劉煒 易鑫 李江 王江江

(1.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550003；2.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550002)

清解益肺湯及膠囊對(duì)lewis肺癌小鼠血清IL-2、INF-含量的影響

劉煒1易鑫2李江2王江江2

(1.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550003；2.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550002)

目的 研究清解益肺湯及膠囊劑對(duì)lewis肺癌小鼠脾臟指數(shù)以及血清白介素-2(IL-2)、γ-干擾素(INF-)水平的影響。方法 建立C57BL/6J雄性小鼠lewis肺癌模型，并隨機(jī)分為空白對(duì)照組，模型對(duì)照組，中藥高、中、低劑量組，順鉑組，順鉑+中劑量組，中藥膠囊組，每組10只，連續(xù)給藥14 d 。觀察lewis肺癌小鼠脾臟指數(shù)：采用ELISA法檢測(cè)小鼠血清中IL-2、INF-γ的含量。結(jié)果 順鉑組與模型組相比較脾臟指數(shù)降低(P<0.05)，聯(lián)合組以及中藥各組脾臟指數(shù)均增加(P<0.05)；聯(lián)合組與順鉑組比較脾臟指數(shù)增加(P<0.05)；與模型組相比較各中藥組IL-2、INF-含量均增加(P<0.05)。結(jié)論 清解益肺湯及膠囊能提高肺癌小鼠脾臟指數(shù)，并能一定程度解除化療對(duì)機(jī)體的免疫抑制作用，通過(guò)上調(diào)血清IL-2、INF-水平來(lái)增強(qiáng)T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫功能，發(fā)揮抗肺癌作用。

清解益肺湯及膠囊劑； lewis肺癌； 白介素-2(IL-2)；γ-干擾素(INF-)

肺癌是當(dāng)今世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung cancer, NSCLC)約占全部肺癌的80%～85%，并且大部分患者就診時(shí)己屬中晚期(Ⅲ-Ⅳ期)[1]。多項(xiàng)臨床研究證實(shí)，對(duì)于肺癌患者其細(xì)胞免疫功能會(huì)受到不同程度抑制，從而造成腫瘤的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)。肺癌患者體內(nèi)常表現(xiàn)為免疫功能抑制狀態(tài)[2]，臨床上多表現(xiàn)為氣陰兩虛型，中藥復(fù)方特別是益氣養(yǎng)陰復(fù)方多具有改善免疫功能作用。清解益肺湯是基于苗族傳統(tǒng)的用藥經(jīng)驗(yàn)，并結(jié)合中醫(yī)方劑理論中清熱解毒、益氣養(yǎng)陰的治法而成，全方由白花蛇舌草、半枝蓮、龍葵、黃芪、沙參、薏苡仁、莪術(shù)七味中藥組成，主要適用于氣陰兩虛型中晚期肺癌，其湯劑已經(jīng)過(guò)大量臨床病例證實(shí)其安全性和有效性[3]。本課題采用C57BL/6J雄性小鼠lewis肺癌模型，觀察清解益肺湯及膠囊對(duì)lewis肺癌小鼠血清IL-2、INF-γ水平的影響，初步闡明其抗肺癌的作用及免疫學(xué)機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

C57BL/6J雄性小鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量18～20 g(第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(軍)2012-0011；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境：貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。細(xì)胞株：小鼠lewis肺癌細(xì)胞珠(LLC)，來(lái)自ATCC細(xì)胞庫(kù)(細(xì)胞編號(hào)：CRT-1642)。

1.2 藥物及試劑

清解益肺湯(黃芪30 g、沙參30 g、白花蛇舌草15 g、半枝蓮15 g、薏苡仁15 g、莪術(shù)10 g、龍葵15 g)，常規(guī)方法制成煎劑含生藥1.3 g/mL，根據(jù)給藥劑量和給藥體積配成相應(yīng)濃度。清解益肺膠囊(貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院生藥制劑室提供，規(guī)格：含生藥1.3 g/mL)。順鉑(DDP，20 mg/支)(國(guó)藥準(zhǔn)字：H20030675，產(chǎn)品批號(hào)：20131013，南京制藥廠有限公司)。主要試劑：小鼠IL-2 ELISA試劑盒、小鼠INF-ELISA試劑盒(美國(guó)RD公司產(chǎn)品)，Hyclone胎牛血清(批號(hào)：SV30087.01)。

1.3 儀器

超凈工作臺(tái)、酶標(biāo)儀(北京新風(fēng)ZS-3型)、8聯(lián)排移液器(BRAND)離心機(jī)(湘儀貝克TGL-20 M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī))、37℃恒溫箱(天津泰斯特202-2AB電熱恒溫箱)、自動(dòng)洗板機(jī)(北京拓普DEM-3)、精密電子天平。

