李大玉 余春波 束波 生欣 李長(zhǎng)福 范芳

(遵義醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

DNA-PKcs影響肝癌耐藥細(xì)胞Bel-7402/5-Fu增殖及機(jī)制的研究

李大玉 余春波 束波 生欣 李長(zhǎng)福 范芳△

(遵義醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

目的 檢測(cè)DNA-PKcs對(duì)肝癌耐藥細(xì)胞Bel-7402/5-Fu增殖的影響及其相關(guān)機(jī)制，探討DNA-PKcs在肝癌多藥耐藥的發(fā)生發(fā)展中的作用。方法 采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體法將siDNA-PKcs轉(zhuǎn)染Bel-7402/5-Fu細(xì)胞，cck-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況；流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期；Western blot檢測(cè)DNA-PKcs、TS蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，細(xì)胞增殖減少(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組S期細(xì)胞與對(duì)照組比較，細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05)；DNA-PKcs、TS蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組相比對(duì)照組蛋白表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 DNA-PKcs的表達(dá)沉默能抑制肝癌耐藥細(xì)胞Bel-7402/5-Fu的細(xì)胞增殖；其機(jī)制可能與沉默DNA-PKcs蛋白表達(dá)后， TS蛋白表達(dá)下調(diào)有關(guān)。

DNA依賴(lài)蛋白激酶催化亞基； Bel-7402/5-Fu； 細(xì)胞增殖； 機(jī)制

肝細(xì)胞癌是臨床常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其起病隱匿，侵襲性強(qiáng)，復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)決定了化療在綜合治療中有重要作用，但多藥耐藥是致使化療失敗的重要原因。DNA依賴(lài)蛋白激酶催化亞基(catalytic sunbunit of the DNA-dependent protein kinase,DNA-PKcs)是DNA依賴(lài)蛋白酶(DNA-dependent protein kinase,DNA-PK)的催化亞單位，參與許多細(xì)胞內(nèi)重要的生物學(xué)活動(dòng)，包括細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)、免疫細(xì)胞V(D)J重組、免疫細(xì)胞分化、基因重組性監(jiān)視、穩(wěn)定端粒結(jié)構(gòu)和防止染色體末端融合等[1]。目前關(guān)于DNA-PKcs在影響腫瘤耐藥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中確切的作用機(jī)制和功能還未清楚，現(xiàn)有研究表明DNA-PKcs與肝癌的耐藥有關(guān)[2]。本研究以siDNA-PKcs轉(zhuǎn)染 Bel-7402/5-Fu肝癌耐藥細(xì)胞，檢測(cè)DNA-PKcs沉默后對(duì)肝癌耐藥細(xì)胞Bel-7402/5-Fu增殖能力的影響，探討DNA-PKcs在肝癌耐藥的發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

Bel-7402/5-Fu細(xì)胞株購(gòu)于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；siRNA寡核苷酸購(gòu)于上海吉瑪基因生物技術(shù)有限公司；Lipofectamine○R2000 Reagent購(gòu)買(mǎi)于Invitrogen公司；CCK-8檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)PeproTech公司；碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)購(gòu)于凱基生物技術(shù)有限公司；DNA-PKcs抗體購(gòu)買(mǎi)于Assay biotech公司；TS抗體購(gòu)買(mǎi)于proteintech公司。其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將Bel-7402/ 5-Fu細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%的胎牛血清的1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 分組與轉(zhuǎn)染 分為空白對(duì)照組、NC對(duì)照組、siDNA-PKcs實(shí)驗(yàn)組。細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中，96孔板按5000個(gè)/孔，六孔板按5×105個(gè)/孔，融合度達(dá)到60%～80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。配制siRNA-脂質(zhì)體復(fù)合物，并加入對(duì)應(yīng)孔中，4～6 h換液。

1.2.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，首先制備成細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，按5 000個(gè)/孔接種于96孔板中，共3塊板，分別標(biāo)明24 h、48 h、72 h，16 h后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，5 h后棄培養(yǎng)基，按各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每孔加入10 μL的cck-8，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，490 nm波長(zhǎng)測(cè)定其吸光度值。用Graphpad prism5.0軟件分析細(xì)胞增殖情況。

1.2.4 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 將細(xì)胞接種于6孔板中，12 h后用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞12 h，細(xì)胞同步化處理后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，5 h后換液，用含100 ug/mL 5-Fu 的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，48 h后收集細(xì)胞，PI單染，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.2.5 Western blot檢測(cè)DNA-PKcs、TS蛋白表達(dá) 提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法定量樣品蛋白含量。SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%BSA封閉1.5 h，一抗孵育過(guò)夜(4 ℃)，TBST洗膜3次，二抗孵育2 h(室溫),TBST洗膜3次，ECL發(fā)光顯色，用ImageJ定量分析軟件分析灰度比。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)分析采用 Graphpad prism5.0軟件包，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間的均數(shù)比較采用單因素方差分析，P<0.05示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖

