王 波，周 圍*，馮 靜，杜明遠(yuǎn)，劉倩倩

(1.甘肅出入境檢驗(yàn)檢疫局 綜合技術(shù)中心，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，甘肅 蘭州 730000)

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溶劑誘導(dǎo)相變萃取-UPC2快速測(cè)定中成藥及原料藥中的香豆素

王 波1,2，周 圍1,2*，馮 靜1，杜明遠(yuǎn)1，劉倩倩2

(1.甘肅出入境檢驗(yàn)檢疫局 綜合技術(shù)中心，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，甘肅 蘭州 730000)

使用溶劑誘導(dǎo)相變萃取對(duì)中成藥及原料藥進(jìn)行預(yù)處理，建立了中成藥中香豆素的超高效合相色譜(UPC2)檢測(cè)方法。樣品經(jīng)粉碎(60目)、乙腈-水(7∶3 ，體積比)提取，二氯甲烷誘導(dǎo)分相后，使用UPC2對(duì)樣品中的香豆素進(jìn)行檢測(cè)。以3倍信噪比(S/N)確定香豆素的檢出限為0.1 mg/L；線性范圍為0.3～10.0 mg/L；加標(biāo)回收率為89.8%～102.3%；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.31%～1.0%。同時(shí)與UPLC進(jìn)行比較，結(jié)果表明該方法的選擇性高，檢測(cè)成本低，且分析時(shí)間僅為UPLC的1/4。該研究為高通量檢測(cè)香豆素提供了一種全新的前處理及檢測(cè)方法。

香豆素；溶劑誘導(dǎo)分相萃取；超高效合相色譜；超高效液相色譜；檢測(cè)

香豆素是廣泛分布于植物界中的次生代謝物質(zhì)，常與生源密切的桂皮酸、黃酮類、木脂素等伴生，尤其是傘形科、蕓香科、菊科、豆科、蘭科和茄科等植物[1-2]。根據(jù)環(huán)上取代基及其位置的不同，常將香豆素分為簡(jiǎn)單香豆素、呋喃香豆素、吡喃香豆素和其他香豆素等。研究表明，香豆素及其衍生物除了具有抗癌、抗炎及抗凝血等生物學(xué)活性外，20世紀(jì)八九十年代，香豆素被公認(rèn)為可能具有遺傳毒性的致癌物質(zhì)，因此歐盟規(guī)定香豆素在食品及藥品中的含量不得高于2.0 mg/kg。2004年，新的研究證明，香豆素并不是遺傳毒性的致癌物質(zhì)，但香豆素的一小部分成分具有肝毒性，在此基礎(chǔ)上，歐盟食品安全管理局公布了香豆素的日服用限量為0～0.1 mg/kg(按體重計(jì)算)[3-6]。為確保以肉桂及桂枝為中藥原料制成的中成藥順利出口及合理制定每日的口服劑量，對(duì)香豆素的檢測(cè)顯得尤為重要。

香豆素的測(cè)定方法一般有液相色譜法[1,7-10]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11-12]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[13-14]、紫外分光光度法[15]等，但紫外分光光度法測(cè)定香豆素的方法選擇性較差，易受其它成分的干擾，所需試劑較多、操作繁瑣。而對(duì)于液相色譜及串聯(lián)質(zhì)譜，除了實(shí)驗(yàn)成本較高外，有機(jī)溶劑的使用還會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染。樣品預(yù)處理是中成藥及其原料等復(fù)雜基質(zhì)中分離檢測(cè)目標(biāo)物的重要環(huán)節(jié)。溶劑誘導(dǎo)相變萃取法已成功用于血漿樣品中痕量藥物的測(cè)定[16]。該方法與傳統(tǒng)液-液萃取法相比，具有操作簡(jiǎn)單快速等優(yōu)點(diǎn)，且新形成的有機(jī)相與常用的反相色譜流動(dòng)相兼容，可直接進(jìn)樣分析，無需在進(jìn)樣前進(jìn)行溶劑轉(zhuǎn)化。通過文獻(xiàn)查閱，該樣品處理方法尚未見用于中成藥中香豆素測(cè)定的報(bào)道。