1.4 方法

lewis肺癌小鼠造模與分組：采用小鼠lewis肺癌移植瘤模型。無(wú)菌條件下選取生長(zhǎng)良好的C57BL/6J荷瘤小鼠瘤組織，按瘤重∶生理鹽水1∶3比例制成瘤細(xì)胞懸液，用生理鹽水調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/mL，每只0.2 mL接種于除空白對(duì)照組外的其余各組小鼠右前腋窩皮下。并隨機(jī)分為：空白對(duì)照組，模型對(duì)照組，中藥高、中、低劑量組，順鉑陽(yáng)性組，順鉑+中劑量組，中藥膠囊組。接種瘤細(xì)胞24 h后開(kāi)始給藥，空白對(duì)照組，模型對(duì)照組：均予滅菌生理鹽水0.4 mL灌胃，1次/d，連續(xù)給生理鹽水14 d；中藥高劑量組、中藥中劑量組、中藥低劑量組：分別灌胃含生藥2.6 g/mL、1.3 g/mL、0.65 g/mL的藥液0.4 mL，1次/d，連續(xù)給藥14 d；中藥膠囊組：1.3 g/mL生藥濃度灌胃，0.4 mL/只，1次/d，連續(xù)給藥14 d；中劑量+順鉑組：1.3 g/mL濃度中藥0.4 mL灌胃，1次/d，連續(xù)給藥14 d，順鉑0.3 mL腹腔注射，1次/隔日；順鉑陽(yáng)性組：按每只2 mg/kg·d-1劑量給藥，用生理鹽水稀釋成0.2 mg/mL濃度，0.3 mL腹腔注射，1次/隔日。于末次給藥24 h后處死小鼠，進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 觀察指標(biāo)

(1)荷瘤小鼠脾臟指數(shù)測(cè)定：末次給藥24 h后脫頸處死小鼠，無(wú)菌摘取小鼠脾臟，迅速于精密電子分析天平上稱(chēng)重，計(jì)算各組小鼠脾臟指數(shù)。計(jì)算公式：脾臟指數(shù)=脾臟重量(mg)/體質(zhì)量(g)。(2)ELISA法檢測(cè)各組lewis肺癌小鼠血清IL-2、INF-γ水平：摘取小鼠眼球留取血液，全部血液標(biāo)本靜置30 min后，放入離心機(jī)中，2 000 rpm離心15 min，收集上清液置于-80℃低溫冰箱保存。取出小鼠IL-2、INF-ELISA試劑盒嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，用OD450檢測(cè)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，各組樣本的IL-2、INF-含量根據(jù)OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出相應(yīng)濃度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 清解益肺湯及膠囊對(duì)lewis肺癌小鼠脾臟指數(shù)的影響

順鉑組與模型組相比較脾臟指數(shù)降低(P<0.05)，聯(lián)合組以及中藥各組脾臟指數(shù)均增加(P<0.05),聯(lián)合組與順鉑組比較脾臟指數(shù)增加(P<0.05)。見(jiàn)表1。

組別只數(shù)脾臟指數(shù)(mg/g)空白對(duì)照組105.90±0.32模型對(duì)照組101.94±0.22中藥高劑量組105.30±0.31*中藥中劑量組104.86±0.52*中藥低劑量組103.16±0.37*順鉑陽(yáng)性組81.38±0.26▽順鉑+中劑量組102.65±0.37*°中藥膠囊組105.42±0.63*

注：與模型組相比，▽P<0.05；與順鉑組相比，°P<0.05；與模型組相比，*P<0.05。

2.2 清解益肺湯及膠囊對(duì)lewis肺癌小鼠血清IL-2、INF-水平的影響

模型組小鼠血清IL-2、INF-含量明顯低于空白組；與模型組相比較各中藥組IL-2、INF-含量均增加(P<0.05)。見(jiàn)表2。

組別只數(shù)IL-2(pg/mL)INF-?(pg/mL)空白對(duì)照組10128.68±4.98*581.19±11.66*模型對(duì)照組1052.84±2.75▽211.13±14.41▽中藥高劑量組1097.29±3.47*476.73±10.38*中藥中劑量組1084.13±3.19*407.63±14.31*中藥低劑量組1074.27±2.84*344.87±10.1*順鉑陽(yáng)性組834.53±2.94184.81±13.94順鉑+中劑量組1058.38±2.48*300.88±10.76*中藥膠囊組1096.44±3.61*469.41±12.22*

