樊有忠 趙珊珊

(1.陜西省商洛市鎮(zhèn)安縣醫(yī)院內科，陜西 商洛 711500；2.西安交通大學基礎醫(yī)學院人體解剖與組織胚胎學系，陜西 西安 710061)

吡格列酮對Aβ25-35所致癡呆大鼠的學習記憶能力及海馬內氧化應激的影響

樊有忠1趙珊珊2△

(1.陜西省商洛市鎮(zhèn)安縣醫(yī)院內科，陜西 商洛 711500；2.西安交通大學基礎醫(yī)學院人體解剖與組織胚胎學系，陜西 西安 710061)

目的 研究吡格列酮對Aβ25-35所致癡呆大鼠學習記憶能力和海馬內氧化應激反應的影響。方法 側腦室注射Aβ25-35建立大鼠AD模型，吡格列酮(40 mg/kg、80 mg/kg)灌胃21 d，次日行Morris水迷宮實驗，前5天定位航行訓練，第6天進行空間探索實驗。行為學實驗后第2天麻醉，斷頭取腦，提取腦組織勻漿，以備ELISA實驗。ELISA實驗研究大鼠海馬內的氧化應激反應。結果 Morris水迷宮結果顯示，模型組大鼠潛伏期較空白對照組明顯延長，而穿過平臺次數(shù)和平臺滯留時間縮短。經(jīng)吡格列酮治療后，潛伏期顯著縮短，穿過平臺次數(shù)和滯留時間也相應增加。ELISA結果顯示，模型組大鼠海馬內酶性抗氧化劑GSH-Px和SOD活性較空白對照組明顯降低，而脂質過氧化產(chǎn)物MDA含量增加。經(jīng)吡格列酮治療后，GSH-Px和SOD活性提高， MDA產(chǎn)生減少。結論 吡格列酮能改善癡呆大鼠的學習記憶能力，其機制可能與對抗海馬內的氧化應激反應有關。

Aβ25-35； 吡格列酮； 學習記憶能力； 氧化應激

阿爾茨海默病(alzheimer’s disease, AD)是一種中樞神經(jīng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)為進行性認知功能減退及精神障礙；典型的病理學特征為老年斑和神經(jīng)原纖維纏結[1]。流行病學調查顯示，截至2005年，全球有3 650萬人罹患AD，并以每20年增加一倍的速度增長，到2030年，估計患病人數(shù)將達到6 500萬[2]，這無疑給家庭和社會帶來了沉重的精神和經(jīng)濟負擔。因此，開發(fā)新的治療策略具有重要意義。淀粉樣蛋白瀑布級聯(lián)假說在AD的發(fā)病機制中占有重要地位，淀粉樣蛋白β(Aβ)沉積是AD的主要發(fā)病因素[3]。Aβ引發(fā)免疫/炎癥反應及神經(jīng)毒性級聯(lián)反應，從而引起廣泛的神經(jīng)退行性病變及神經(jīng)凋亡，導致學習記憶能力減退和認知功能障礙。其次還有能量代謝假說、膽堿能假說和氧化應激假說等。研究發(fā)現(xiàn)，氧化應激參與了AD的早期病理變化[4-5]，因此，抗氧化治療越來越受到重視。吡格列酮(pioglitazone, Pio)是噻唑烷二酮類藥，是一種過氧化物酶增殖物激活受體γ(peroxisomeproliferator-activatedreceptorγ, PPARγ)激動劑，主要用來治療糖尿病。研究發(fā)現(xiàn)，Pio能抑制皮質和海馬內星形膠質細胞及小膠質細胞介導的炎癥反應，抑制岡田酸制備的癡呆大鼠海馬內GSK-3β的表達，減少tau蛋白的過度磷酸化[6]。 但Pio能否對抗癡呆大鼠海馬內的氧化應激反應尚未見文獻報道。本實驗旨在研究Pio對Aβ25-35誘導癡呆大鼠學習記憶和海馬內氧化應激的影響。

1 材料與方法

1.1 動物喂養(yǎng)及分組

40只SD大鼠，體質量300～350 g，由西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心提供。12 h/d光照，溫度(25±2)℃，濕度60%～70%，大鼠飼料喂養(yǎng)。經(jīng)過7 d適應后，隨機分為空白對照組、Aβ25～35損傷組、Pio低劑量組(40 mg/kg)、Pio高劑量組(80 mg/kg)四個組。

1.2 試劑及儀器

Pio(純度>99.0%)購于日本Takeda公司，用時用二甲基亞砜(DMSO，2g/L)(Sigma,美國，純度>99.9%)配制成混懸液。Aβ25-35(Sigma,美國)用生理鹽水稀釋成2 mmol/L濃度，置于37 ℃電熱恒溫培養(yǎng)箱孵育24 h，使之變成凝聚狀態(tài)。谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)購于南京建成制藥公司(中國)。Morris水迷宮購于中國上海欣軟信息科技有限公司，Chromate酶標儀購于中國北京普天酶標儀。

