王霞　劉曉丹　于曉明

摘要：采用RAPD技術對疊氮化鈉（NaN3）誘變的鳳尾雞冠花耐鹽突變體進行遺傳特性分析。結果表明：從98個隨機引物中篩選出12條適于鳳尾雞冠花的引物，共擴增出104條帶，對照和突變體擴增的總條帶數(shù)分別為49和55，其中9個引物出現(xiàn)差異條帶，3個引物未出現(xiàn)差異性條帶，鳳尾雞冠花耐鹽突變體與對照差異較大，變異率為31.73%，說明了NaN3能有效誘導鳳尾雞冠花的基因變異。

關鍵詞：鳳尾雞冠花；耐鹽突變體；RAPD鑒定

基金項目：吉林省教育廳“十二五”科學技術研究（吉教科合字〔2013〕第471號）

中圖分類號： S681.3 文獻標識碼： A DOI編號： 10.14025/j.cnki.jlny.2016.23.048

隨機擴增多態(tài)性DNA（Random amplifie dpolymorphic DNA，簡稱RAPD）是建立在PCR基礎之上的檢測DNA多態(tài)性的分子標記技術[1]，其利用PCR隨機合成多態(tài)性DNA片段，檢測被擴增區(qū)域內遺傳特性變化，該技術的實施不依賴于種屬的特異性和基因組的結構，無需制備探針，DNA用量少，分子識別率高，對環(huán)境污染小，成本低，已在分類學研究、品種鑒定、遺傳作圖等方面得到了廣泛的應用[2-3]。目前，運用RAPD技術已經成功的發(fā)現(xiàn)了眾多的突變型[4，5]。試驗對NaN3誘變的鳳尾雞冠花耐鹽突變體進行RAPD分析，進一步鑒定耐鹽突變體的遺傳穩(wěn)定性，為鳳尾雞冠花耐鹽新品系的誘變育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

材料：鳳尾雞冠花組培苗經NaN3誘變初篩獲得的耐鹽突變體。

主要試劑：隨機引物購自生工生物工程（上海）股份有限公司；2×CTAB提取緩沖液、Tris-HCl、0.5 moloL-1 EDTA（pH 8.0）、氯仿-異戊醇（24︰1）、TE溶液、3 moloL-1 NaAC、異丙醇、乙醇、DNA分子量標準等，所有試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取及檢測 參照趙曦[6]等的CTAB法，以未經處理的鳳尾雞冠花組培苗為對照，分別提取對照和初篩耐鹽突變體的基因組DNA，并采用紫外風光光度計法和瓊脂糖凝膠電泳法對所提基因組進行鑒定。

1.2.2鳳尾雞冠耐鹽突變體的RAPD檢測

1.2.2.1引物篩選及RAPD反應 從上海生工生物工程技術有限公司購進98個隨機引物（10個堿基），以對照和耐鹽突變體基因組DNA為模板，進行RAPD擴增，篩選出突變體與對照間具多態(tài)性的特異引物。

采用20μL的RAPD反應體系，分別為：20ngoμL-1模板DNA 2.0 μL，10pm隨機引物1.0 μL，2.5 mmooL-1MgCl2 2.0 μL，2.5 mmooL-1 dNTP 0.3 μL，Taq酶1μL，10×PCR Buffer 2.0 μL，其余由ddH2O補充。反應程序為： 94 ℃預變性5分鐘；94 ℃變性1分鐘，35℃退火45秒，72 ℃延伸1 分鐘，42 個循環(huán)；72 ℃再延伸10分鐘；4 ℃保溫。擴增產物用2.0%瓊脂糖凝膠進行電泳分離和分析。

1.2.2.2RAPD標記分析 通過篩選引物，檢測鳳尾雞冠花耐鹽突變體相對于對照在DNA分子水平上的變化，獲得突變體與對照間的多態(tài)性基因位點，以穩(wěn)定而清晰的條帶作為統(tǒng)計數(shù)據(jù)，對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計算變異率[7]。

