張榮月，陳暄友，張 祎，姜成偉，黃逸康，李 強，丁 虹，潘一廷，劉 才

(1.北京石油化工學院 化學工程學院，北京 102617；2.中國科學院過程工程研究所生化工程國家重點實驗室，北京 100190)

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超大孔聚合物親和色譜層析介質(zhì)的制備及評價

張榮月1*，陳暄友1，張 祎1，姜成偉1，黃逸康1，李 強2，丁 虹1，潘一廷1，劉 才1

(1.北京石油化工學院 化學工程學院，北京 102617；2.中國科學院過程工程研究所生化工程國家重點實驗室，北京 100190)

探索了用席夫堿法在超大孔聚合物微球表面偶聯(lián)Protein A配基制備親和層析介質(zhì)的方法，以親水化后的聚丙烯酸酯類超大孔微球為基質(zhì)，考察了氧化劑濃度(H5IO6)對配基偶聯(lián)量的影響，以掃描電子顯微鏡表征微球表面形貌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其偶聯(lián)Protein A后微球仍能夠保持其大孔結(jié)構(gòu)。考察了該類親和介質(zhì)在不同操作流速(361～3 600 cm/h)下的動態(tài)載量，在3 600 cm/h操作流速下，人抗體載量與361 cm/h相比僅下降10%左右，表明該類介質(zhì)適合抗體大分子的快速傳質(zhì)，能夠滿足快速、高效、高通量分離純化的需求。

親和層析；偶聯(lián)方法；Protein A配基；超大孔層析介質(zhì)；抗體純化

親和層析是利用生物活性物質(zhì)之間的特異親和力，使目標產(chǎn)物得以分離純化的液相層析方法，可應用于任何兩種有特異性相互作用的生物大分子[1]。由于抗體與抗原作用具有高度的專一性，且該親和力極強，親和層析技術(shù)兼具高收率、高純度、能保持生物大分子天然狀態(tài)等優(yōu)點，因而被廣泛應用于生物大分子的分離純化[2-4]。以Protein A為親和配基是目前應用最為廣泛的親和介質(zhì)[5-8]，其在抗體純化實際生產(chǎn)中，一步純化即可得到高達95%純度。

介質(zhì)的基質(zhì)(固相載體)及其結(jié)構(gòu)對介質(zhì)的性能(機械強度、比表面積、傳質(zhì)性能等)具有重要影響?？贵w親和介質(zhì)的基質(zhì)主要有天然多糖類(瓊脂糖、葡聚糖等)、高分子聚合物(聚苯乙烯、聚丙烯酸等)和無機材料類(多孔玻璃和硅膠)[9-13]。其中瓊脂糖微球具有良好的生物相容性和易于衍生功能基團的優(yōu)點，而交聯(lián)技術(shù)的引入，部分克服了瓊脂糖微球機械強度低和孔徑小的不足，可將其耐壓指標提高到0.3 MPa的水平(如Mab Select Sure親和介質(zhì))，大大拓寬了其應用領(lǐng)域[11]，但其耐壓性能仍難以同時滿足高流速和大規(guī)模化層析的要求。此外，隨著操作流速的增加，孔徑在30～50 nm左右的多孔瓊脂糖微球介質(zhì)的動態(tài)載量急劇下降[14]，無法實現(xiàn)抗體的高通量制備。近年來，周煒清等采用“反膠團溶脹法”制備了超大孔聚合微球[15]，并對其表面采用葡聚糖進行親水化修飾[16]。該類微球具有百納米級的貫通孔，適用于生物大分子的快速傳質(zhì)，同時能夠耐受10 MPa操作壓力，從而為快速、高通量的分離純化提供了一條解決途徑。

本文基于親水化后的超大孔聚合物微球為基質(zhì)，通過席夫堿法在其表面偶聯(lián)Protein A配基制備親和層析介質(zhì)，從而實現(xiàn)了快速、高效分離純化抗體的目的。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)AKTA(美國通用公司，Purifier 10)配有紫外及電導檢測器，紫外-可見分光光度計，掃描電子顯微鏡(FEI Quanta400F，美國FEI公司)。供偶聯(lián)親和配基用的超大孔聚合物微球為實驗室自制(稱為Gigaporous-OH)，環(huán)氧氯丙烷、高碘酸、NaOH、氰基硼氫化鈉、硫酸(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)，Protein A(美國Sigma-Aldrich公司)。色譜用超純水為實驗室自制。

