■林俊宏 朱 輝 林琨杰 胡勝蘭 胡文鋒*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學，廣東廣州510642；2.東莞市林氏生物技術股份有限公司，廣東東莞523560）

隨著我國民眾生活水平的提高，肉蛋奶的需求量不斷增加，飼料工業(yè)和畜牧業(yè)發(fā)展迅猛，從而導致飼料原料尤其是蛋白質飼料缺乏的問題日益嚴重。利用現(xiàn)代生物工程技術的生物轉化開發(fā)新的蛋白飼料來源，同時通過生物轉化作用提高蛋白飼料的利用率和消化水平，提高其使用價值十分必要。

我國飼料蛋白包括以豆粕為主，輔之其他雜粕的植物性蛋白；以魚粉和血漿蛋白粉為主，輔之動物毛發(fā)水解蛋白以及昆蟲蛋白的動物性蛋白；以及少量的藻類、酵母、霉菌和細菌制成的微生物蛋白等。其中以血漿蛋白粉價格最高，用于斷奶仔豬飼料中養(yǎng)殖效益最好，其次為魚粉[1-2]。目前，國內(nèi)外魚粉加工工藝簡單，很少引入現(xiàn)代生物工程技術。僅有的生產(chǎn)發(fā)酵魚粉的工藝和產(chǎn)品，也多用于制作堆肥，沒有研究替代血漿蛋白粉的可能。微生物發(fā)酵處理使動物蛋白成分由大分子變成小分子的氨基酸和肽，這些成分具有很高的利用價值[1，3]。用這種方法制成的魚粉具有更高的附加值，勢必會受到市場的歡迎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及試劑

1.1.1 試驗材料

魚粉購自東莞市林氏生物技術股份有限公司；枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌由華南農(nóng)業(yè)大學食品學院應用微生物實驗室提供。

1.1.2 試驗試劑

枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基：胰蛋白胨（Tryptone）10 g、酵母提取物（Yeast extract）5 g、氯化鈉（NaCl）10 g、蒸餾水1 L，調(diào)節(jié)pH值至7.0,121℃滅菌30 min。

嗜酸乳桿菌培養(yǎng)基：胰蛋白胨（Tryptone）10 g、牛肉膏（Beef Extract）10 g、酵母膏（YEF）5 g、檸檬酸氫二銨[(NH4)2HC6H5O7]2 g、葡萄糖（C6H12O6·H2O）20 g、吐溫80 1.0 ml、乙酸鈉（CH3COONa·3H2O）5.0 g、磷酸氫二鉀（K2HPO4·3H2O）2.0 g、硫酸鎂（MgSO4·7H2O）0.58 g、硫酸錳（MnSO4·H2O）0.25 g，蒸餾水1 L，調(diào)節(jié)pH值至6.2～6.6，121 ℃滅菌30 min。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基：魚粉、水。

鹽酸溶液(CHCl=6 mol/l)∶將優(yōu)級純鹽酸與水等體積混合。

稀釋上機用檸檬酸鈉緩沖液(CNa+=0.2 mol/l，pH值2.2)：稱取檸檬酸三鈉19.6 g，用水溶解后加入優(yōu)級純鹽酸16.5 ml，硫二甘醇5.0 ml，苯酚1 g，加水定容至1 000 ml，搖勻，用G4垂熔玻璃砂芯漏斗過濾，備用。

總抗氧化能力（T-AOC）檢測試劑盒（比色法）：購自南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種的篩選

活化枯草芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌，分別在添加了一定量魚粉的固體培養(yǎng)基上進行平板涂布，放置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，觀察菌株生長狀況。選擇生長速度快、菌落特征明顯的菌落，采用劃線分離法進行純化，重復若干次后，獲得單一菌株。

