蔣 濤，李 云，趙曉靜，肖賽金，楊水平，朱志強(qiáng)

(1.東華理工大學(xué) 江西省質(zhì)譜科學(xué)與儀器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330013；2.上饒師范學(xué)院 化學(xué)與化工學(xué)院，江西 上饒 334001)

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研究簡報

微波等離子體炬質(zhì)譜法快速測定大米中黃曲霉毒素B1的研究

蔣 濤1，李 云1，趙曉靜1，肖賽金1，楊水平1，朱志強(qiáng)2*

(1.東華理工大學(xué) 江西省質(zhì)譜科學(xué)與儀器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330013；2.上饒師范學(xué)院 化學(xué)與化工學(xué)院，江西 上饒 334001)

以微波等離子體炬(MPT)為離子化源，在無需樣品預(yù)處理的條件下，建立了快速測定大米中黃曲霉毒素B1(AFB1)的直接質(zhì)譜分析方法。在正離子檢測模式下，根據(jù)黃曲霉毒素B1的特征質(zhì)譜離子(m/z285)進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明，黃曲霉毒素B1在0.5～20 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.999 4，方法檢出限為0.12 μg/kg。直接檢測復(fù)雜基體大米中的黃曲霉毒素B1，平均回收率為95.8%～107.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=9)為2.2%～10.1%；將該方法與主成分分析(PCA)相結(jié)合，能夠準(zhǔn)確地鑒別大米是否霉變。該方法分析速度快、靈敏度高，適合霉變大米的快速、高通量篩查，有望應(yīng)用于糧油食品、動植物食品質(zhì)量監(jiān)控等領(lǐng)域。

微波等離子體炬(MPT)；質(zhì)譜；黃曲霉毒素B1(AFB1)；大米

大米是人類最重要的主食之一，其質(zhì)量的好壞直接關(guān)系到食用者的身體健康。近年來，毒大米事件引起人們對大米質(zhì)量的關(guān)注。毒大米主要包括米中重金屬超標(biāo)、米表面含有農(nóng)藥或大米發(fā)生霉變等，其中霉變大米含有劇毒物質(zhì)黃曲霉毒素(Aflatoxins)。黃曲霉毒素為分子真菌毒素，主要包括黃曲霉毒素B1,B2,G1,G2,M1,M2，而霉變的糧食中以黃曲霉毒素B1的毒性最大，量最多[1]，致癌性最強(qiáng)[2]。AFB1屬于肝臟毒素，誘發(fā)肝癌的能力比二甲基亞硝胺大75倍[1]，國際癌癥研究機(jī)構(gòu)已將其列為人類致癌物[3]。根據(jù)中國食品中真菌毒素的限量規(guī)定，大米中黃曲霉毒素的含量不得超過10 μg/L[4]。因此很有必要對大米中黃曲霉毒素B1進(jìn)行嚴(yán)格的監(jiān)測。

目前國內(nèi)外檢測黃曲霉毒素B1的方法主要有薄層色譜法[5]、毛細(xì)管電泳[6]、免疫化學(xué)分析方法[7-8]和色譜-質(zhì)譜法[9-11]等，這些方法需復(fù)雜的預(yù)處理過程。大氣常壓質(zhì)譜技術(shù)是近年來發(fā)展的可快速分析復(fù)雜基體樣品的質(zhì)譜方法，如電噴霧解吸電離(DESI)[12]、實(shí)時在線分析(DART)[13]、電噴霧萃取電離(EESI)[14]、表面解吸常壓化學(xué)電離(DAPCI)[15]以及低溫等離子體探針(LTP)[16]等，這些方法可在無需樣品預(yù)處理或少量樣品預(yù)處理的條件下高通量、高靈敏地分析原生態(tài)的樣品，但很少直接用于大米中黃曲霉毒素的分析檢測。