超臨界流體(Supercritical fluid，SCF)是指物質(zhì)高于其臨界溫度和臨界壓力時(shí)的一種物態(tài)，它既不是氣體，也不是液體，但兼有氣體的低粘度，液體的高密度，以及介于氣液體之間的擴(kuò)散系數(shù)等特征。超高效合相色譜(Ultraperformance convergence chromatography，UPC2)是以超臨界流體為流動(dòng)相，依靠流動(dòng)相的溶劑化能力進(jìn)行分離分析的一種分析技術(shù)；其在傳統(tǒng)超臨界流體色譜(Supercritical fluid chromatography，SFC)的原理上，應(yīng)用超高效液相色譜(UPLC)的硬件技術(shù)，并使用更小的色譜柱填料(≤ 2 μm)達(dá)到快速、高效的分離[17-19]。SFC和UPLC的結(jié)合，克服了傳統(tǒng)SFC在實(shí)驗(yàn)過程中精密度差、重現(xiàn)性低的缺點(diǎn)，在整個(gè)操作過程中有機(jī)溶劑使用量少，是一種綠色的分離技術(shù)。目前采用UPC2對(duì)香豆素進(jìn)行快速檢測(cè)的方法尚未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)通過建立一種新的中成藥前處理方法，即溶劑誘導(dǎo)相變萃取，利用分相后的高度選擇性對(duì)復(fù)雜基質(zhì)中的香豆素進(jìn)行檢測(cè)；文中還系統(tǒng)考察了UPC2對(duì)香豆素分離的影響因素，并與UPLC進(jìn)行比較，相關(guān)研究為中成藥及其原料藥中香豆素的提取、分離及檢測(cè)提供新的思路。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

超高效合相色譜儀(美國(guó)Waters公司)配二極管陣列檢測(cè)器，Waters Empower 3數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；移液槍(10～100 μL，100～1 000 μL，美國(guó)Thermo Electron公司)；分析天平；50 mL聚乙烯管。

香豆素(Dr.Ehrenstorfer公司，純度99%)；CO2(中國(guó)匯能公司，純度99.997%)；乙腈、甲醇(德國(guó)Merck公司)；蒸餾水(屈臣氏)；其余試劑均為分析純。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)貯備液：準(zhǔn)確稱取10.00 mg香豆素，用乙腈-水(7∶3)定容至100 mL容量瓶中，配制成100 mg/L的香豆素標(biāo)準(zhǔn)溶液。4 ℃下冷藏待用。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確移取5.0，2.5，625，313，156，52 μL標(biāo)準(zhǔn)貯備液于50 mL容量瓶中，乙腈-水(體積比7∶3)準(zhǔn)確定容，分別配制成10.00，5.00，1.25，0.62，0.31，0.10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液。4 ℃下冷藏待用。

1.3 色譜條件

色譜柱：UPC2CSH Fluoro-Phenyl(2.1 mm×150 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相A為CO2；B為含0.2%甲酸的甲醇溶液；流速0.5 mL/min，進(jìn)樣體積1.0 μL，柱溫50 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm，動(dòng)態(tài)背壓(ABPR)為1 900 psi。梯度洗脫：0～3.0 min，98%～90% A；3.0～4.5 min，90%～80% A；4.5～5.5 min，80%～70% A；5.5～6.0 min，70%～98% A；6.0～8.0 min，98%A平衡2 min。

1.4 樣品來源

不同種類的中成藥(T1～T5)及原料藥均由某制藥廠提供，所有樣品粉碎后待用。

1.5 樣品預(yù)處理

稱取0.50 g(精確至0.01 g)粉碎后的樣品于50 mL聚乙烯管中，準(zhǔn)確添加35 mL乙腈-水(7∶3)提取液，渦旋2.0 min，超聲提取15 min后準(zhǔn)確加入5.0 mL二氯甲烷，渦旋2.0 min，4 ℃條件下13 000 r/min冷凍離心10 min。離心完畢后，溶液分層，上層為乙腈層，下層為水層，取乙腈層溶液1.5 mL，過0.22 μm有機(jī)相膜，待測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑及提取條件的選擇 為了完全提取中成藥及原料藥中的香豆素，本實(shí)驗(yàn)稱取同一中成藥樣品適量，料液比為1∶50(g/mL)，分別加入50%，60%，70%，80%及90%的乙腈水溶液進(jìn)行超聲提取。結(jié)果表明，當(dāng)使用70%乙腈-水溶液對(duì)樣品進(jìn)行超聲提取時(shí)，待測(cè)樣品中香豆素的濃度最高，為376.17 mg/L。固定提取溶劑不變，考察了超聲提取時(shí)間(5，15，25，35 min)和提取次數(shù)(1，2，3，4次)以及料液比(1∶30，1∶50，1∶70，1∶90)對(duì)香豆素提取率的影響。結(jié)果表明，在最佳提取條件下(即提取溶劑為70%乙腈水溶液，料液比為1∶70，超聲15 min提取1次)，樣品中香豆素的提取效率最高，提取濃度達(dá)到414.85 mg/L。