1.2.2 生長曲線的測定

將篩選得到的枯草芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌進行液體培養(yǎng)，測定生長曲線?？莶菅挎邨U菌按1%接種量接入液體培養(yǎng)基中，裝液量為50 ml/250 ml，于37℃、150 r/min搖床培養(yǎng)；嗜酸乳桿菌按1%接種量接入液體培養(yǎng)基中，裝液量為50 ml/250 ml，于37℃靜置培養(yǎng)。采用比濁法，每2 h測定枯草芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌的OD600nm值，繪制生長曲線。

1.2.3 發(fā)酵條件的優(yōu)化

將篩選得到的菌株活化后，按1%接種量制備種子液?？莶菅挎邨U菌在37℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，嗜酸乳桿菌在37℃靜置培養(yǎng)16 h后將菌液接種到固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，從菌種接種比（3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3）、料水比（1∶0.6、1∶0.8、1∶1、1∶1.2、1∶1.4）、接種量（1%、3%、5%、7%、9%）、發(fā)酵溫度（25、30、35、40、45 ℃）和發(fā)酵時間（12、24、36、48、60 h）5個因素進行發(fā)酵工藝優(yōu)化。發(fā)酵完成后測定發(fā)酵產(chǎn)物中的小肽含量和揮發(fā)性鹽基氮含量。

1.3 指標測定方法

1.3.1 小肽含量的測定

酸溶性蛋白含氮量測定方法：稱取發(fā)酵魚粉干樣2.00 g，加入15%三氯乙酸（TCA）溶液10 ml，混合均勻，靜置5 min。將溶液定量轉移，在4 000 r/min下離心10 min后，取5 ml上清液放入凱氏燒瓶中，采用凱氏定氮法測定含氮量，具體操作和計算參照GB/T 6432—1994[4-5]。

發(fā)酵魚粉含氮量測定方法：稱取發(fā)酵魚粉干樣0.50 g放入凱氏燒瓶中，采用凱氏定氮法測定含氮量，具體操作和計算參見酸溶性蛋白含量的測定方法。

1.3.2 揮發(fā)性鹽基氮含量的測定

稱取10.0 g發(fā)酵魚粉置于錐形瓶中，加入100 ml蒸餾水，于磁力攪拌器上攪拌30 min后過濾，取10 ml濾液采用微量擴散法測定揮發(fā)性鹽基氮的含量，具體操作和計算參照GB/T 5009.44—2003[6]。

1.3.3 發(fā)酵魚粉總抗氧化能力的測定

稱取10 g發(fā)酵魚粉于錐形瓶中，加入90 ml蒸餾水，經(jīng)磁力攪拌器攪拌30 min后過濾，獲得10%勻漿液作為待測液，采用總抗氧化能力（T-AOC）檢測試劑盒（比色法）測定發(fā)酵魚粉的總抗氧化能力。

1.3.4 發(fā)酵魚粉氨基酸組成成分的測定

稱取試樣（約含蛋白7.5～25 mg）于20 ml安瓿瓶中準確至 0.1 mg，加10.00 ml鹽酸(CHCl=6 mol/l)，置液氮中冷凍，然后抽真空至7 Pa后封口。將水解管放在(110±1)℃恒溫干燥箱中，水解22～24 h。冷卻，混勻，開管，過濾，用移液管吸取適量的濾液于燒杯中，60℃蒸發(fā)至干，加少許水，重復蒸干2次。加入3～5 ml，pH值2.2稀釋上機用檸檬酸鈉緩沖液，使樣液中氨基酸濃度達50～250 nmol/ml，搖勻，過濾，利用氨基酸自動分析儀檢測氨基酸組成成分及含量。具體操作參照GB/T 18246—2000[7]。