1.2 實驗方法

1.2.1 超大孔Protein A親和層析介質(zhì)的制備 偶聯(lián)配基實驗如圖1所示，共分為4步：①連接環(huán)氧基：量取10 mL自制超大孔PGMA-EDMA微球置于三角瓶中，并向其中加入2 mol/L NaOH水溶液50 mL，將盛有上述溶液的三角瓶放入搖床中振蕩10 min，然后加入10 mL環(huán)氧氯丙烷室溫下繼續(xù)振蕩5 h，反應完畢后，抽濾并用水洗滌至中性；②水解環(huán)氧基為二羥基：將微球轉(zhuǎn)移至50 mL 濃度為0.5 mol/L H2SO4水溶液中，升溫至50 ℃振蕩過夜反應，水解反應完畢后，抽濾并用去離子水洗滌至中性；③氧化二羥基為醛基：將微球轉(zhuǎn)移至50 mL 5%濃度的H5IO6乙酸溶液中，室溫下振蕩12 h，反應完畢后，抽濾并用水洗滌至中性；④將微球轉(zhuǎn)移至50 mL的10 mg/mL Protein A 磷酸緩沖液(pH 6.0)，同時加入氰基硼氫化鈉室溫下振蕩24 h，反應完畢后，將反應液離心處理，取上清液測定其在280 nm下的吸收值，計算微球偶聯(lián)配基量。

圖1 Protein A親和層析介質(zhì)的制備過程示意圖Fig.1 The process for preparation of Protein A affinity supports

1.2.2 介質(zhì)性能評價 介質(zhì)靜態(tài)載量與動態(tài)載量的測定，測試樣品為5 mg/mL Ig G。①靜態(tài)載量測定：在盛有8.0 mL上述蛋白溶液的10 mL離心管中加入1.0 mL自制親和介質(zhì)，室溫下垂直混合過夜，離心取上清液用紫外分光光度計測其在280 nm下吸收值，根據(jù)標準工作曲線計算介質(zhì)的靜態(tài)載量；②動態(tài)載量測定：將自制介質(zhì)裝填于4.6 mm×50 mm色譜柱中，用5 個柱體積(CV) 20 mmol/L pH 7.0 磷酸緩沖液平衡色譜柱后，將測試蛋白溶液用液相色譜泵頭直接上樣，當穿透曲線高度達到10%時停止進樣，用洗脫流動相(pH 3.0，0.1 mol/L甘氨酸/鹽酸溶液)進行洗脫。按上述操作分別考察361，1 800，3 600 cm/h流速下的載量，記錄10%穿透體積，計算動態(tài)載量值(Q10%):Q10%=C0V10%/V，其中C0為Ig G樣品濃度，V10%為10%流穿體積，V為介質(zhì)體積。

2 結(jié)果與討論

2.1 高碘酸濃度對親和配基偶聯(lián)量的影響

高碘酸濃度高低意味著氧化能力的強弱，其濃度越高則氧化能力越強。表1數(shù)據(jù)表明，高碘酸濃度在3%～7%范圍內(nèi)隨著H5IO6濃度的增加，微球表面醛基量呈先上升后下降的趨勢，當H5IO6濃度為5%時，醛基達到最大量為0.11 mmol/mL，其可能原因是隨著H5IO6(氧化劑)濃度的增加，氧化反應速率增快，故所得醛基量增加，但隨著濃度的進一步增加，過強的氧化能力將使醛基發(fā)生進一步的氧化反應，因此當H5IO6濃度高于5%時，醛基含量出現(xiàn)下降。而Protein A配基偶聯(lián)量與醛基量則呈正比關(guān)系，主要是醛基提供偶聯(lián)位點，故其增加，配基偶聯(lián)量也隨之變化。同時，考察了不同配基偶聯(lián)量下介質(zhì)的靜態(tài)載量(表1)，結(jié)果顯示，Ig G的靜態(tài)載量隨著配基偶聯(lián)的增加而升高，在最大配基偶聯(lián)量26 mg/mL時，其靜態(tài)載量達到最高值(31 mg/mL)。為了獲得較高的分離效率，選擇5%為最佳H5IO6使用濃度，以該條件下制備的親和介質(zhì)(Gigaporous-Protein A)作為后續(xù)的研究對象。

表1 不同H5IO6濃度下所得介質(zhì)的配基偶聯(lián)量及抗體載量

圖2 偶聯(lián)親和配基前(A1，A2)后(B1，B2)的微球表面形貌圖Fig.2 Morphology of microspheres before(A1，A2) and after(B1，B2) coupling Protein A

2.2 介質(zhì)表面形貌及通透性的考察

圖2為Gigaporous-OH偶聯(lián)親和配基前后的掃描電子顯微鏡對比圖，其中圖2A1和A2分別為偶聯(lián)前的Gigaporous-OH的表面形貌，可以看出微球表面有百納米級的大孔；圖2B1和B2為偶聯(lián)Protein A配基后的微球表面形貌圖，可以看出百納米級的超大孔依然存在，表明偶聯(lián)配基未阻塞微球的大孔結(jié)構(gòu)，這為該親和介質(zhì)保持良好的通透性奠定了基礎(chǔ)。為進一步表征該親和介質(zhì)的傳質(zhì)性能，考察了介質(zhì)在不同操作流速下的柱背壓，結(jié)果顯示，在流速1～8 mL/min范圍內(nèi)，偶聯(lián)前后的微球柱壓均隨操作流速的增加而呈線性增長，這表明微球有較好的機械強度，能在測試壓力范圍內(nèi)保持原有的剛性結(jié)構(gòu)未發(fā)生形變。同時對比偶聯(lián)配基前后兩種微球的變化曲線，可以發(fā)現(xiàn)偶聯(lián)配基后的微球在相同操作流速下柱壓均有所升高，表明Protein A大分子配基增加了介質(zhì)的傳質(zhì)阻力。