注：與空白組相比，▽P<0.05；與模型組相比，*P<0.05。

3 討 論

CD4+T細(xì)胞活化后可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，主要分為T(mén)h1和Th2兩個(gè)亞群，其中IL-2和INF-是Th1介導(dǎo)細(xì)胞免疫發(fā)揮機(jī)體免疫功能的兩個(gè)重要因子。IL-2是機(jī)體最主要、最強(qiáng)有力的T細(xì)胞生長(zhǎng)因子，它是保障機(jī)體正常免疫功能的關(guān)鍵因素。IL-2抗腫瘤作用不是直接殺傷腫瘤細(xì)胞，主要通過(guò)誘導(dǎo)和激活免疫細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞，解除腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的免疫抑制狀態(tài)并增強(qiáng)其免疫功能。IL-2的水平是反映腫瘤免疫功能的一項(xiàng)重要指標(biāo)．Neuner等[4]研究證實(shí)IL-2在NSCLC患者體內(nèi)處于受抑制狀態(tài)，其表達(dá)可以作為非小細(xì)胞肺癌預(yù)后的重要因子。INF-可誘導(dǎo)Th1細(xì)胞分化，激活巨噬細(xì)胞，直接殺傷腫瘤細(xì)胞。IL-2能誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞分泌INF-細(xì)胞因子，兩者協(xié)調(diào)增強(qiáng)機(jī)體免疫，發(fā)揮抗腫瘤作用。

本組資料結(jié)果顯示，清解益肺湯及膠囊能提高lewis肺癌小鼠免疫功能，并在一定程度上抑制化療導(dǎo)致的脾臟指數(shù)的下降，保護(hù)機(jī)體免疫能力，增強(qiáng)化療療效。清解益肺湯及膠囊能上調(diào)血清IL-2、INF-含量來(lái)增加Th1細(xì)胞因子表達(dá)，從而改善lewis肺癌小鼠T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫功能，發(fā)揮抗肺癌作用。清解益肺湯作為苗藥復(fù)方制劑，含有多種活性成分，其抗腫瘤作用機(jī)制，可能是多途徑，多靶點(diǎn)，本文只從細(xì)胞免疫方面初步探討了其抗腫瘤機(jī)制，后期我們還將進(jìn)一步從其它途徑來(lái)研究該復(fù)方制劑，以期從苗醫(yī)藥領(lǐng)域探索新型抗腫瘤藥物。

[1] 中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)肺癌專(zhuān)業(yè)委員會(huì).2010中國(guó)肺癌臨床指南[S].北京：人民衛(wèi)生出版社，2010：1.

[2]SimanG，GinsbergRJ，RuckdeschlJC.Small-celllungcancer[J].ChestSurgClinNAm，2001，11(1)：165-188．

[3] 劉煒.清解益肺湯治療老年晚期肺細(xì)胞肺癌56例療效觀察[J].醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐,2011，24(24)，2960-2961．

[4]NeunerA，SchindelM，WildenbergU，etal.Prognoslicsignificanceofcytokinemodulationinnon-small-celllungcancer[J]．IntJCancer，2002，101(3)：287-292．

The influence of Qingjieyifei decoction and capsule to the content of serum INF-γand IL-2 on lewis lung carcinoma in mice

LiuWei1,YiXin2,LIJiang2,WanJiangJiang2.

1.GuiyangCollegeofTraditionnalChineseMedicine,Guiyang550002,China.2.SecondHospitalAffiliatedtoGuiyangCollegeofTraditionnalChineseMedicine,Guiyang550003,China.

Objective To study the influence of Qingjieyifei decoction and capsule the content of serum INF-γ、IL-2 and spleen index on lewis lung carcinoma in mice .Methods: The male mouse model ofC57BL/6J was built to do the experiments. They were randomly divided into normal group, model group, the traditional Chinese medicine high, middle, low dose group, cisplatin group, cisplatin +middle dose group, Chinese medicine capsule dose. Each group were given medicine respectively.Observing spleen index and using the method of ELISA to detect the contents of serum IL-2、INF-γ. Results: Cisplatin group has lower spleen index compared with model group(P<0.05).Unions and traditional Chinese medicine groups have higher spleen index(P<0.05). Chinese medicine groups have higher contents of serum IL-2、INF-γcompared with model group(P<0.05). Conclusion: Qingjieyifei decoction and capsule can improve lung cancer in mice spleen index and to a certain extent to lift the immunosuppressive effect of chemotherapy ,on increase serum levels of IL-2, INF-γ to enhance cellular immune function of T cell mediated, play the anti-lung cancer effect.

Qingjieyifei decoction and capsule , lewis lung，IL-2，INF-γ

貴州省科學(xué)技術(shù)聯(lián)合基金項(xiàng)目[No：2010LKZ7005]

R-332

A

1000-744X(2016)02-0153-03

2015-07-16)