2 結果與討論

2.1 菌株生長曲線（見圖1、圖2）

圖2 嗜酸乳桿菌生長曲線

在工業(yè)發(fā)酵的過程中，種子液的培養(yǎng)時間對發(fā)酵產(chǎn)品的品質至關重要。經(jīng)過培養(yǎng)達到對數(shù)生長期末期的種子液，活菌數(shù)達到最大值，且菌體保持較高的活性，有利于縮短發(fā)酵時的延滯期從而提高生產(chǎn)效率。通過研究發(fā)酵菌株的生長曲線，能確定種子液的最佳培養(yǎng)時間[8]。由圖1可知，培養(yǎng)6 h后枯草芽孢桿菌進入對數(shù)生長期，12 h時到達對數(shù)生長期末期，培養(yǎng)14 h后進入穩(wěn)定生長期，培養(yǎng)18 h后進入衰亡期。由圖2可知，培養(yǎng)4 h后嗜酸乳桿菌進入對數(shù)生長期，16 h時到達對數(shù)生長期末期，培養(yǎng)18 h后進入穩(wěn)定生長期，培養(yǎng)22 h后進入衰亡期。故枯草芽孢桿菌種子液培養(yǎng)時間為12 h，嗜酸乳桿菌種子液培養(yǎng)時間為16 h。

2.2 菌種接種比對發(fā)酵魚粉小肽含量和揮發(fā)性鹽基氮含量的影響（見圖3）

圖3 嗜酸乳桿菌和枯草芽孢桿菌的接種比對發(fā)酵魚粉小肽含量和揮發(fā)性鹽基氮含量的影響

稱取50 g魚粉加入250 ml錐形瓶中，按料水比1∶1、混合菌接種量5%、發(fā)酵溫度35℃、發(fā)酵時間24 h進行固態(tài)發(fā)酵試驗，根據(jù)嗜酸乳桿菌和枯草芽孢桿菌菌種接種比（3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3）設置試驗組。由圖3可見，隨著枯草芽孢桿菌比例的提高和嗜酸乳桿菌比例的降低，小肽含量由19.60%提高至23.52%，增加了3.92%；揮發(fā)性鹽基氮含量由38.9 mg/100 g提高至44.8 mg/100 g，增加了5.9 mg/100 g?？莶菅挎邨U菌比例的提高使蛋白酶的產(chǎn)量上升，魚粉中更多的大分子蛋白轉化為小分子的肽，表現(xiàn)為小肽含量的提高。但枯草芽孢桿菌在發(fā)酵的過程中產(chǎn)生了大量的代謝產(chǎn)物，同時也增加了揮發(fā)性鹽基氮的含量。相反，在嗜酸乳桿菌比例較高的情況下，雖然小肽含量相對減少，但避免了魚粉中蛋白質的過度分解。同時，嗜酸乳桿菌產(chǎn)生的乳酸也能在一定程度上抑制雜菌的生長和減少揮發(fā)性鹽基氮的產(chǎn)生。王凱英等[9]發(fā)現(xiàn)添加了乳酸的飼料低溫保存45 d后，其酸價、羰基值和揮發(fā)性鹽基氮含量均低于同等保存條件下的普通飼料，大腸桿菌菌落數(shù)和腹瀉率也有所下降，這與本試驗結果相一致。在嗜酸乳桿菌和枯草芽孢桿菌的接種比為1∶2時，發(fā)酵魚粉小肽含量為23.36%，較1∶1菌種接種比增長率為5.94%；揮發(fā)性鹽基氮含量為43.9 mg/100 g，較1∶1菌種接種比增長率為5.78%，小肽含量增長率高于揮發(fā)性鹽基氮含量增長率。當進一步提高枯草芽孢桿菌的比例至1∶3時，發(fā)酵魚粉小肽含量為23.52%，增長率僅為0.68%，而揮發(fā)性鹽基氮含量增長率為2.05%，高于小肽含量增長率。綜合考慮，確定嗜酸乳桿菌和枯草芽孢桿菌接種比為1∶2。