圖1 MPT-MS實(shí)驗(yàn)裝置示意圖Fig.1 Experimental schematic of MPT-MS

微波等離子體炬(MPT)是由金欽漢教授課題組發(fā)明和發(fā)展的一種新興等離子產(chǎn)生裝置。本文將該技術(shù)應(yīng)用于質(zhì)譜離子化源，發(fā)掘其在質(zhì)譜中的應(yīng)用潛力。如圖1所示，MPT炬管是三管同軸的結(jié)構(gòu)。從微波能傳輸?shù)慕嵌瓤?，可將這種炬管看成是一端開放的同軸線；在其開放的一端向外,電場分布和流體動力學(xué)均有利于形成一個具有中央通道的等離子體[17]。這種結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)類似于ICP離子源，但其三管均為金屬制成[18]。而且當(dāng)MPT以微波作為能量來源時，與傳統(tǒng)的微波等離子體(MWP)類似，易形成常壓下Ar,N2甚至空氣的等離子體[19]。故而，MPT離子源兼顧了此二者的優(yōu)點(diǎn)，不但能克服樣品耐受力不足的缺陷，而且具有結(jié)構(gòu)簡單、操作簡便、功耗低和普適性強(qiáng)等特點(diǎn)。近年來，MPT離子源不僅能檢測元素周期表上大多數(shù)元素，而且對有機(jī)化合物能進(jìn)行良好的解析，因而廣泛地應(yīng)用于食品安全、石油化工、臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域[20-21]。以MPT為離子源，與多種質(zhì)譜儀器(LTQ，TOF)相結(jié)合，采用外部直接解析的模式，已成功地檢測一系列有機(jī)化合物[22-23]。本文通過采用MPT-MS實(shí)驗(yàn)平臺對大米中黃曲霉毒素B1進(jìn)行檢測，并利用黃曲霉毒素B1的碎片離子m/z285作定量分析，可快速測定大米中黃曲霉毒素B1的含量，且在半定量意義下數(shù)據(jù)可靠。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與裝置

LTQ-XL型線性離子阱質(zhì)譜儀(美國Finnigan公司，配備有Xcalibur數(shù)據(jù)處理系統(tǒng))；微波等離子體炬管，WGY-20微波功率源(均由吉林大學(xué)于愛民教授課題組提供)；超純水儀(美國賽默飛世爾科技公司)。

1.2 材料與試劑

黃花黏米、奉新發(fā)米、泰太香油黏米、皇陽貢米購于南昌市旺中旺超市；龍南大米購于江西贛州龍南縣；柳河大米購于吉林柳河縣。

黃曲霉毒素B1(10 mg，上海百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司)；甲醇(色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；用甲醇-去離子水(體積比1∶1)的混合溶液，將10 mg黃曲霉毒素B1 溶解于100 mL容量瓶中，制得100 mg/L儲備液。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

LTQ-MS為正離子檢測模式，離子傳輸管溫度150 ℃，質(zhì)譜掃描范圍為m/z100～500，其它參數(shù)LTQ-MS自動優(yōu)化；微波等離子體炬(MPT)離子源；MPT的載氣(Ar)流量400 mL/min，維持氣(Ar)流量600 mL/min，微波功率為50 W(其可調(diào)范圍30～200 W)。固定炬焰離質(zhì)譜口距(d)約12 mm，炬焰離液面高3 mm，炬管與水平面成30°。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

微波等離子體炬(MPT)直接分析液體樣品的原理如圖1所示[21]，采用外部進(jìn)樣的方式，與以往采用的中心管道進(jìn)樣方式有所不同[24-26]。中心管道進(jìn)樣時，需要輔以去溶裝置，樣品形成干燥的氣溶膠后從MPT中心管道引入等離子體，以使充分吸收微波能量，形成的離子導(dǎo)入質(zhì)譜儀中檢測。這種方式適合分析水樣中的金屬元素，但不適合分析有機(jī)樣品，因?yàn)橛袡C(jī)分子在等離子體中易分解，得不到樣品的原始信息。然而，外部進(jìn)樣可通過固定炬焰與有機(jī)樣品間的距離，MPT炬管與水平面固定成30°角架置，炬焰尖端離質(zhì)譜口約12 mm，炬焰略高于溶液液面3 mm。通過MPT炬焰外層對裝在表面皿中的樣品萃取液進(jìn)行解析，能得到有機(jī)樣品中黃曲霉毒素B1的指紋譜圖，而且經(jīng)該方式產(chǎn)生的待測物離子可由質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測。

