王霞　劉曉丹　于曉明

摘要：采用RAPD技術(shù)對疊氮化鈉（NaN3）誘變的鳳尾雞冠花耐鹽突變體進行遺傳特性分析。結(jié)果表明：從98個隨機引物中篩選出12條適于鳳尾雞冠花的引物，共擴增出104條帶，對照和突變體擴增的總條帶數(shù)分別為49和55，其中9個引物出現(xiàn)差異條帶，3個引物未出現(xiàn)差異性條帶，鳳尾雞冠花耐鹽突變體與對照差異較大，變異率為31.73%，說明了NaN3能有效誘導(dǎo)鳳尾雞冠花的基因變異。

關(guān)鍵詞：鳳尾雞冠花；耐鹽突變體；RAPD鑒定

基金項目：吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究（吉教科合字〔2013〕第471號）

中圖分類號： S681.3 文獻標(biāo)識碼： A DOI編號： 10.14025/j.cnki.jlny.2016.23.048

隨機擴增多態(tài)性DNA（Random amplifie dpolymorphic DNA，簡稱RAPD）是建立在PCR基礎(chǔ)之上的檢測DNA多態(tài)性的分子標(biāo)記技術(shù)[1]，其利用PCR隨機合成多態(tài)性DNA片段，檢測被擴增區(qū)域內(nèi)遺傳特性變化，該技術(shù)的實施不依賴于種屬的特異性和基因組的結(jié)構(gòu)，無需制備探針，DNA用量少，分子識別率高，對環(huán)境污染小，成本低，已在分類學(xué)研究、品種鑒定、遺傳作圖等方面得到了廣泛的應(yīng)用[2-3]。目前，運用RAPD技術(shù)已經(jīng)成功的發(fā)現(xiàn)了眾多的突變型[4，5]。試驗對NaN3誘變的鳳尾雞冠花耐鹽突變體進行RAPD分析，進一步鑒定耐鹽突變體的遺傳穩(wěn)定性，為鳳尾雞冠花耐鹽新品系的誘變育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

材料：鳳尾雞冠花組培苗經(jīng)NaN3誘變初篩獲得的耐鹽突變體。

主要試劑：隨機引物購自生工生物工程（上海）股份有限公司；2×CTAB提取緩沖液、Tris-HCl、0.5 moloL-1 EDTA（pH 8.0）、氯仿-異戊醇（24︰1）、TE溶液、3 moloL-1 NaAC、異丙醇、乙醇、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)等，所有試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取及檢測 參照趙曦[6]等的CTAB法，以未經(jīng)處理的鳳尾雞冠花組培苗為對照，分別提取對照和初篩耐鹽突變體的基因組DNA，并采用紫外風(fēng)光光度計法和瓊脂糖凝膠電泳法對所提基因組進行鑒定。

1.2.2鳳尾雞冠耐鹽突變體的RAPD檢測

1.2.2.1引物篩選及RAPD反應(yīng) 從上海生工生物工程技術(shù)有限公司購進98個隨機引物（10個堿基），以對照和耐鹽突變體基因組DNA為模板，進行RAPD擴增，篩選出突變體與對照間具多態(tài)性的特異引物。

采用20μL的RAPD反應(yīng)體系，分別為：20ngoμL-1模板DNA 2.0 μL，10pm隨機引物1.0 μL，2.5 mmooL-1MgCl2 2.0 μL，2.5 mmooL-1 dNTP 0.3 μL，Taq酶1μL，10×PCR Buffer 2.0 μL，其余由ddH2O補充。反應(yīng)程序為： 94 ℃預(yù)變性5分鐘；94 ℃變性1分鐘，35℃退火45秒，72 ℃延伸1 分鐘，42 個循環(huán)；72 ℃再延伸10分鐘；4 ℃保溫。擴增產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠進行電泳分離和分析。

1.2.2.2RAPD標(biāo)記分析 通過篩選引物，檢測鳳尾雞冠花耐鹽突變體相對于對照在DNA分子水平上的變化，獲得突變體與對照間的多態(tài)性基因位點，以穩(wěn)定而清晰的條帶作為統(tǒng)計數(shù)據(jù)，對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計算變異率[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1基因組DNA的純度和濃度檢測