結(jié)果顯示，在細(xì)胞轉(zhuǎn)染siDNA-PKcs后，細(xì)胞培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，對(duì)照組間細(xì)胞增殖無(wú)明顯差異(P>0.05)；實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，細(xì)胞增殖減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1、圖1。

Groups24h48h72h空白對(duì)照組0.352±0.0230.578±0.0250.913±0.106NC對(duì)照組0.321±0.0150.561±0.0600.983±0.051siDNA-PKcs實(shí)驗(yàn)組0.227±0.0080.419±0.0270.526±0.023

注：*P <0.05；** P <0.01。圖1 各組細(xì)胞在24h、48h、72h增殖情況

2.2 Western blot檢測(cè)DNA-PKcs、TS的蛋白表達(dá)情況

結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組DNA-PKcs和TS蛋白表達(dá)下調(diào)，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖2。

注：1為空白對(duì)照組；2為NC對(duì)照組；3為siDNA-PKcs實(shí)驗(yàn)組；*P<0.01。圖2 各組細(xì)胞DNA-PKcs、TS蛋白表達(dá)情況

2.3 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染siDNA-PKcs實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較， S期細(xì)胞數(shù)量減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖3。

注：A為空白對(duì)照組；B為NC對(duì)照組；C為siDNA-PKcs實(shí)驗(yàn)組；*P<0.01。圖3 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞周期情況

3 討 論

肝癌是臨床常見(jiàn)的惡性腫瘤，目前常用手術(shù)結(jié)合放療和化療，但長(zhǎng)期放化療后容易出現(xiàn)多藥耐藥，這可能與細(xì)胞DNA損傷修復(fù)能力增強(qiáng)和DNA合成能力有關(guān)。然而，臨床很多化療藥物均會(huì)引起DNA損傷，從而阻礙DNA的生物合成。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，以DNA依賴(lài)蛋白酶(DNA-dependent protein kinase,DNA-PK)為核心組件的非同源重組修復(fù) (non-homologous end joining，NHEJ)途徑，在DNA雙鏈斷裂的修復(fù)中有著非常重要的作用[3-4]。

DNA-PKcs是DNA-PK的催化亞單位，位于染色體8ql1上，相對(duì)分子量為470kD，主要包括DNA斷裂結(jié)合區(qū)、催化功能區(qū)、Ku結(jié)合區(qū)三個(gè)功能區(qū)，屬于PI3K(phosphatidylinositol3-kinases，PI3K)家族[5-6]。DNA-PKcs能維持基因組的穩(wěn)定性并具有腫瘤抑制功能[7]。目前有研究表明，下調(diào)DNA-PKcs表達(dá)能增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[8]。在一些耐藥細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)DNA-PKcs表達(dá)和活性增加[9-10]，說(shuō)明DNA-PKcs可能會(huì)促進(jìn)某些腫瘤細(xì)胞耐藥。另有研究表明，DNA-PKcs 能通過(guò) AKT/GSK3 /c-myc途徑 , 調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖[11]。胸苷酸合成酶(TS)是 DNA生物合成所必需的，因此，抑制TS就能抑制DNA的生物合成，進(jìn)而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖[12]。本實(shí)驗(yàn)已通過(guò)沉默DNA-PKcs發(fā)現(xiàn)耐藥蛋白P-gp表達(dá)降低和DNA合成減少，因此推測(cè)耐藥細(xì)胞Bel-7402/5-Fu耐藥性降低可能與DNA-PKcs沉默所致的P-gp下調(diào)和DNA合成減少有關(guān)(已發(fā)表)。原因可能是DNA-PKcs介入肝癌耐藥細(xì)胞Bel-7402/5-Fu DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)和細(xì)胞DNA的生物合成，從而調(diào)控細(xì)胞的增殖。DNA-PKcs在某些耐藥細(xì)胞中表達(dá)增加和活性增強(qiáng)，增加了耐藥細(xì)胞DNA損傷修復(fù)的能力，從而能對(duì)抗化療藥物所致的DNA損傷而引起耐藥，促進(jìn)細(xì)胞增殖。本實(shí)驗(yàn)采用RNAi技術(shù)沉默DNA-PKcs的表達(dá)，cck-8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果顯示細(xì)胞增殖能力減弱。為更進(jìn)一步說(shuō)明沉默DNA-PKcs后能抑制細(xì)胞增殖，本實(shí)驗(yàn)還檢測(cè)了細(xì)胞周期，結(jié)果發(fā)現(xiàn)S期細(xì)胞減少，推測(cè)沉默DNA-PKcs后抑制細(xì)胞增殖可能是通過(guò)影響細(xì)胞DNA合成，從而影響其細(xì)胞增殖能力。所以，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)肝癌耐藥細(xì)胞Bel-7402/5-Fu中TS蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示沉默DNA-PKcs后肝癌耐藥細(xì)胞Bel-7402/5-Fu中TS蛋白表達(dá)明顯降低，說(shuō)明DNA-PKcs沉默能影響細(xì)胞增殖，其機(jī)制與DNA-PKcs表達(dá)沉默后下調(diào)TS蛋白的表達(dá)有關(guān)。DNA-PKcs是否還通過(guò)其它機(jī)制調(diào)控肝癌耐藥細(xì)胞的細(xì)胞增殖，有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)觀察。

[1] Someya M，Sakata K，Matsumoto Y，et al. The association of DNA-dependent protein kinase activity with chromosomal instability and risk of cancer[J]. Carcinogenesis，2006， 27 (1)：117-122.