配制一系列濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品，通過表面燒蝕進(jìn)樣，獲得特征質(zhì)譜圖。以AFB1的二級質(zhì)譜信號(m/z285)作為定量依據(jù)繪制工作曲線，再對大米樣品進(jìn)行檢測。將所得質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)出至Excel中進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 MPT離子化技術(shù)

MPT源是一種可用于現(xiàn)場直接質(zhì)譜分析的新型離子化技術(shù)，對中性復(fù)雜基質(zhì)樣品能進(jìn)行較好的解析。為避免樣品污染或質(zhì)譜儀損傷，采用甲醇-去離子水(1∶1)[27]對大米進(jìn)行萃取，再通過MPT表面燒蝕大米萃取液，形成的待測離子進(jìn)入質(zhì)譜儀器進(jìn)行檢測。該方法具有分析檢測復(fù)雜樣品的能力，降低了對樣品預(yù)處理的要求；串聯(lián)質(zhì)譜分析結(jié)果給出了較豐富的離子結(jié)構(gòu)信息。與以往內(nèi)管進(jìn)樣分析液態(tài)樣品的方式不同，MPT第一次以表面解析的方式分析有機(jī)液體樣品，且對有機(jī)液體樣品能進(jìn)行較好的解吸，獲得清晰的樣品指紋譜圖。由于MPT裝置操作簡單，易集成和小型化，通過與小型質(zhì)譜儀器的耦合能運(yùn)用于復(fù)雜基質(zhì)樣品的現(xiàn)場分析。

2.2 黃曲霉毒素B1的一級質(zhì)譜與二級質(zhì)譜分析

MPT是一種軟電離技術(shù)，一般經(jīng)質(zhì)子化、去質(zhì)子化或與其它基團(tuán)結(jié)合后形成待測物離子。通過MPT對溶液表面燒蝕發(fā)現(xiàn)，正離子模式下得到黃曲霉毒素B1的信號。從分子結(jié)構(gòu)上看，黃曲霉毒素B1易形成質(zhì)子化的分子離子[M+H]+(m/z313)(如圖2A)，這是由于黃曲霉毒素B1中氧原子電負(fù)性比碳原子大，質(zhì)子易與其中的氧原子結(jié)合得到m/z313離子峰，再對母離子m/z313進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析。從串聯(lián)質(zhì)譜(圖2B)可以看出，大部分母離子(m/z313)失去中性碎片CO或C2H4得到m/z285，而少部分母離子丟失醚鍵后得到基峰m/z269，這些碎片離子(如圖2B)與文獻(xiàn)研究結(jié)果一致[28-29]。

2.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

通常在MPT質(zhì)譜儀工作中，載氣流量、維持氣流量及微波功率均會對離子信號強(qiáng)度有較大的影響。為了利用m/z285的信號作定量測量，需研究檢測m/z285的最佳條件。圖3A顯示了載氣流量與信號強(qiáng)度的關(guān)系，載氣流量在200～400 mL/min范圍內(nèi)與信號強(qiáng)度呈正相關(guān)，當(dāng)超過400 mL/min時，信號逐漸減弱，這可能是由于氣體流速過大而導(dǎo)致等離子體焰炬不穩(wěn)定所致，因此選擇最佳載氣流量為400 mL/min。如圖3B所示，維持氣的最優(yōu)條件為600 mL/min。本實(shí)驗(yàn)嘗試調(diào)節(jié)微波功率源來控制等離子體焰炬能量的大小，從而得到樣品最佳的離子化焰炬。結(jié)果顯示，微波能量在30～50 W范圍內(nèi)時，等離子體焰炬使樣品離子化的效果逐漸上升，當(dāng)微波能量大于50 W時，微波等離子體炬的焰炬能量過高，使得AFB1在高溫等離子的作用下碎裂程度更加劇烈，難以得到m/z285的質(zhì)譜信號。實(shí)驗(yàn)選擇最佳微波功率為50 W。