2.1.2 誘導(dǎo)分相劑的選擇 有文獻(xiàn)報(bào)道，幾乎所有與乙腈互溶的疏水性溶劑都能作為誘導(dǎo)分相劑誘導(dǎo)乙腈-水體系分層[16]，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇具有代表性的不含氧誘導(dǎo)劑如二氯甲烷、無機(jī)鹽如氯化鈉及含氧誘導(dǎo)劑如正辛醇對(duì)香豆素標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.25 mg/L)進(jìn)行誘導(dǎo)分相萃取，比較了水層和乙腈層中香豆素的含量，并通過計(jì)算回收率確定香豆素的轉(zhuǎn)移率。結(jié)果顯示，采用正辛醇作為誘導(dǎo)分相劑進(jìn)行提取時(shí)，目標(biāo)物的回收率較低，僅為74.2%，使用二氯甲烷和氯化鈉進(jìn)行誘導(dǎo)分相，香豆素的回收率均在95%以上，表明香豆素已高選擇性地轉(zhuǎn)移至乙腈層中。此外，使用氯化鈉作為誘導(dǎo)分相劑時(shí)，水層高濃度的鹽不利于UPC2對(duì)水層化合物的分析。故實(shí)驗(yàn)選擇二氯甲烷作為誘導(dǎo)分相劑。

2.1.3 色譜柱的選擇 由于中成藥及原料藥中的成分極其復(fù)雜，色譜柱對(duì)目標(biāo)物的保留、峰形及選擇性起著至關(guān)重要的作用。樣品按“1.5”處理后，使用3種不同的色譜柱BEH(3.0 mm×100 mm，1.7 μm)，BEH 2-EP(2.1 mm×150 mm，1.7 μm)及CSH Fluoro-Phenyl(2.1 mm×150 mm，1.7 μm)對(duì)樣品乙腈層中的香豆素進(jìn)行分離檢測(cè)。結(jié)果表明，當(dāng)使用BEH及BEH 2-EP色譜柱時(shí)，受雜質(zhì)的干擾，嚴(yán)重影響香豆素定量的準(zhǔn)確性，采用CSH Fluoro-Phenyl色譜柱時(shí)，乙腈層中的香豆素?zé)o任何雜質(zhì)的干擾。故本實(shí)驗(yàn)選擇的色譜柱為CSH Fluoro-Phenyl柱。

2.1.4 流速的選擇 使用超臨界CO2作為流動(dòng)相時(shí)，相比傳統(tǒng)的正相及反相色譜的流動(dòng)相，它具有低粘度和高擴(kuò)散系數(shù)，以及較小的粘度，從而減小了分離過程中的阻力。在相同的色譜柱條件下，可使用較高的流速?？紤]到流速主要對(duì)分析時(shí)間和系統(tǒng)壓力產(chǎn)生影響，本實(shí)驗(yàn)在0.3，0.5，0.8，1.0 mL/min范圍內(nèi)進(jìn)行考察，在保證理想的分析時(shí)間和系統(tǒng)壓力的前提下，最終選擇0.5 mL/min為最佳流速。

2.1.5 助溶劑的選擇 以CO2超臨界流體為流動(dòng)相時(shí)，通常對(duì)極性化合物的洗脫能力較弱，可通過加入甲醇、乙醇、乙腈、異丙醇及揮發(fā)性酸或鹽作為助溶劑來增加對(duì)極性化合物的洗脫能力，以適應(yīng)對(duì)不同極性目標(biāo)化合物的分離，并得到較好的峰形及理想的保留時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇、乙腈兩種最為常見的助溶劑對(duì)香豆素的分離效果。結(jié)果顯示，使用乙腈作為助溶劑時(shí)，峰形拖尾嚴(yán)重，且保留時(shí)間達(dá)10 min ，使用甲醇作為助溶劑時(shí)，香豆素的保留時(shí)間為2.69 min，但香豆素仍有拖尾，而通過在甲醇加入0.2%甲酸，可得到較好的峰形，保留時(shí)間稍有提前(2.47 min)，故選擇含0.2%甲酸的甲醇溶液作為助溶劑。

2.1.6 動(dòng)態(tài)背壓(ABPR)的選擇 超臨界流體在不同壓力下有不同的溶解能力，其溶解能力隨壓力的增加而增加，故壓力是影響分離過程的重要因素之一。動(dòng)態(tài)背壓(ABPR)可在整個(gè)運(yùn)行過程中維持CO2的超臨界流體狀態(tài)，實(shí)驗(yàn)考察了ABPR在1 600，1 700，1 900，2 000 psi條件下對(duì)樣品分離的影響。結(jié)果表明：隨著背壓升高，系統(tǒng)壓力隨之升高，系統(tǒng)超臨界流體溶解度的增加使得香豆素的保留時(shí)間減少。當(dāng)背壓為1 900 psi時(shí)，香豆素與雜質(zhì)得到很好分離，且保留時(shí)間短、色譜峰形對(duì)稱，故選擇背壓為1 900 psi。