2.3 料水比對發(fā)酵魚粉小肽含量和揮發(fā)性鹽基氮含量的影響（見圖4）

圖4 料水比對發(fā)酵魚粉小肽含量和揮發(fā)性鹽基氮含量的影響

稱取50 g魚粉加入250 ml錐形瓶中，按菌種接種比（嗜酸乳桿菌∶枯草芽孢桿菌）1∶2、混合菌接種量5%、發(fā)酵溫度35℃、發(fā)酵時間24 h進行固態(tài)發(fā)酵試驗，根據(jù)料水比（1∶0.6、1∶0.8、1∶1、1∶1.2、1∶1.4）設置試驗組[10]。由圖4可見，隨著含水量的提高，發(fā)酵魚粉小肽含量先增加后減少，在料水比為1∶1時達到最大值23.32%；當料水比介于1∶0.6至1∶1之間時，揮發(fā)性鹽基氮含量先增加后減少，在料水比為1∶1時達到最小值43.4 mg/100 g。當含水量高于50%（料水比1∶1）后，揮發(fā)性鹽基氮含量迅速上升，在料水比1∶1.4時達到70.9 mg/100 g，這可能是因為在高溫、高水分條件下，微生物生長旺盛，蛋白酶活性增強，導致魚粉蛋白被過度分解，產(chǎn)生大量的揮發(fā)性鹽基氮[11]。試驗中也發(fā)現(xiàn)，在料水比為1∶1.2和1∶1.4的條件下，發(fā)酵底物較稀濕粘連，發(fā)酵后期更是液化嚴重，不利于發(fā)酵產(chǎn)物下游處理。綜合考慮，確定料水比為1∶1。

2.4 接種量對發(fā)酵魚粉小肽含量和揮發(fā)性鹽基氮含量的影響（見圖5）

稱取50 g魚粉加入250 ml錐形瓶中，按菌種接種比（嗜酸乳桿菌∶枯草芽孢桿菌）1∶2、料水比1∶1、發(fā)酵溫度35℃、發(fā)酵時間24 h進行固態(tài)發(fā)酵試驗，根據(jù)接種量（1%、3%、5%、7%、9%）設置試驗組。揮發(fā)性鹽基氮是指動物性食品由于酶和細菌的作用，在腐敗過程中，使蛋白質分解而產(chǎn)生氨以及胺類等堿性含氮物質。揮發(fā)性鹽基氮含量反映了發(fā)酵魚粉的氨基酸損失和腐敗程度，因此在發(fā)酵生產(chǎn)中應盡量減少揮發(fā)性鹽基氮的產(chǎn)生[12]。由圖5可見，隨著接種量的增大，小肽含量和揮發(fā)性鹽基氮含量總體上都增加。當接種量為9%時，小肽含量達到25.90%，揮發(fā)性鹽基氮含量也高達59.9 mg/100 g。接種量為5%的發(fā)酵魚粉，揮發(fā)性鹽基氮僅為42.5 mg/100 g，相對于接種量9%的發(fā)酵魚粉降低了29.05%；小肽含量為24.77%，僅比接種量9%的發(fā)酵魚粉低1.13%。綜合考慮，確定接種量為5%。