2 結果與分析

2.1基因組DNA的純度和濃度檢測

采用CTAB法提取得到的DNA顏色呈無色透明狀，較粘稠，易溶于TE溶液。對照和突變體DNA樣品OD260/OD280都在1.80-1.92之間，OD260/OD230都在1.98～2.10之間，表明所提DNA樣品中蛋白和RNA污染較少，DNA純度較高，凝膠電泳結果如圖1所示，基因組條帶清晰、整齊、明亮，無彌散現(xiàn)象，點樣孔清晰，可進行下一步實驗。

2.2 引物的篩選及RAPD分析

用98個隨機引物對鳳尾雞冠花耐鹽突變體及其對照進行RAPD分析，結果發(fā)現(xiàn)有12條引物可擴增出清晰、明亮、多態(tài)性較好的條帶（表1），對鳳尾雞冠花對照和初篩獲得的耐鹽突變體進行了RAPD分析，發(fā)現(xiàn)12個隨機引物中，9個引物（S87，S88、S89、S97、S113、S424、S432，S435）出現(xiàn)差異條帶，3個引物（S98、S117、S440）未出現(xiàn)差異性條帶，其余引物均沒有擴增出條帶，圖2為多態(tài)性最好的3個隨機引物（S87、S432、S435）的擴增圖。12個可擴增引物共擴增出104條帶，其中對照和突變體分別擴增的總條帶數(shù)為49和55，擴增片段大小在100-2000bp之間。RAPD擴增結果中出現(xiàn)了新增或缺失條帶，與對照相比，突變體新增條帶11條，缺失條帶12條，鳳尾雞冠花耐鹽突變體與對照差異較大，變異率為31.73%，充分說明了NaN3結合組織培養(yǎng)技術能有效地誘導鳳尾雞冠花基因變異。

3 討論

RAPD是一種有效的檢測基因差異的技術，該技術已經應用于體外誘變育種引起的DNA多態(tài)性分析，鳳尾雞冠花組培苗經NaN3處理后，結合植物組織培養(yǎng)技術，在半致死劑量的NaCl脅迫下誘變耐鹽突變體，RAPD擴增結果差異顯著。與對照相比，擴增帶型出現(xiàn)了差異，這些差異帶型主要有擴增條帶的消失、增加以及擴增條帶的強弱變化。引起擴增帶消失或新增的原因肯是引物互補位點發(fā)生堿基突變，或互補位點間的DNA發(fā)生插入或缺失，或插入片段過大，這些都能導致差異片段的出現(xiàn)。引起擴增條帶強度變化的原因可能是多拷貝引物結合位點上某些堿基發(fā)生突變，使引物結合量減少，造成DNA量減少，或是新增片段與原有某片段的分子量相近，使譜帶加深，即反映出譜帶深淺的變化。這些差異充分說明NaN3誘變結合體細胞無性系變異能引起遺傳物質發(fā)生豐富的變異。

參考文獻

[1]白玉.DNA分子標記技術及其應用[J].安徽農業(yè)科學，2007，35（24）：7422-7424.

[2]董喜存，李文建，余麗霞，等.用隨機擴增多態(tài)性DNA技術對重離了輻照大麗花花色突變體的初步研究[J].輻射研究與輻射工藝學報，2007，25（01）：62-64.

[3]潘寧，趙琦，土振蓮，等.矮化早熟高粱突變體的RAPD分析[J].生物技術通報，2005（02）：29-31.

[4]馬升華，姚艷玲，錢麗華，等.組培獲得大花蕙蘭葉色突變體的RAPD分析[J].杭州農業(yè)科技，2007（03）：11-13.

[5]李明飛，謝彥周，劉錄祥，等.疊氮化鈉誘變普通小麥陜農33突變體庫的構建和初步評估[J].麥類作物學報，2015，35（01）：22-29.

[6]趙曦，王廣金，李鐵，等.大豆空間誘變突變體的RAPD分析[J].核農學報，2014，28（05）：772-776.

[7]崔廣榮，張子學，張從宇，等.文心蘭NaN3離體化學誘變及RAPD檢測[J].廣西植物，2011，31（06）：836-843.

作者簡介：王霞，碩士，吉林農業(yè)科技學院，講師，研究方向：植物分子生物學及天然產物分離。