采用CTAB法提取得到的DNA顏色呈無色透明狀，較粘稠，易溶于TE溶液。對照和突變體DNA樣品OD260/OD280都在1.80-1.92之間，OD260/OD230都在1.98～2.10之間，表明所提DNA樣品中蛋白和RNA污染較少，DNA純度較高，凝膠電泳結(jié)果如圖1所示，基因組條帶清晰、整齊、明亮，無彌散現(xiàn)象，點樣孔清晰，可進行下一步實驗。

2.2 引物的篩選及RAPD分析

用98個隨機引物對鳳尾雞冠花耐鹽突變體及其對照進行RAPD分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有12條引物可擴增出清晰、明亮、多態(tài)性較好的條帶（表1），對鳳尾雞冠花對照和初篩獲得的耐鹽突變體進行了RAPD分析，發(fā)現(xiàn)12個隨機引物中，9個引物（S87，S88、S89、S97、S113、S424、S432，S435）出現(xiàn)差異條帶，3個引物（S98、S117、S440）未出現(xiàn)差異性條帶，其余引物均沒有擴增出條帶，圖2為多態(tài)性最好的3個隨機引物（S87、S432、S435）的擴增圖。12個可擴增引物共擴增出104條帶，其中對照和突變體分別擴增的總條帶數(shù)為49和55，擴增片段大小在100-2000bp之間。RAPD擴增結(jié)果中出現(xiàn)了新增或缺失條帶，與對照相比，突變體新增條帶11條，缺失條帶12條，鳳尾雞冠花耐鹽突變體與對照差異較大，變異率為31.73%，充分說明了NaN3結(jié)合組織培養(yǎng)技術(shù)能有效地誘導(dǎo)鳳尾雞冠花基因變異。

3 討論

RAPD是一種有效的檢測基因差異的技術(shù)，該技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于體外誘變育種引起的DNA多態(tài)性分析，鳳尾雞冠花組培苗經(jīng)NaN3處理后，結(jié)合植物組織培養(yǎng)技術(shù)，在半致死劑量的NaCl脅迫下誘變耐鹽突變體，RAPD擴增結(jié)果差異顯著。與對照相比，擴增帶型出現(xiàn)了差異，這些差異帶型主要有擴增條帶的消失、增加以及擴增條帶的強弱變化。引起擴增帶消失或新增的原因肯是引物互補位點發(fā)生堿基突變，或互補位點間的DNA發(fā)生插入或缺失，或插入片段過大，這些都能導(dǎo)致差異片段的出現(xiàn)。引起擴增條帶強度變化的原因可能是多拷貝引物結(jié)合位點上某些堿基發(fā)生突變，使引物結(jié)合量減少，造成DNA量減少，或是新增片段與原有某片段的分子量相近，使譜帶加深，即反映出譜帶深淺的變化。這些差異充分說明NaN3誘變結(jié)合體細胞無性系變異能引起遺傳物質(zhì)發(fā)生豐富的變異。

參考文獻

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[2]董喜存，李文建，余麗霞，等.用隨機擴增多態(tài)性DNA技術(shù)對重離了輻照大麗花花色突變體的初步研究[J].輻射研究與輻射工藝學(xué)報，2007，25（01）：62-64.

[3]潘寧，趙琦，土振蓮，等.矮化早熟高粱突變體的RAPD分析[J].生物技術(shù)通報，2005（02）：29-31.

[4]馬升華，姚艷玲，錢麗華，等.組培獲得大花蕙蘭葉色突變體的RAPD分析[J].杭州農(nóng)業(yè)科技，2007（03）：11-13.

[5]李明飛，謝彥周，劉錄祥，等.疊氮化鈉誘變普通小麥陜農(nóng)33突變體庫的構(gòu)建和初步評估[J].麥類作物學(xué)報，2015，35（01）：22-29.

[6]趙曦，王廣金，李鐵，等.大豆空間誘變突變體的RAPD分析[J].核農(nóng)學(xué)報，2014，28（05）：772-776.

[7]崔廣榮，張子學(xué)，張從宇，等.文心蘭NaN3離體化學(xué)誘變及RAPD檢測[J].廣西植物，2011，31（06）：836-843.

作者簡介：王霞，碩士，吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，講師，研究方向：植物分子生物學(xué)及天然產(chǎn)物分離。