1.3 動物模型的建立

將大鼠固定在腦立體定位儀上，常規(guī)備皮消毒，用手術刀切開表皮，按照腦立體定位儀圖譜，找到左側側腦室位置鉆孔(前囟后0.8 mm，中線左側旁開1.3 mm，硬腦膜下3.5 mm)，將Aβ25-35緩慢注入側

腦室，留針5 min；空白對照組注射等量的生理鹽水。注射完畢，用凡士林涂抹并縫合傷口，緩慢放回籠中。Aβ25-35注射后進行藥物干預，Pio低、高劑量組用Pio灌胃，劑量分別為40 mg/kg、80 mg/kg。空白對照組和模型組等量生理鹽水灌胃。連續(xù)干預21 d。

1.4 Morris 水迷宮實驗

藥物干預后第2天進行Morris水迷宮實驗，迷宮分為四個象限，將平臺放于第四象限，向迷宮內注入水，使水面高于平臺1 cm，水溫(25±2)℃。前5天進行定位航行實驗，使其在120 s內自由游泳，記錄逃避平臺潛伏期。若在120 s內未找到平臺，時間結束后使其在平臺上停留10 s。第6天進行空間探索實驗，撤掉平臺，使其自由游泳，記錄穿過平臺次數(shù)和平臺滯留時間。

1.5 ELISA實驗

Morris水迷宮實驗完成后第2天，水合氯醛(100 g/L,用量為300 mg/kg,i.p.)麻醉大鼠，斷頭取腦，迅速分離海馬組織，放入液氮中，-80 ℃保存?zhèn)溆?。取少量海馬組織稱量，按照組織∶生理鹽水=1∶9的比例，用組織勻漿器打碎混勻，制成10%組織勻漿，用紫外分光光度計測組織勻漿濃度，ELISA法檢測海馬組織內GSH-Px、SOD的活性及MDA的含量。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 Pio對Aβ25-35誘導的癡呆大鼠學習記憶能力的影響

Morris水迷宮結果顯示，大鼠側腦室注射Aβ25-35后，逃避平臺潛伏期較空白對照組明顯延長，在平臺滯留時間明顯減少(P<0.01)。經(jīng)Pio治療后，大鼠潛伏期縮短,且平臺滯留時間也相應增加，其中Pio低劑量組作用更為明顯(P<0.01)。見表1。

組 別n潛伏期(S)d1d2d3d4d5平臺滯留時間(s)空白對照組1022.43±2.284.92±0.393.42±0.312.50±0.261.56±0.181.27±0.17模型組1030.90±3.25##26.37±2.59##25.58±2.63##14.06±1.38##9.16±1.12##0.51±0.03##Pio低劑量組(40mg/kg)1025.96±2.24**13.55±1.42**10.54±1.37**7.69±0.76**4.67±0.50**0.75±1.03**Pio高劑量組(80mg/kg)1028.76±2.90**18.73±2.02**11.26±1.25**9.95±1.02**9.29±1.11**0.68±1.70**

注：與空白對照組相比，##P<0.01；與模型組相比，**P<0.01。

2.2 Pio對Aβ25-35導致的癡呆大鼠海馬內GSH0Px活性的影響

ELISA結果顯示，模型組大鼠海馬內GSH-Px活性較空白對照組明顯降低(P<0.01)，而Pio治療組GSH-Px活性則增加，其中尤以Pio低劑量組增加顯著(P<0.01)。見圖1。

注：與空白對照組相比，##P<0.01；與模型組相比，**P<0.01；與模型組相比，*P<0.05。圖1 Pio對Aβ25-35導致的癡呆大鼠海馬內GSH-Px活性的影響

2.3 Pio對Aβ25-35導致的癡呆大鼠海馬內SOD活性的影響

ELISA結果顯示，模型組大鼠海馬內SOD的活性較空白對照組明顯降低(P<0.01)；經(jīng)Pio治療后，SOD活性較模型組增加，其中以Pio低劑量組增加顯著(P<0.01)。見圖2。

注：與空白對照組相比，##P<0.01；與模型組相比，**P<0.01；與模型組相比，*P<0.05。圖2 Pio對Aβ25-35導致的癡呆大鼠海馬內SOD活性的影響

2.4 Pio對Aβ25-35導致的癡呆大鼠海馬內MDA含量的影響

ELISA結果顯示，模型組大鼠海馬內MDA的含量較空白對照組明顯增加(P<0.01)；經(jīng)Pio治療后，MDA含量較模型組減少，其中Pio低劑量組降低更加顯著(P<0.01)。見圖3。

注：與空白對照組相比，##P<0.01；與模型組相比，**P<0.01；與模型組相比，*P<0.05。圖3 Pio對Aβ25-35導致的癡呆大鼠海馬內MDA含量的影響