圖5 接種量對發(fā)酵魚粉小肽含量和揮發(fā)性鹽基氮含量的影響

2.5 發(fā)酵溫度對發(fā)酵魚粉小肽含量和揮發(fā)性鹽基氮含量的影響（見圖6）

圖6 發(fā)酵溫度對發(fā)酵魚粉小肽含量和揮發(fā)性鹽基氮含量的影響

稱取50 g魚粉加入250 ml錐形瓶中，按菌種接種比（嗜酸乳桿菌∶枯草芽孢桿菌）1∶2、料水比1∶1、混合菌接種量5%、發(fā)酵時間24 h進行固態(tài)發(fā)酵試驗，根據(jù)發(fā)酵溫度（25、30、35、40、45 ℃）設置試驗組。溫度通過綜合影響各類代謝反應對微生物的生長產(chǎn)生作用，具體表現(xiàn)在兩方面：一是隨著環(huán)境溫度的上升，微生物細胞中生物化學反應速度加快；二是隨著溫度的上升，細胞中對溫度較為敏感的組分（蛋白質、核酸等）可能會受到不可逆的破壞。溫度過高會破壞細胞膜中的結構和培養(yǎng)基的溶氧量[13]。由圖6可見，隨著溫度的上升，小肽含量和揮發(fā)性鹽基氮含量總體逐漸升高。當發(fā)酵溫度為45℃時，小肽含量達到24.97%，揮發(fā)性鹽基氮含量也高達72.3 mg/100 g。揮發(fā)性鹽基氮過高不僅使發(fā)酵魚粉產(chǎn)生氨臭味、適口性變差，嚴重的會導致動物中毒[12]。發(fā)酵溫度為35℃的發(fā)酵魚粉，揮發(fā)性鹽基氮僅為56 mg/100 g，相對于發(fā)酵溫度為45℃的發(fā)酵魚粉揮發(fā)性鹽基氮含量降低了22.54%；小肽含量為23.55%，僅比發(fā)酵溫度為45℃的發(fā)酵魚粉低1.42%。綜合考慮，確定發(fā)酵溫度為35℃。

2.6 發(fā)酵時間對發(fā)酵魚粉小肽含量和揮發(fā)性鹽基氮含量的影響（見圖7）

圖7 發(fā)酵時間對發(fā)酵魚粉小肽含量和揮發(fā)性鹽基氮含量的影響

稱取50 g魚粉加入250 ml錐形瓶中，按菌種接種比（嗜酸乳桿菌∶枯草芽孢桿菌）1∶2、料水比1∶1、混合菌接種量5%、發(fā)酵溫度35℃進行固態(tài)發(fā)酵試驗，根據(jù)發(fā)酵時間（12、24、36、48、60 h）設置試驗組。由圖7可見，隨著發(fā)酵時間的延長，菌群大量生長，在微生物的作用下小肽含量逐漸升高。但微生物的代謝產(chǎn)物也不斷累積，揮發(fā)性鹽基氮含量也逐漸升高。發(fā)酵60 h時，小肽含量達到22.97%，但揮發(fā)性鹽基氮含量也高達117.6 mg/100 g。發(fā)酵24 h時，小肽含量達到22.47%，揮發(fā)性鹽基氮含量達到77 mg/100 g。隨后小肽含量增長速度減緩，到發(fā)酵60 h時，小肽含量僅增長0.5%，增長率僅為2.23%。但揮發(fā)性鹽基氮含量迅速增加，到發(fā)酵60 h時，揮發(fā)性鹽基氮含量增加40.6 mg/100 g，增長率為52.73%。綜合考慮，選擇發(fā)酵時間為24 h。

2.7 發(fā)酵時間對發(fā)酵魚粉總抗氧化活性的影響（見圖8）

圖8 發(fā)酵時間對發(fā)酵魚粉總抗氧化活性的影響

稱取50 g魚粉加入250 ml錐形瓶中，按菌種接種比（嗜酸乳桿菌∶枯草芽孢桿菌）1∶2、料水比1∶1、混合菌接種量5%、發(fā)酵溫度35℃進行固態(tài)發(fā)酵試驗。利用水浸提法提取發(fā)酵魚粉小肽，采用總抗氧化能力（T-AOC）檢測試劑盒（比色法）測定發(fā)酵魚粉的總抗氧化能力。由圖8可見，隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵魚粉總抗氧化活性總體逐漸上升。發(fā)酵前24 h，發(fā)酵魚粉總抗氧化能力提升速度最快，增長率為69.02%；發(fā)酵24～48 h，發(fā)酵魚粉總抗氧化能力提升速度放緩，增長率為11.46%；發(fā)酵48 h后，發(fā)酵魚粉總抗氧化能力維持在1.61～1.65單位/mg prot.之間。與小肽含量變化規(guī)律（圖7）相結合分析可以發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵前24 h魚粉的小肽含量高速增長，使發(fā)酵魚粉的總抗氧化能力也增長迅速；發(fā)酵24～48 h，雖然小肽含量增長率僅為0.62%，但發(fā)酵魚粉總抗氧化能力增長率仍維持在11.46%。Chen等[14]研究表明，小肽具有的抗氧化活性來源于其包含的能與自由基反應的某些特殊的供氫基團，而這些基團只有當小肽分子量合適時，才能得到最大的暴露并與自由基充分作用，發(fā)揮較強的抗氧化作用。發(fā)酵24～48 h，總抗氧化能力增長率高于小肽含量增長率是因為小肽在微生物的作用下更多具有抗氧化功能的基團得到暴露，抗氧化活性得到提高。并且小肽分子量進一步降低，也直接影響其清除自由基的能力[15-16]。同時，肽分子量的降低必然導致?lián)]發(fā)性鹽基氮的大量產(chǎn)生，這也與揮發(fā)性鹽基氮含量變化規(guī)律（圖7）試驗結果相吻合。