2.4 大米中AFB1的快速M(fèi)PT-質(zhì)譜法檢測

MPT對大米萃取液進(jìn)行表面燒蝕，可以看到特征離子峰m/z313豐度較低(如圖4A)。為了排除假陽性信號，需對大米萃取液的指紋譜中m/z313離子峰進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜研究。選取母離子為m/z313，獲得二級質(zhì)譜(如圖4B)。在串聯(lián)質(zhì)譜中可以看出，通過母離子(m/z313)進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離產(chǎn)生的碎片離子(m/z285，m/z269)與標(biāo)準(zhǔn)品黃曲霉毒素B1的碎片離子吻合，可以確認(rèn)該大米已發(fā)生霉變。該方法操作簡單，每種大米的檢測可在0.5～1 min內(nèi)完成。因此，這種微波等離子體炬質(zhì)譜檢測方法快速、靈敏、準(zhǔn)確，且MPT質(zhì)譜儀成本低、操作簡易，適于發(fā)展成為現(xiàn)場分析儀器，用于食品質(zhì)量方面的實(shí)時在線監(jiān)控。

在優(yōu)化條件下利用串聯(lián)質(zhì)譜信號m/z285，可對大米中黃曲霉毒素B1的含量做定量分析。在大米萃取液中通過標(biāo)準(zhǔn)加入法，配成一系列濃度梯度的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液，每種濃度測10次，繪制出黃曲霉毒素B1的工作曲線。結(jié)果顯示，黃曲霉毒素B1的線性范圍為0.5～20 μg/L，相關(guān)系數(shù)為0.999 4。根據(jù) LOD=3σc/S(σ為標(biāo)準(zhǔn)偏差，c為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，S為相應(yīng)信號強(qiáng)度的平均值)可計(jì)算出此方法的檢出限為0.12 μg/kg。對每個實(shí)驗(yàn)點(diǎn)10次重復(fù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)獲得的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為7.1%～12.5%。對實(shí)際大米樣品作實(shí)測分析，用所得數(shù)據(jù)由AFB1的工作曲線計(jì)算得到樣品中AFB1的含量。結(jié)果如表1所示，實(shí)際樣品的加標(biāo)回收率為95.8%～107.2%，10次測量的RSD為2.2%～10.1%，可見該檢測方法在半定量意義下結(jié)果可靠。

SampleOriginal(ng/L)Added(ng/L)Found(ng/L)RSD(%)Recovery(%)Huanghuastickyrice(黃花黏米)52485001003524958LongnanCountryrice(龍南大米)5376500106781011060Liuherice(柳河大米)5012500942538940Thaitoosesameoilstickyrice(泰太香油黏米)-5005026451005HuangyangKongmy(皇陽貢米)586050011221221072