[2] 梁大敏，束波，楊佳偉，等.shRNA沉默DNA-PKcs表達(dá)對(duì)肝癌耐藥細(xì)胞BEL7402/5-FU耐藥性的影響[J]. 遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2014,37(3)：304-307.

[3] Curtin NJ.DNA repair dysregulation from cancer driver to therapeutic target[J].Nat Rev Cancer,2012，12(12):801-817.

[4] Rothkamm K, Krüger I, Thompson LH, et al. Pathways of DNA double-strand break repair during the mammalian cell cycle[J].Mol Cell Biol， 2003，23:5706-5715.

[5] Woods DS,Sears CR,Turchi JJ. Recognition of DNA termini by the C-terminal region of the ku80 and the DNA-dependent protein kinase catalytic subunit[J].Plos One.2015，10(5):1-19.

[6] Gareth J， Williams, Michal Hammel,et al. Structural insights into NHEJ: building up an integrated picture of the dynamic DSB repair super complex, one component and interaction at a time[J]. DNA Repair (Amst)，2014，17: 110-120.

[7] 江娜,沈瑛,孔憲明,等.DNA-PK蛋白功能及其調(diào)控機(jī)制[J].醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志, 2011，8(3):278-282.

[8] Seo SB, Hur JG, Kim MJ, et al.TRAIL sensitize MDR cells to MDR-related drugs by down-regulation of P-glycoprotein through inhibition of DNA-PKcs/Akt/GSK-3beta pathway and activation of caspases[J].Mol Cancer,2010， 28(9):199.

[9] Ryu JS,Um JH,Kang CD, et al. Fractionated irradiation leads to restoration of drug sensitivity in MDR cells that correlates with down-regulation of P-gp and DNA-dependent protein kinase activity[J]. Radiat Res，2004 ，162(5):527-535

[10] Nishida Y,Mizutani N,Inoue M , et al. Phosphorylated Sp1 is the regulator of DNA-PKcs and DNA ligase IV transcription of daunorubicin-resistant leukemia cell lines[J].Biochim Biophys Acta，2014，1839(4):265-274.

[11] 黃越承,周平坤, 蔡建明,等. 肝癌及不同發(fā)育階段小鼠肝組織中 DNA-PKcs 的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞增殖作用的研究[J]. 第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2009,30(11):1217-1220.

[12] 高國(guó)蘭，萬(wàn)紅英，黃傳生,等. P-gP、GST-π、TS蛋白在宮頸癌中的表達(dá)及臨床意義[J].臨床腫瘤學(xué)雜志，2007,12(1)：23-26.

Study on the effect of DNA-PKcs on the proliferation and the mechanism of the multidrug-resistant hepatocellular
carcinoma cell line Bel7402/5-Fu

LiDayu,YuChunbo，ShuBo,ShengXin，LiChangfu,FanFang.

DepartmentofBiochemistry,ZunyiMedicalCollege,Zunyi563003,China.

Objective To detect the effect of DNA-PKcs on the proliferation of and its mechanism of the multidrug-resistant hepatocellular carcinoma cell line Bel7402/5-Fu, and to investigate the role of DNA-PKcs in the development of multidrug resistance. Methods Transiently was transfected into Bel7402/5-Fu cells via cathodolyte liposome transfection method，and cell proliferation was detected by CCK-8 assay. The cell cycle was detected by flow cytometry. Western blot (WB) tested protein expression of DNA-PKcs and TS. Results CCK-8 results showed that the experimental group compared with the control group, the cell proliferation was cells in the experimental group was decreased (P<0.05) compared with the control group. WB detection of DNA-PKcs and TS protein expression showed decreased expression of the experimental group than the control group (P<0.05), and there were statistical significantly differences. Conclusion The silence of DNA-PKcs can inhibit decreased (P<0.05). The results of flow cytometry showed that the number of S phase Bel7402 / 5-Fu cell proliferation, and possible mechanism of silencing DNA-PKcs expression after down-regulation of TS protein expression.

DNA-PKcs； Bel7402/5-Fu Cell proliferation; Mechanism

貴州省社發(fā)攻關(guān)項(xiàng)目[No.(2009)3066]

R-33

A

1000-744X(2016)02-0131-04

2015-09-19)

△通信作者，E-mail:fanf1970@126.com