2.1.7 色譜柱溫度的選擇 在超臨界流體狀態(tài)下，SCF的溶解能力隨溫度的增加而降低。實(shí)驗(yàn)考察了30，40，50，60 ℃的條件下對(duì)目標(biāo)物分離的影響。結(jié)果表明，隨著溫度的升高，香豆素的保留時(shí)間逐漸增加，在此前提下，綜合考慮樣品中雜質(zhì)與香豆素的分離程度以及每個(gè)樣品的分析時(shí)間，本實(shí)驗(yàn)選擇50 ℃為最佳分離溫度。

2.2 UPC2的方法學(xué)考察

2.2.1 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取編號(hào)為T4的中成藥樣品0.50 g，按“1.5”方法處理樣品，在“1.3”色譜條件下，分別在0，4，12，24，48 h進(jìn)樣6次，T4樣品中香豆素的峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0%，0.38%，0.44%，0.61%，0.69%和0.66%。表明樣品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.2 專屬性實(shí)驗(yàn) 取標(biāo)準(zhǔn)溶液、陰性供試品溶液以及中成藥樣品的乙腈層溶液，按“1.3”色譜條件進(jìn)樣分析并比較，結(jié)果顯示，香豆素的出峰位置無雜質(zhì)干擾，表明該方法的專屬性較好。

2.2.3 線性范圍及定量下限 按“1.2”分別配制成10.00，5.00，1.25，0.62，0.30，0.10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液。按照“1.3”色譜條件，每個(gè)濃度進(jìn)樣1.0 μL，以濃度(x,mg/L)為橫坐標(biāo)，峰面積(y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明，香豆素在0.3～10.0 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程為y=153.8x+8.74；根據(jù)信噪比(S/N)為3和10確定香豆素的檢出限和定量下限分別為0.1 mg/L和0.3 mg/L。

2.2.4 精密度實(shí)驗(yàn) 按照“1.3”所述色譜條件，對(duì)添加高、中、低3個(gè)不同濃度(10.00，1.25，0.30 mg/L)香豆素標(biāo)準(zhǔn)溶液的中成藥樣品重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得日內(nèi)精密度的RSD為0.31%～0.63%；日間精密度的RSD為0.49%～0.92%，可以看出該方法對(duì)檢測(cè)中成藥及原料藥中的香豆素具有較好的日間和日內(nèi)精密度，能滿足對(duì)香豆素的檢測(cè)要求。

2.2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取同一中成藥樣品，按“1.5”方法進(jìn)行樣品處理，“1.3”色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算香豆素的含量及RSD。6份同一中成藥樣品中香豆素含量的RSD為1.0%，表明方法的重復(fù)性較好。

2.2.6 加標(biāo)回收率 準(zhǔn)確稱取同一中成藥樣品，分別加入高、中、低3個(gè)不同濃度(10.00，1.25，0.30 mg/L)的香豆素標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化條件下進(jìn)樣分析。結(jié)果顯示，3個(gè)不同濃度的香豆素加標(biāo)回收率為89.8%～102.3%，表明本方法準(zhǔn)確可靠。

2.3 與UPLC方法的比較

按照“1.5”對(duì)樣品處理后，采用相同色譜柱CSH Fluoro-Phenyl(2.1 mm×150 mm，1.7 μm)，使用UPLC儀進(jìn)樣2.0 μL進(jìn)行分析，流動(dòng)相為0.2%甲酸甲醇和水溶液，梯度洗脫，278 nm下檢測(cè)。另取相同的供試品溶液按“1.3”色譜條件分析，分別得到香豆素標(biāo)準(zhǔn)溶液的UPC2和UPLC色譜圖(見圖1)。由圖可以看出，UPC2與UPLC相比，因?yàn)榱鲃?dòng)相性質(zhì)及保留機(jī)理的不同，香豆素標(biāo)準(zhǔn)溶液在UPC2的出峰時(shí)間(2.15 min)較UPLC的出峰時(shí)間(8.52 min)縮短了近4倍。由此可見，本實(shí)驗(yàn)建立的UPC2快速檢測(cè)中成藥中香豆素的方法與傳統(tǒng)液相色譜方法相比，既節(jié)省溶劑，降低檢測(cè)成本，又能進(jìn)行快速分離，實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)。