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2.5 主成分分析

為了更清晰地區(qū)分大米是否霉變，采用Matlab軟件中“Princomp”函數(shù)對霉變前后大米的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析，圖5表明霉變前密封的大米(正常大米)與霉變后的大米(霉變大米)可以較好地區(qū)分開。在大米霉變前后的三維PCA得分圖(圖5A)中，PC1，PC2和PC3的貢獻(xiàn)率分別為62.5%，20.9%和5.4%，三者總和88.8%，該結(jié)果進(jìn)一步說明，久置霉變大米的化學(xué)成分與正常大米存在較大差異。根據(jù)PCA相應(yīng)的載荷圖(圖5B)可以看出，對三維PCA得分圖貢獻(xiàn)較大的m/z范圍在250～320之間。而且在PC1方向上區(qū)分較好，其貢獻(xiàn)較大的質(zhì)譜信號為m/z269和285。同時，在PC2和PC3的載荷分布圖(圖5B)也清晰地顯示特征峰m/z269，257，298和313等對區(qū)分霉變前后大米的貢獻(xiàn)較大，說明這些物質(zhì)在霉變前后大米中的含量存在較大差異。研究表明，MPT-MS可在分子水平上快速區(qū)分大米質(zhì)量的好壞，同時為糧油、動植物等食品的質(zhì)量分析提供了一種快速分析的途徑。

3 結(jié) 論

本文建立了無需樣品預(yù)處理或是少量樣品預(yù)處理的條件下，可直接檢測大米樣品中黃曲霉毒素B1含量的分析方法。以MPT作為線性離子阱質(zhì)譜儀的離子源，通過用MPT表面燒蝕的進(jìn)樣方式，結(jié)合PCA分析，能在痕量水平檢測大米中黃曲霉毒素B1的總含量，并快速區(qū)分大米是否霉變；這種新型等離子體質(zhì)譜(MPT-LTQ-MS)的整體設(shè)備搭建簡單，檢測速度快，靈敏度高，有望發(fā)展成為一種便攜式分析儀，在食品質(zhì)量監(jiān)控方面具有一定的應(yīng)用潛力。

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Direct Analysis of Aflatoxin B1 in Rice by Microwave Plasma Torch Mass Spectrometry

JIANG Tao1，LI Yun1，ZHAO Xiao-jing1，XIAO Sai-jin1，YANG Shui-ping1，ZHU Zhi-qiang2*

(1.Jiangxi Key Laboratory for Mass Spectrometry and Instrumentation，East China Institute of Technology，Nanchang 330013，China；2.School of Chemistry and Chemical Engineering，Shangrao Normal University，Shangrao 334001,China)

A novel and simple mass spectrometric method based on microwave plasma torch(MPT) was developed for the rapid detection of aflatoxin B1(AFB1) in rice without sample pretreatment.The MPT mass spectra of AFB1 were obtained,and the quantitative analysis mainly was based on the characteristic fragments of AFB1(m/z285).The results showed that there was a good linear relationship in the concentration range of 0.5-20 μg/L with correlation coefficient(r2) of 0.999 4，and the evaluated limit of detection(LOD) was 0.12 μg/kg.The direct detection of AFB1 in some kinds of rice were conducted，with recoveries of 95.8%-107.2% and relative standard deviations(RSD，n=9) of 2.2%-10.1%.With the help of principle component analysis(PCA)，the moldy rice and normal rice could be rapidly distinguished.With the advantages of rapidness and high sensitivity，the MPT-MS is a powerful tool for the high-throughput detection of moldy rice,and also shows a great potential in the monitoring of cereal and oil，animal，plant food，etc.

microwave plasma torch(MPT)；mass spectrometry；aflatoxin B1(AFB1)；rice

2016-03-09；

2016-06-23

國家科技部項(xiàng)目國家重大儀器專項(xiàng)(2011YQ14015009)；國家自然科學(xué)基金(21565003)；江西省科技支撐項(xiàng)目(2014BBG70091)；東華理工大學(xué)2011質(zhì)譜科學(xué)與儀器協(xié)同創(chuàng)新中心及東華理工大學(xué)朱志強(qiáng)博士科研啟動基金

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.12.010

O657.6；S852.44

A

1004-4957(2016)12-1575-06

*通訊作者：朱志強(qiáng)，博士，副教授，研究方向：質(zhì)譜分析，Tel：0791-83896370，E-mail:zhiqiangz@iccas.ac.cn