夏文水, 吳焱楠. 甲殼低聚糖功能性質(zhì)[J]. 無(wú)錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào), 1996, 15(4): 297-302.

[8] Jeon YJ, Park PJ, Kim SK. Antimicrobial effect of chitooligosaccharides produced by bioreactor[J]. Carbohydrate Polymers, 2001, 44(1): 71-76.

[9] 陳建國(guó), 鄭連英. 不同酶切方式制備的殼寡糖抑菌活性的研究[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào), 2006, 40(11): 1905-1908.

[10] Seyfarth F, Schliemann S, Elsner P,etal. Antifungal effect of high-and low-molecular-weight chitosan hydrochloride, carboxymethyl chitosan, chitosan oligosaccharide and N-acetyl-d-glucosamine againstCandidaalbicans,CandidakruseiandCandidaglabrata[J]. International journal of pharmaceutics, 2008, 353(1): 139-148.

[11] Jeon YJ，Park PJ，Kim SK. Antimicrobial effect of chitooligosaccharides produced by bioreactor[J].Carbohydrate Polymers,2001,44:71-76.

[12] Hancock REW，Lehrer R. Cationic peptides：a new source of antibiotics[J].Trends Biotechnol，1998,16:82-88.

[13] 張龍, 夏文水. 雙突躍電位滴定法測(cè)定殼聚糖脫乙酰度的影響因素[J]. 2004, 23(4): 20-27.

[14] 紀(jì)瑩, 趙軼, 周翔. 殼寡糖的制備及組分分析[J]. 中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué), 2003(3): 195-196.

[15] 陳小娥, 方旭波, 余輝.殼寡糖的薄層層析分析[J]. 浙江海洋學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)2008, 27(4): 361-365.

[16] 朱玉霞，李恒，陳列歡等. 低聚合度殼寡糖制備及其組分的色譜行為分析[J].食品工業(yè)科技，2013,34(15)：281-284.

[17] 閆海俠，劉佳，孟祥紅. 殼寡糖對(duì)大腸桿菌抑菌作用的研究[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2014,349(4)：1-5.

[18] 蔣玉燕，畢憶群，汪子偉. 聚氨基葡萄糖的體外抗菌活性[J].中國(guó)抗生素雜志，1996,21(1)：54-56.

[19] 楊宇民，馬振祥，尹繼成等. 系列水溶性殼聚糖衍生物的抑菌性能研究[J].中國(guó)公共衛(wèi)生，2005,21(9)：1080-1081.

[20] 嚴(yán)欽，沈月新，王造. 殼寡糖的制備及其抑菌性能研究[J].食品研究與開發(fā)，2003,24(2):26-27.

[21] 王鴻，沈月新.不同脫乙酰度殼聚糖的抑菌性[J].上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001,10(4)：380-382.

[22] 高麗霞，李春霞，王世欣.不同聚合度的殼寡糖單體的制備及其分析[J].中國(guó)海洋藥物，2013,32(3)：21-27.

[23] 李克成，邢榮娥，劉松等. 單一聚合度殼寡糖對(duì)金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的抑制作用研究[C].全國(guó)第九屆海洋生物技術(shù)與創(chuàng)新藥物學(xué)術(shù)會(huì)議摘要集.赤峰：2014.

[24] 馮小強(qiáng)，李小芳，楊聲等. 殼聚糖抑菌性能影響因素、機(jī)理及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國(guó)釀造，2009,202(1)：19-23.

Antibacterial activity of chitosan oligosaccharide on Escherichia coli

QIAN Jian-ying1， DING Zhen-zhong2， ZHU Yu-xia1， LI Heng1， SHI Jing-song1

1． School of Pharmaceutical Science, Jiangnan University, 214122, China； 2． Yangzhou Rixing Bio-Tech CO. LTD， 225601， China

In order to observe the effects of the antibacterial activity of chitosan oligosaccharide (COS) onEscherichiacoli, shake-flask method and ELISA-plate method were performed under the environments of different concentrations, different pH, different degree of deacetylation (DD) and different polymerization degree of monomers. Results revealed that its inhibitory effect was similar to that of the same concentration of sodium benzoate when the concentration ≥5 mg/mL. When pH was 4, the antibacterial activity of 0.156 mg/mL COS solution was over 90%. While pH was 7, the concentration of COS solution was 5 mg/mL. When DD was 95%, 5 mg/mL COS solution had antibacterial activity >97%. while DD was 45%, 40 mg/mL COS solution had antibacterial activity about 56%. When degree of polymerization was more than 4, the antibacterial activity of 40 mg/mL COS solution could reach 90%. These results showed that antibacterial activity onE.coliincreased with the increasing of concentration, DD, polymerization degree of monomer and the decreasing of pH. In addition, the ELISA-plate method had advantages of processing sample easily, fast analysis and saving reagents.

chitosan oligosaccharide; monomer; antibacterial activity

10.3969/j.issn.1001-6678.2016.06.003

十二五國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAD33B06)；江蘇省重大成果轉(zhuǎn)化(BA2015006)。

錢建瑛(1982～)，女，碩士，實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)樯镏扑帯?/p>

*通信作者：史勁松，E-mail：shijs@163.com。