圖3 不同流速下對人血清中抗體的純化色譜圖(A)和純化后的Ig G凝膠電泳圖(B)Fig.3 Purification of Ig G from human serum on GigaporousProtein A at different flow rates(A) and the corresponding purify of Ig G by gel electrophoresis(B)

2.3 親和介質(zhì)動態(tài)載量及色譜性能評價

考察了不同操作流速(361～3600 cm/h)下，自制Gigaporous-Protein A的動態(tài)載量。結(jié)果顯示，隨著操作流速的升高，其數(shù)值稍有下降，如3 600 cm/h流速下的載量(24±0.2 mg/mL)相比低流速361 cm/h的載量(28±0.2 mg/mL)下降了14%，即流速升高10倍的情況下，載量僅下降10%左右，表明該類介質(zhì)對抗體大分子有著良好的傳質(zhì)特性。而同類型的瓊脂糖基質(zhì)的親和介質(zhì)在流速升高10倍時，其載量下降通常大于50%[14]。為進一步印證這一特性，考察了該介質(zhì)在不同流速下對人血清中抗體的純化效率，圖3為Gigaporous-Protein A在不同流速下的人血清純化譜圖(A)以及純化后的Ig G的凝膠電泳圖(B)。從凝膠電泳圖上看出，在高流速3 600 cm/h純化得到的Ig G純度與低流速下無明顯差別。綜合該親和介質(zhì)的以上表現(xiàn)，可以看出Gigaporous-Protein A適合快速、高通量的抗體分離純化。

由于親和配基的穩(wěn)定性也是親和層析介質(zhì)的又一重要參數(shù)，本實驗還考察了上樣-洗脫-再生50次循環(huán)后，在3 600 cm/h操作流速下，其Ig G動態(tài)載量。得到Ig G動態(tài)載量值為(23±0.3) mg/mL，表明親和配基Protein A在使用過程中能保持較好的活性與穩(wěn)定性。

3 結(jié) 論

本文以Protein A為親和配基，通過席夫堿法將其偶聯(lián)至超大孔聚丙烯酸微球表面制備親和層析介質(zhì)。在氧化劑高碘酸的考察濃度范圍(3%～7%)內(nèi)，親和配基的偶聯(lián)量隨其濃度的增加出現(xiàn)先上升后下降的變化規(guī)律，在5% H5IO6濃度下，可獲得最高偶聯(lián)量為(26±0.1) mg/mL。該親和介質(zhì)對抗體(人Ig G)的載量與親和配基的偶聯(lián)量呈正比關(guān)系。該自制Gigaporous-Protein A介質(zhì)的Ig G動態(tài)載量在高流速下(考察流速范圍361～3 600 cm/h)無明顯變化，同時在高流速下從人血清中可得到高純度抗體，表明該介質(zhì)在高通量分離純化抗體方面有較好的應用前景。

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Preparation and Characterization of Gigaporous Polymer Affinity Chromatographic Supports

ZHANG Rong-yue1*，CHEN Xuan-you1，ZHANG Yi1，JIANG Cheng-wei1，HUANG Yi-kang1，LI Qiang2，DING Hong1，PAN Yi-ting1，LIU Cai1

(1.Department of Chemical Engineering，Beijing Institute of Petro-chemical Technology，Beijing 102617，China；2.National Key Lab of Biochemical Engineering，Institute of Process Engineering，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100190，China)

A method was explored for the preparation of affinity chromatographic support， based on the hydrophilic gigaporous polymer microspheres using Protein A as affinity ligands.The effect of H5IO6on amount of Protein A was evaluated.The morphology of the microspheres was observed by scanning electronic microscopy.The result showed that the throughput pores were maintained in the affinity media.At different flow rates(361-3 600 cm/h)，the dynamic capacity of human Ig G on the affinity supports were determined,and the result indicated the capacity at 3 600 cm/h decreased about 10% in comparison with that at 361 cm/h.The above results indicated that this affinity support could meet the requirement for rapid and high-throughput separation of proteins.

affinity chromatography; coupling method;Protein A ligand; gigaporous chromatographic support; purification of antibody

2016-05-03；

2016-06-29

北京市自然科學基金(2162013)；國家自然科學基金(51103158)；北京石油化工學院優(yōu)秀人才培育計劃項目(080318620081/037)；北京高等學校高水平人才交叉培養(yǎng)“實培計劃”項目(201507,201506)；2016大學生URT項目(16032082001/009)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.12.023

O657.7；S852.43

A

1004-4957(2016)12-1643-04

*通訊作者：張榮月，博士，副教授，研究方向：聚合物層析介質(zhì)的制備及在生化分離純化中的應用研究，Tel:010-81292132，E-mail:ryzhang@iccas.ac.cn