2.4 實(shí)際樣品的測(cè)定

取5批中成藥及2批原料藥樣品經(jīng)粉碎后(60目)，準(zhǔn)確稱取0.50 g，按“1.5”進(jìn)行樣品處理，在“1.3”色譜條件下進(jìn)樣分析，圖2為樣品T4總提液、乙腈層以及水層的色譜圖；每個(gè)樣品重復(fù)3次，通過光譜圖確定峰純度，外標(biāo)法計(jì)算香豆素的含量，樣品中香豆素的含量結(jié)果見表1。由表1可知，除樣品T2未檢出香豆素外，其余中成藥均檢出香豆素，且T4樣品的濃度最高，達(dá)到414.58 mg/L；對(duì)于原料藥的分析結(jié)果顯示，肉桂中香豆素的濃度為2 144.29 mg/L，約為桂枝的4倍。此外，通過UPC2和UPLC對(duì)樣品檢測(cè)結(jié)果的比較，表明UPC2的檢測(cè)結(jié)果除了與UPLC具有相當(dāng)?shù)臏?zhǔn)確度外，檢測(cè)時(shí)間僅為UPLC的1/4，故使用UPC2可對(duì)香豆素進(jìn)行快速準(zhǔn)確、高通量的檢測(cè)。

SampleDetectionresultsofUPC2(mg/L，n=3)DetectionresultsofUPLC(mg/L，n=3)Rawmaterials(原料藥)CassiaTwig(桂枝)6334662875Cinnamon(桂皮)241129249801Chinesetraditionalmedicine(中成藥)T138573982T2-?-T333783503T44145841759T541314364

*no detected

3 結(jié) 論

本文采用二氯甲烷作為誘導(dǎo)劑對(duì)樣品中的香豆素進(jìn)行萃取，香豆素可高選擇性地存在于乙腈層中，并且在萃取過程中無需特殊裝置，操作簡(jiǎn)便，是一種穩(wěn)定可靠的分析方法。同時(shí)，首次采用UPC2建立了檢測(cè)中成藥及原料藥中香豆素的方法，方法學(xué)考察結(jié)果顯示，該方法的靈敏度高，重現(xiàn)性、穩(wěn)定性良好，檢測(cè)時(shí)間短，為中藥復(fù)雜體系的色譜分析提供了新的方向。通過與UPLC比較，分析時(shí)間僅為UPLC的1/4，可節(jié)約大量的分析時(shí)間，提高檢測(cè)效率。采用所建立的最佳色譜方法對(duì)5批中成藥及2批原料藥材進(jìn)行了測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示肉桂和桂枝中香豆素的含量較高，為確保以肉桂及桂枝為中藥原料制成的中成藥順利出口及合理制定每日口服劑量提供了數(shù)據(jù)支持。

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Rapid Determination of Coumarin in Chinese Traditional Patent Medicine and Raw Materials by UPC2and Solvent Induced Extraction

WANG Bo1,2，ZHOU Wei1,2*，F(xiàn)ENG Jing1，DU Ming-yuan1，LIU Qian-qian2

(1.Central Laboratory of Technical Center of Gansu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Lanzhou 730000，China；2.Gansu Province Inspection and Quarantine Science and Technology Research Institute，Lanzhou 730000，China)

A method of solvent induced phase extraction and ultra performance convergence chromatography(UPC2) was established for the determination of coumarin in Chinese traditional patent medicine and raw materials.Samples were crushed(60 mesh)，and extracted with acetonitrile-water(7∶3,by volume) using dichloromethane as induced separation solvent.The targeted compound was detected by UPC2method.The limit of detection(LOD,S/N=3) for coumarin was 0.1 mg/L.The linear range of coumarin was in the range of 0.3-10.0 mg/L.The spiked recoveries ranged from 89.8% to 102.3% and the relative standard deviations were between 0.31% and 1.0%.Compared with UPLC method，the method showed the advantages of high selectivity and low detection cost，and its analysis time is only 1/4 of the UPLC.This study provided a new pretreatment and detection method for the high throughput detection of the coumarin.

coumarin;solvent induced extraction；ultra performance convergence chromatography(UPC2)；ultra performance liquid chromatography(UPLC)；detection

2016-05-18；

2016-06-29

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.12.019

O657.72；TQ460.72

A

1004-4957(2016)12-1622-06

*通訊作者：周 圍，博士，研究員，研究方向：色譜分析、食品藥品安全及檢測(cè)，Tel:0931-8513950，E-mail:zhouwei845@163.com