2.8 發(fā)酵魚粉的氨基酸組成成分分析(見表1)

表1 發(fā)酵魚粉的氨基酸組成成分分析

稱取50 g魚粉加入250 ml錐形瓶中，按菌種接種比（嗜酸乳桿菌：枯草芽孢桿菌）1∶2、料水比1∶1、混合菌接種量5%、發(fā)酵溫度35℃、發(fā)酵時間24 h進行固態(tài)發(fā)酵試驗，其發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)酸水解后測定氨基酸組成成分及其含量。由表1可見，魚粉經(jīng)發(fā)酵處理后，各類氨基酸含量均有所提高，總提高率為30.52%，其中脯氨酸（Pro）提高率最大為57.22%。目前，已知的豬限制性氨基酸有賴氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸、組氨酸等[17]。其他研究也表明，組氨酸、酪氨酸和蛋氨酸等氨基酸具有一定的抗氧化活性[18-19]，且甲硫氨酸易從體內(nèi)流失，需在食物中大量補充[20]。試驗結果表明，魚粉經(jīng)發(fā)酵處理，賴氨酸（Lys）含量提高27.75%、蘇氨酸（Thr）含量提高43.81%、蛋氨酸（Met）含量提高30.00%、組氨酸（His）含量提高32.00%、酪氨酸（Tyr）含量提高33.54%，限制性氨基酸和抗氧化能力都獲得了顯著提高，適合應用于豬飼料。

3 結論

本文以兩個重要參數(shù)小肽含量和揮發(fā)性鹽基氮含量作為指標，從菌種接種比、料水比、接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間等5個因素對混合菌固態(tài)發(fā)酵制備發(fā)酵魚粉的工藝進行優(yōu)化，確定最佳固態(tài)發(fā)酵魚粉的條件是：菌種接種比(嗜酸乳桿菌：枯草芽孢桿菌)1∶2、料水比1∶1、接種量5%、發(fā)酵溫度35℃、發(fā)酵時間24 h，此條件下，發(fā)酵魚粉小肽含量為24.77%，較普通魚粉提高率為25%以上；揮發(fā)性鹽基氮為42.5 mg/100 g，較普通魚粉降低55%以上，符合GB/T 19164—2003對魚粉揮發(fā)性鹽基氮含量的要求[21]。總抗氧化能力為1.44單位/mg prot.，較普通魚粉提升70%以上，具有清除生物體內(nèi)過量自由基的巨大潛力，可應用于預防自由基誘發(fā)的疾病[5]。另外，發(fā)酵魚粉中，賴氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸、組氨酸等限制性氨基酸的含量都有了顯著提高，符合豬飼料對限制性氨基酸的要求，能有效保障動物體內(nèi)對限制性氨基酸的需求。綜上，發(fā)酵魚粉較傳統(tǒng)的普通魚粉有巨大的優(yōu)勢，應用于飼料中具有廣闊的市場前景。