3 討 論

AD的主要病理學特征是Aβ沉積。研究發(fā)現(xiàn)，側腦室注射Aβ毒性片段可導致大鼠學習記憶能力減退及認知功能障礙，可用于建立研究AD的動物模型[7]。本實驗采用側腦室注射Aβ25-35建立大鼠AD模型，研究Pio對Aβ25-35引起的大鼠學習記憶能力和海馬內氧化應激的影響。Morris水迷宮結果顯示，模型組大鼠潛伏期較空白對照組明顯延長，穿過平臺次數(shù)和平臺滯留時間也相應減少，說明大鼠的學習記憶能力下降，表明模型建立成功。Pio治療組大鼠的潛伏期較模型組顯著降低，且低劑量組效果更佳；同時以Pio干預也增加了癡呆鼠的穿過平臺次數(shù)和平臺滯留時間。

Pio是非胰島素依賴型糖尿病的主要治療藥物[8]。研究表明，長期使用非甾體類抗炎藥物能降低患者AD的發(fā)病率，其機制除了能夠抑制環(huán)氧合酶，還有可能與激活PPARγ受體有關[9]。研究表明，PPARγ激動劑可抑制神經(jīng)元內誘導型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase, iNOS)的表達[10]。iNOS表達增加可使一氧化氮的產(chǎn)生增多，導致腦內的氧化應激增強，引起神經(jīng)元死亡[11]。

氧化應激反應參與了AD的早期病理變化[12-13]，自由基是導致神經(jīng)元凋亡和其它不可逆性病變的主要因素。由于大腦內還原性谷胱甘肽含量低[14]、神經(jīng)元細胞膜含有大量多元不飽和脂肪酸[15]以及大腦的正常代謝需要大量氧氣[16]，大腦極易受到自由基的攻擊[17-18]。氧化應激假說可以解釋AD的多元化特征及病因。故本研究采用Aβ25-35誘導的癡呆大鼠研究Pio 對癡呆鼠海馬內氧化應激的反應。ELISA結果顯示，側腦室注射Aβ25-35可致使大鼠海馬內氧化應激反應增強，酶性抗氧化劑GSH-Px和SOD活性降低，脂質過氧化產(chǎn)物MDA含量增加；而Pio治療組海馬內酶性抗氧化劑活性降低，脂質過氧化產(chǎn)物減少，表明Pio能對抗癡呆大鼠海馬內的氧化應激反應。

本實驗研究了Pio對AD的治療作用及其可能的機制，為下一步臨床試驗提供了依據(jù)。目前的治療藥物只能緩解AD的臨床癥狀，延緩AD進展，卻無法將其徹底治愈。因此，新的治療理念是防治未病。Pio對AD是否有預防作用，其它PPARγ激動劑對AD是否也有提高學習記憶的能力，我們將在后續(xù)的實驗中進行研究。此外，新的病因學假說認為AD是一種“Ⅲ型糖尿病”，即發(fā)生在大腦內的糖尿病，以糖/能量代謝紊亂為主要特征，進而影響線粒體功能和神經(jīng)突觸的可塑性。那么，Pio作為一種抗糖尿病藥物，是否也能通過改善癡呆大鼠大腦內糖/能量的代謝，改善大腦內的胰島素抵抗，提高癡呆大鼠的學習記憶能力，也有待進一步研究。

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Effects of pioglitazone on learning and memory deficits and oxidative stress in the hippocampus of Aβ25-35induced AD rats

FanYouzhong1,ZhaoShanshan2△.

1.DepartmentofInternalMedicine,ZhenanCountyHospitalofShangluoCity,Shaaanxi711500,China. 2.DepartmentofHumanAnatomyandHistology,SchoolofBasicMedicalSciencesofXianJiaotongUniversity,Xian710061,China.

Objective To study the effects of pioglitazone (Pio) on learning and memory deficits and oxidative stress in the hippocampus of Aβ25-35induced AD rats. Methods Intracerebroventricular injection of Aβ25-35to produce the model of AD. And the rats were administrated with Pio (40, 80 mg/kg, ig.) for 21 days. Morris water maze test was used to test learning and memory ability of the rats. The first 5 days, place navigation test was carried out followed by the spatial probe test on the sixth day. After behavior test, the rats were sacrificed for preparing tissue homogenate. And ELISA was used to measure the activity of GSH-Px and SOD and the level of MDA. Results Morris water maze test showed that the escape latency was prolonged in rats of model group compared to the control group while the number of crossing the platform and time spent on the platform were reduced. After administration of Pio, the escape latency was decreased and the number of crossing the platform and time spent on the platform were increased. Results of ELISA showed that Pio increased the activity of GSH-Px and SOD and decreased the level of MDA in the AD rats. Conclusions Pio could improve the learning and memory ability of AD rats and the mechanism maybe related to attenuating oxidative stress in the hippocampus.

Aβ25-35; Pioglitazone; Learning and memory; Oxidative stress

R-332；R965

A

1000-744X(2016)02-0119-04

2015-07-21)

△通信作者,E-mail: shanshanzhao_1988@163.com